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Biology

गैप junctional परीक्षा के लिए एक कार्यात्मक परख; ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड पर पक्षपाती कोशिकाओं के electroporation

Published: October 18, 2014 doi: 10.3791/51710
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

Introduction

एक सेल करने के लिए बिजली के वर्तमान के आवेदन एक प्रक्रिया करार दिया electroporation द्वारा, कोशिका झिल्ली पर pores के गठन का कारण बनता है. pores झिल्ली के माध्यम से nonpermeant अणुओं की एक किस्म के पारित होने की अनुमति. बिजली क्षेत्र का गठन pores बहुत छोटे हैं और सेलुलर फिजियोलॉजी के लिए कम से कम अशांति के साथ तेजी से reclose ताकि ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है. दिलचस्प है, पक्षपाती कोशिकाओं निलंबन में electroporated होने के लिए अलग किया जा रहा बिना, वे विकास जहां सतह पर है कि प्रवाहकीय और पारदर्शी ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) के साथ लेपित और बगल में electroporated एक गिलास स्लाइड पर उगाया जा सकता है. कोशिकाओं को इस सतह पर बहुत अच्छी तरह से विकसित कर सकते हैं, और वे संलग्न और बढ़ा रहे हैं, के रूप में विस्तृत सूक्ष्म अवलोकन संभव है. इस तकनीक का उपयोग करना, छोटे nonpermeant अणुओं तुरन्त शुरू की है और कंप्यूटर अनुप्रयोग की सक्रियता पर अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त इस तकनीक बनाता है जो कोशिकाओं का अनिवार्य रूप से 100%, में किया जा सकता है(1 में समीक्षा) एक रिसेप्टर के ligand उत्तेजना के बाद एक मार्ग का onents.

Electroporation डीएनए का परिचय (भी बुलाया electrotransfection) के लिए ज्यादातर इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, बगल में electroporation प्रतिलेखन कारक बंधन, या siRNA 3,5 को बाधित करने के लिए इस तरह के antisense शाही सेना, डबल असहाय डीएनए फंदा oligonucleotides जैसे पेप्टाइड्स 2-4, oligonucleotides के रूप में अणुओं की एक बड़ी विविधता की शुरूआत के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, 6, रेडियोधर्मी न्यूक्लियोटाइड 7-10, प्रोटीन 11 12 या समर्थक दवाओं 13. Electroporation के बाद, कोशिकाओं जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए lysed या तय की और एंटीबॉडी के साथ दाग जा सकता है.

कोशिकाओं प्रवाहकीय कोटिंग की बढ़त के पार हो जाना रूप में सेल के विकास, दो सतहों की ऊंचाई में अंतर से परेशान नहीं है कि इतना प्रवाहकीय इतो कोटिंग, 800-1,000Å बहुत पतली है. यह लाभ है कि गैर electrop प्रदान करता हैorated कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए, electroporated लोगों के साथ कंधे से कंधा मिलाकर उगाया जा सकता है. वीडियो में वर्णित के रूप में एक ही दृष्टिकोण, अंतर junctional, कहनेवाला संचार (GJIC) की परीक्षा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

गैप जंक्शनों आसन्न कोशिकाओं 14 के अंदरूनी हिस्सों को जोड़ने के चैनल हैं. ऐसे एसआरसी के रूप ओंकोजीन GJIC 15,16 दबाने जबकि गैप junctional, कहनेवाला संचार, ट्यूमर गठन और मेटास्टेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. लूसिफ़ेर पीला (भंडारण) अक्सर microinjection के माध्यम से संवर्धित कोशिकाओं में पेश या परिमार्जन लोड हो रहा है 17 और पड़ोसी कोशिकाओं में डाई के प्रसार microscopically प्रतिदीप्ति रोशनी के तहत मनाया जाता है जैसे GJIC एक फ्लोरोसेंट रंजक की जांच करने के लिए. इन तकनीकों में हालांकि सदा ही सेल नुकसान होता है. अब हम कोशिकाओं आंशिक आईटीओ 18 के साथ लेपित है जो एक गिलास स्लाइड पर बड़े हो रहे हैं, जहां एक तकनीक का वर्णन. एक इलेक्ट्रिक पल्स भंडारण (या अन्य रंगों) की उपस्थिति में सीए लागू किया गया थाआसन्न, गैर electroporated कोशिकाओं को डाई प्रवास microscopically प्रतिदीप्ति रोशनी के माध्यम से मनाया गया, जबकि स्लाइड की प्रवाहकीय ओर से बढ़ कोशिकाओं में अपनी पैठ का उपयोग. Monolayer से अलग करने के लिए करते हैं हो सकता है कि परेशान संवेदनशील कोशिकाओं से बचने के लिए एक इलेक्ट्रोड की आवश्यकता नहीं है कि डिजाइन किया गया था एक विधानसभा विद्युत धारा 19 लागू करने के लिए कोशिकाओं के शीर्ष पर रखा जाएगा. सीरम उत्तेजना 12 निम्नलिखित G1 चरण की लंबाई पर असर के अभाव से संकेत के रूप में यह दृष्टिकोण FOS के स्तर में वृद्धि, सेलुलर चयापचय को किसी भी detectable अशांति के बिना, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में GJIC quantitate करने की क्षमता प्रदान करता है protooncogene प्रोटीन (Raptis, अप्रकाशित) या सेलुलर तनाव, p38 सूअर या JNK / SAPK काइनेज 1 के साथ जुड़े दो kinases. ओंकोजीन अभिव्यक्ति, परिवर्तन और जी जे के स्तरों के बीच कड़ी की परीक्षा संभव बनाया यह दृष्टिकोणआईसी 18, साथ ही फेफड़ों के ट्यूमर नमूनों 20-23 से हौसले संवर्धित कोशिकाओं सहित सेल प्रकार की एक किस्म, में GJIC पर एसआरसी और Stat3 का प्रभाव. इसके अलावा, सब्सट्रेट करने के लिए सेलुलर लगाव है कि मंच 19,24 में कम है, हालांकि सफलतापूर्वक adipocytic भेदभाव पर खाई जंक्शन बंद होने के प्रदर्शन के लिए नियोजित किया गया है एक शीर्ष इलेक्ट्रोड का अभाव है जो वर्णित सेटअप के साथ सीटू electroporation में.

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Protocol

1 Electroporation मंडलों में कोशिकाओं चढ़ाना

  1. एक लामिना का प्रवाह हुड में, हमेशा की तरह बाँझ तकनीक का उपयोग कोशिकाओं trypsinize.
    नोट: यह वे कांच पर कोशिकाओं के प्रसार में बाधा हो सकती है, क्योंकि, centrifugation द्वारा adherens और अंतराल जंक्शनों की इसलिए गठन trypsin के सभी निशान को खत्म करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.
  2. पिपेट 1 एक 37 ओ सी में सीटू electroporator में (चित्रा 1), और जगह, सीओ 2 इनक्यूबेटर के साथ प्रदान की बाँझ electroporation कक्षों में सेल निलंबन के मिलीलीटर.
    नोट: सेल आसंजन फ़ाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन, पाली lysine या सेल और ऊतक चिपकने वाला (सामग्री तालिका देखें) पर चढ़ाना द्वारा सुधार किया जा सकता है.
  3. कोशिकाओं को एक मिला हुआ परत का गठन किया है जब वे GJIC परीक्षा के लिए तैयार हैं.

2 Electroporation प्रक्रिया

GJIC परीक्षा के लिए electroporation, एक लामिना का प्रवाह हुड के बाहर आयोजित किया जा सकता हैयह लेता है के बाद से केवल कुछ ही मिनट. अब ऊष्मायन बार एक विशिष्ट प्रयोग के लिए आवश्यक हैं, तो यह एक लामिना का प्रवाह हुड में पूरी तरह से किया जा सकता है. सभी मामलों में, कोशिकाओं बड़े हो रहे हैं, जहां कक्षों बाँझ होना चाहिए.

  1. एक 5 मिलीग्राम / एमएल लूसिफ़ेर पीला समाधान तैयार: 2 मिलीलीटर कैल्शियम मुक्त मध्यम विकास में (electroporator के साथ प्रदान की) 10 मिलीग्राम भंडारण पाउडर भंग. 4 ओ सी पर समाधान और दुकान फिल्टर बाँझ, अब ऊष्मायन बार की आवश्यकता है कि प्रयोगों के लिए
  2. मध्यम विकास Aspirate और monolayer खरोंच या कोशिकाओं सुखाने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है, कैल्शियम मुक्त मध्यम के साथ कोशिकाओं को धो लें. कोशिकाओं सूख रहे हैं वे आमतौर पर गहरा नाभिक है और electroporation बिना भंडारण उठा. प्रभाव अधिक हवा ड्राफ्ट (चित्रा 4F) के संपर्क में है जो स्लाइड के बीच में अधिक स्पष्ट है.
  3. एक Eppendorf pipettor के साथ, चैम्बर, बी के किनारे पर, कोशिकाओं (पूरे चैम्बर के लिए 400 μl) के लिए डाई समाधान पिपेटसावधान eing सेल परत को छूने के लिए नहीं.
  4. Electroporator के साथ आपूर्ति धारक में चैम्बर प्लेस और उचित ताकत (चर्चा देखने के लिए) की एक नाड़ी लागू होते हैं.
  5. ध्यान से भंडारण समाधान के कुछ aspirate. यह कम महत्वपूर्ण प्रयोगों के लिए एक दूसरी बार पुन: उपयोग किया जा सकता है.
  6. 10% dialysed सीरम युक्त कैल्शियम मुक्त DMEM जोड़ें.
  7. अंतराल जंक्शनों के माध्यम से डाई हस्तांतरण की अनुमति के लिए इनक्यूबेटर में 3-5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
    नोट: इस बिंदु पर dialysed सीरम का समावेश ताकना बंद करने में मदद करता है.
  8. लाइव सेल अवलोकन के लिए कैल्शियम मुक्त DMEM के साथ अनिगमित डाई धो लें. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं में अच्छी तरह से करने के लिए 4% formaldehyde के अलावा के माध्यम से, इस स्तर पर तय किया जा सकता है, तो पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) के साथ धोया. सभी मामलों में धोने के सभी पृष्ठभूमि को दूर करना होगा.
    नोट: प्रारंभिक प्रयोगों वोल्टेज बहुत कम है, इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने में, तो यह कोशिकाओं incubato में ठीक हो जाने के लिए संभव हैकुछ मिनट के लिए अनुसंधान और स्लाइड की लागत में बचाने के लिए, एक ही स्लाइड दूसरी बार electroporate.

3 सूक्ष्म परीक्षण

  1. इस्तेमाल किया जा रहा डाई के लिए उपयुक्त फिल्टर से लैस एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, प्रतिदीप्ति रोशनी के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें. पीले लूसिफ़ेर के लिए, उत्तेजना 423nm, उत्सर्जन 555nm, एक Nikon IX70 माइक्रोस्कोप के लिए WBV फिल्टर है.
  2. चरण विपरीत तहत सेल आकारिकी की जांच करने के लिए, तरल के साथ शीर्ष पर भरने के बाद, अच्छी तरह से प्लास्टिक के शीर्ष पर एक गिलास को कवर पर्ची रखकर meniscus प्रभाव को समाप्त. बेहतर चित्रों के लिए, अच्छी तरह से स्लाइड से अलग किया जा सकता है, और coverslip फ्रेम पर रखा. जीवित कोशिकाओं के लिए यह वृद्धि मध्यम से भरा होना चाहिए, जबकि तय कोशिकाओं के लिए, अच्छी तरह से, सूक्ष्म अवलोकन के लिए ग्लिसरॉल के साथ भरा जा सकता है.
    नोट: कोशिकाओं डाई (ऊपर कदम 2.7) का स्थानांतरण निम्नलिखित formaldehyde के साथ तय कर रहे हैं अगर धुलाई और photographing आसान है. कोशिकाओं रहे हैं, तो कोईटी प्रतिदीप्ति तय कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति कई घंटे के लिए बनाए रखा है शुरू की है, जबकि भंडारण की सेल प्रकार, वोल्टेज और राशि के आधार पर लगभग 60 मिनट के भीतर कोशिकाओं से सफाया कर दिया है, ठीक किया. हालांकि, प्रतिदीप्ति fades या भी तय कोशिकाओं में, हे / एन ऊष्मायन के बाद dissipates. इस कारण, फोटो electroporation (चित्रा 2) के बाद जल्द ही लिया जाना चाहिए.

कहनेवाला संचार के 4 Quantitation

  1. प्रतिदीप्ति और चरण विपरीत (चित्रा 3) के तहत एक 20x उद्देश्य के साथ कोशिकाओं तस्वीर.
  2. गैर electroporated क्षेत्र (चित्रा 2, तीर, electroporation धार) के साथ सीमा पर electroporated कोशिकाओं की पहचान और एक स्टार के साथ निशान.
  3. डाई अंतराल जंक्शनों के माध्यम से स्थानांतरित किया गया है, जहां गैर electroporated ओर, पर fluorescing कोशिकाओं की पहचान और एक बिंदु के साथ निशान (आंकड़े 3 ए और 3 बी).
  4. की कुल संख्या फूट डालोधार (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के साथ electroporated कोशिकाओं की संख्या से गैर electroporated क्षेत्र पर कोशिकाओं fluorescing.
    नोट: कम से कम 200 सन्निहित electroporated सीमा कोशिकाओं से स्थानांतरण एक प्रयोग के लिए गणना की है. प्राप्त संख्या GJIC मूल्य है.

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Representative Results

चित्रा 2 निर्धारण और वाशिंग निम्नलिखित प्रतिदीप्ति (पैनल ए और बी) के तहत भंडारण के साथ electroporated और फोटो खिंचवाने चूहा जिगर उपकला T51B कोशिकाओं 22,, या चरण विपरीत (सी) रोशनी को दिखाती है. पैनल में, electroporated क्षेत्र के किनारे लाल रंग में चिह्नित है. लाल रेखा के अधिकार के लिए प्रतिदीप्ति की ढाल अंतराल जंक्शनों के माध्यम से स्थानांतरण अर्थ. डाई स्थानांतरित किया था जहां कोशिकाओं एक बिंदु के साथ चिह्नित किया गया है, जबकि electroporated क्षेत्र के किनारे पर कोशिकाओं को एक स्टार के साथ पहचान की है और चिह्नित किया गया: चित्रा 3 ए और 3 बी में, अंतराल junctional संचार के quantitation दिखाया गया है. अनुपात डाई electroporated सीमा सेल प्रति, में स्थानांतरित किया कि कोशिकाओं की औसत संख्या से पता चलता है. इस उदाहरण में यानी 57 डॉट्स और 10 सितारे, GJIC = 5.7 रहे हैं.

सी और डी, ट्रांसक्रिप्शन -3 के सिग्नल ट्रांन्सड्यूसर और उत्प्रेरक (Stat3) में T51B कोशिकाओं टी में downregulated किया गया हैस्थानांतरण 22 की अनुपस्थिति के रूप में दिखाया hrough स्थिर siRNA एक lentiviral वेक्टर के साथ अभिव्यक्ति, और यह GJIC में कमी का कारण बनता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 Electroporation इलेक्ट्रोड और स्लाइड विधानसभा. (ए) शीर्ष दृश्य: प्रकोष्ठों प्रवाहकीय और पारदर्शी ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) के साथ लेपित, एक गिलास स्लाइड पर हो रहे हैं. एक प्लास्टिक चैम्बर कोशिकाओं और भंडारण के लिए एक कंटेनर के लिए फार्म, स्लाइड पर बंधुआ है. कोटिंग लेजर etched अनिवार्य रूप से दो इलेक्ट्रोड बनाने, बीच में एक सीधी रेखा में है. एक बांध इस प्रकार बिजली के क्षेत्र तीव्रता में तेजी से संक्रमण बनाने, वर्तमान ऊपर की तरफ हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है. गैर प्रवाहकीय क्षेत्रों प्रदान करने के लिए, आईटीओ भी दो आयतों में etched है. पल्स जनरेटर से वर्तमान (लाल तीर) एक प्रत्यक्ष में फैल आयतों के बीच एक प्रवाहकीय राजमार्ग के माध्यम से, दूसरे के लिए प्रत्येक संपर्क बिंदु से बहतीक्षेत्रों बांध के समानांतर में आयन कोशिकाओं electroporating, तो दूसरी तरफ माध्यम से बांध के ऊपर, बीच बाधा के समानांतर. . स्पष्टता के लिए, चैंबर के सामने भाग (बी) के साइड दृश्य हटा दिया जाता है: आईटीओ लेपित (हल्का हरा) और etched, नंगे कांच क्षेत्रों पर बढ़ कोशिकाओं के साथ स्लाइड दिखाए जाते हैं. (-), और इस क्षेत्र में बढ़ कोशिकाओं का गठन किया है एलवाई युक्त electroporation मध्यम तो बांध की ऊंचाई इलेक्ट्रोड के बीच एक बिजली के पथ (+) और ऊपर एक स्तर पर चैम्बर के लिए जोड़ा जाता है. अपने वास्तविक मोटाई (800 ए) कोशिकाओं की मोटाई की तुलना में बहुत कम है, हालांकि आईटीओ परत स्पष्टता के लिए अतिरंजित मोटाई के साथ दिखाया गया है कि ध्यान दें. (सी) electroporated और गैर electroporated कोशिकाओं के क्षेत्र बढ़े दिखाया गया है. एकाग्रता कई अंतराल जंक्शन transf के माध्यम से कमजोर के रूप में डाई सभी कोशिकाओं electroporated और electroporated बढ़त के पार fades गया जहां बांध के पास घने हैनेताओं. बड़े तीर अंतराल जंक्शनों के माध्यम से डाई हस्तांतरण की दिशा. कोशिकाओं के आकार और मोटाई स्पष्टता के लिए अतिरंजित कर रहे हैं कि ध्यान दें. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
T51B चित्रा 2 Electroporation, चूहे जिगर उपकला कोशिकाओं. भंडारण T51B चूहा जिगर उपकला कोशिकाओं (हल्के, 12 वोल्ट) में electroporated था. एक 5 मिनट के बाद. ऊष्मायन, कोशिकाओं प्रतिदीप्ति (ए, बी) या चरण विपरीत (सी) रोशनी के तहत फोटो खींच रहे थे. Electroporated क्षेत्र (तीर, एक में लाल रेखा) के किनारे से विस्तार प्रतिदीप्ति की ढाल से दिखाया अंतराल जंक्शनों के माध्यम से व्यापक स्थानांतरण, ध्यान दें. एक ही समय में, कोशिकाओं को कोई दिखाई क्षति, एक है चरण विपरीत (सी) के तहत देखा है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
खाई जंक्शन हस्तांतरण की चित्रा 3 Quantitation. electroporation (गैर electroporated कोशिकाओं को भंडारण के दाताओं) द्वारा भंडारण उठाया कि electroporated क्षेत्र के किनारे पर कोशिकाओं को एक स्टार के साथ चिह्नित किया गया. भंडारण के माध्यम से अंतराल जंक्शनों में स्थानांतरित जहां कोशिकाओं एक बिंदु के साथ चिह्नित किया गया. (ए) और (बी) में, यानी 57 डॉट्स और 10 सितारे, GJIC = 5.7 रहे हैं. प्रतिदीप्ति की एक ढाल के अभाव के रूप में दिखाया (सी) और (डी) में सेल, अंतराल जंक्शनों नहीं है. तीर electroporated क्षेत्र की बढ़त को इंगित. बार = 100 माइक्रोन.तों / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
हेरफेर के दौरान scraping द्वारा क्षतिग्रस्त किया गया है कि चित्रा 4 (ए) T51B कोशिकाओं. इन कोशिकाओं को भी electroporation के बिना भंडारण उठा सकते हैं और अंतराल जंक्शनों के माध्यम से अपने पड़ोसियों को हस्तांतरण कर सकते हैं. (बी) और भी मजबूत है कि एक नाड़ी द्वारा क्षतिग्रस्त (सी) कोशिकाओं. (बी) T51B चूहा जिगर उपकला कोशिकाओं हल्के सेटिंग पर electroporated गया , 20 वोल्ट. etched लाइन (तीर) की बाईं तरफ कोशिकाओं electroporation से क्षतिग्रस्त हो गया है. इस मामले में कोशिकाओं चरण विपरीत तस्वीर (मध्यम पैनल, सफेद तीर) में हालांकि एक करीब से देखो, अलग नहीं था कि वे बहुत कमजोर प्रतिदीप्ति, जबकि अंधेरे नाभिक है की कोशिकाओं से पता चलता है सभी (शीर्ष पैनल) पर है. हालांकि, वें हस्तांतरणकिसी न किसी अंतराल जंक्शनों electroporated नहीं कर रहे हैं कि सही पक्ष पर कोशिकाओं के लिए, स्पष्ट है. नीचे तस्वीर electroporation की बढ़त के देखने की सुविधा के लिए, यूवी और चरण विपरीत रोशनी के संयोजन के द्वारा बनाया गया था. मध्यम सेटिंग, 30 वोल्ट पर electroporated (सी) T51B चूहा जिगर उपकला कोशिकाओं. etched लाइन की बाईं तरफ कोशिकाओं गंभीर रूप से नाड़ी से क्षतिग्रस्त हो गया है. कोशिकाओं उतर आया है और प्रतिदीप्ति नहीं कैसे ध्यान दें. किनारे के आसपास कुछ बचे भंडारण उठाया और अंतराल जंक्शनों के माध्यम से सही करने के लिए अपने पड़ोसियों के लिए इसे पारित करने के लिए प्रकट किया है. 10μg / एमएल propidium आयोडाइड के साथ electroporated (डी) T51B कोशिकाओं. . नाभिक की तीव्र धुंधला नोट उपकला कोशिकाओं (ई) गुंबदों. T51B कोशिकाओं हल्के सेटिंग, 15 वोल्ट पर electroporated. बाएँ पर कोशिकाओं के भी electroporation नोट. मिला हुआ हालांकि, जब T51B कोशिकाओं हेरफेर और धोने के दौरान बंद आ सकता है कि गुंबदों फार्म, और आसपास की कोशिकाओं को टा हो सकता हैभंडारण ऊपर KE. व्यापक डाई हस्तांतरण नोट. Electroporation.The मध्यम विकास के बिना भंडारण उठा सकते हैं सूख गए हैं कि (एफ) प्रकोष्ठों T51B कोशिकाओं और कोशिकाओं से हटा दिया गया था 30 मिनट के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में छोड़ दिया गया. भंडारण बाद में 1 मिनट के लिए कोशिकाओं को जोड़ा गया है और कोशिकाओं बाद में तय धोया और प्रतिदीप्ति (शीर्ष पैनल) या चरण विपरीत (नीचे पैनल) रोशनी के तहत फोटो खींच रहे थे. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5 Grb2-SH2 अवरुद्ध पेप्टाइड बरकरार, जीवित कोशिकाओं में EGF की मध्यस्थता Erk सक्रियण रोकता. GJIC और संकेत पारगमन पढ़ाई का संयोजन. बाध्यकारी ligand के बाद, ऐसी एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर आरईसी के रूप में वृद्धि कारक रिसेप्टर्स की एक संख्याeptor (EGFR) विशिष्ट tyrosine अवशेषों पर पार phosphorylated हैं. ये ऐसे इस प्रकार झिल्ली के लिए लाया और रास सक्रिय हो जाता है जो जीटीपी / सकल घरेलू उत्पाद विनिमय कारक मुसीबत का इशारा करने के लिए बाध्य है जो Grb2, के रूप में संकेत transducers के एसआरसी-अनुरूपता -2 डोमेन के लिए डॉकिंग साइटों का गठन. यह एक पी ते पी वाई अनुक्रम में आरएएफ / Mek / Erk झरना और Erk के फास्फारिलीकरण की सक्रियता का परिणाम है. इसलिए, विशिष्ट phospho-Erk एंटीबॉडी के साथ जांच कर रही EGF रिसेप्टर की सक्रियता का एक उपाय हो सकता है. निर्धारण के बाद, कोशिकाओं को एक भूरे रंग 29 देता है जो एक बायोटिन युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, streptavidin-घोड़ों के मूली peroxidase और diaminobenzidine सब्सट्रेट, द्वारा पीछा किया, एक विरोधी पर्क एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग) के साथ जांच कर रहे हैं. इस प्रयोग में, Grb2-SH2 डोमेन (PVPE पी वाई INQS) अवरुद्ध एक phosphopeptide सीटू electroporation में से पेश किया गया था मैंelectroporation कक्षों और में बढ़ Nto एनआईएच 3T3 कोशिकाओं खर्च माध्यम में विकास को गिरफ्तार कर लिया. 5 मिनट पल्स आवेदन के बाद, कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए EGF के साथ प्रेरित तय, brightfield (ऊपर) या चरण विपरीत (नीचे) रोशनी के तहत फोटो खिंचवाने इसी क्षेत्र से immunoperoxidase stainingand कोशिकाओं से सक्रिय phospho-Erk1 / 2 के लिए जांच कर रहे थे. , यानी, Grb2-SH2 अवरुद्ध पेप्टाइड नाटकीय रूप से EGF संकेत कम ध्यान दें कि Erk फास्फारिलीकरण (क्षेत्र एक). संकेत के निषेध के कारण अंतराल जंक्शनों के माध्यम से 1123 दा पेप्टाइड के आंदोलन को गैर electroporated क्षेत्र (squiggly ब्रैकेट) में आसन्न कोशिकाओं के 3-4 ~ में पंक्तियों की संभावना फैली हुई है. यह निष्कर्ष इस क्षेत्र में कोशिकाओं को किसी भी मौजूदा प्राप्त करते हैं, लेकिन अपने पड़ोसियों से पेप्टाइड का अधिग्रहण नहीं किया था के बाद से मनाया निषेध, बल्कि electroporation की एक विरूपण साक्ष्य से, कारण पेप्टाइड को होना चाहिए कि सम्मोहक सबूत का गठन किया. एक ही समय में, सेल आकारिकी पर कोई detectable प्रभाव के रूप में हैचरण विपरीत द्वारा दिखाया गया. Electroporated क्षेत्र की बढ़त को अंक तीर. बढ़ाई: 240x. अधिक जानकारी और नियंत्रण संदर्भ 29 देखें. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम

Electroporated सामग्री
electroporated जा करने के लिए सामग्री की शुद्धता बहुत महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं बहुत फ्लैट हैं, ट्रैकिंग डाई की तो उच्च सांद्रता (20 मिलीग्राम भंडारण के लिए / मिलीलीटर तक) और इस तरह के मामलों में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, पवित्रता और भी अधिक महत्वपूर्ण एक अधिक गोलाकार आकृति 1 के साथ कोशिकाओं में से है. भंडारण के अलावा अन्य रंगों या nonpermeant अणुओं की एक विशाल विविधता ऐसे अलग connexins 25 से मिलकर चैनलों के लिए जांच के रूप में उपयोग करने के लिए एलेक्सा रंगों की एक श्रृंखला के रूप में, नियोजित किया गया है. नाभिक डाई हस्तांतरण और अधिक कठिन (चित्रा 4D) के quantitation बनाता है, जो बहुत ही मजबूती से प्रतिदीप्ति इतना है कि हालांकि, इस तरह ethidium ब्रोमाइड या Propidium आयोडाइड के रूप में रंगों डीएनए में intercalated रहे हैं. ट्रैकिंग रंजक एक कैल्शियम बाढ़ junctional संचार में व्यवधान डाला, साथ ही सेल कम हो सकता है क्योंकि, तैयार और washes कैल्शियम मुक्त मध्यम विकास में आयोजित किया जाना चाहिएएल व्यवहार्यता. सभी समाधान पूर्व ताकना बंद करने और व्यवहार्यता 1 की सुविधा जो electroporation, 37 ओ सी में रखा जाना चाहिए.

इष्टतम वोल्टेज और समाई का निर्धारण
विद्युत क्षेत्र शक्ति सेल पारगमन, साथ ही व्यवहार्यता के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. कई दालों के आवेदन एक भी नाड़ी से पारगमन और सेल व्यवहार्यता के मामले में बेहतर परिणाम की पेशकश करने के लिए दिखाया गया है. हल्का (10 दालों के अलावा 10 μs, दालों के बीच 0.1 सेकंड), मध्यम (20 दालों के अलावा 80 μs, 0.2 दालों के बीच सेकंड) और मजबूत (50 दालों: सेल परियोजनाओं की Insitu Porator तंत्र समाई और नाड़ी संख्या के लिए तीन सेटिंग है , 120 μs अलावा दालों के बीच, 0.5 सेकंड), वोल्ट सूक्ष्मता) स्वतंत्र रूप से (2-45V नियंत्रित किया जा सकता है. वास्तव में, फ्लैट कोशिकाओं बुनियाद को एक छोटे आसंजन क्षेत्र के साथ एक पेड़ों का झुरमुट या कोशिकाओं में कम तब्दील लोगों की तुलना में voltages, कोशिकाओं की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, कीट Sf9 कोशिकाओं), संभवतः एक बड़ा प्रवाहकीय क्षेत्र के साथ संपर्क में है कि एक विस्तारित सेल के माध्यम से वर्तमान गुजर की बड़ी मात्रा के लिए. इस विषय पर अधिक जानकारी के लिए, 1 देखें.

संभावित समस्याओं और निवारण

कोशिकाओं जोड़तोड़ के दौरान scraped किया गया है, वे डाई लेने और electroporation (चित्रा -4 ए) के बिना प्रतिदीप्ति सकता है. कोशिकाओं को दिया ऊर्जा की मात्रा electroporation की दक्षता को प्रभावित करता है. नाड़ी भी कमजोर है (यानी, बहुत कम वोल्टेज और पल्स सेटिंग), तो कोशिकाओं चरण विपरीत तहत सामान्य दिखाई लेकिन वे शायद मृत हो सकता है या हेरफेर के दौरान scraped किया गया है कि कुछ कोशिकाओं के अलावा, प्रतिदीप्ति नहीं है (चित्रा -4 ए) . पल्स चरण विपरीत कोशिकाओं के तहत, बहुत मजबूत है, तो बहुत ही गहरे नाभिक (चित्रा 4 बी) दिखाई देते हैं, लेकिन कुछ भंडारण बनाए रखने, और यहां तक कि पड़ोसी कोशिकाओं को कुछ डाई हस्तांतरण की अनुमति दे सकता. पूर्व संध्या परn उच्च दालों कोशिकाओं (चित्रा 4C) नष्ट कर रहे हैं. इस तरह की कोशिकाओं lysed रहे हैं, इसलिए वे भंडारण बनाए रखने नहीं है और अगर सब पर, बहुत कमजोर प्रतिदीप्ति. इस तरह के माध्यम के परिवर्तन के दौरान बंद आ सकता है जो T51B फार्म गुंबद संरचनाओं के रूप में कुछ उपकला कोशिका लाइनों. डाई अंतराल जंक्शनों (चित्रा 4E) के माध्यम से स्थानांतरित किया जा सकता है के रूप में कोशिकाओं के आसपास तो प्रतिदीप्ति सकता है. प्रतिनिधि लाइनों के लिए इष्टतम electroporation शर्तों के उदाहरण तालिका 1 में दिखाया गया है.

अन्य तकनीकों और महत्व से अधिक लाभ

डीएनए परिचय
जैसे कैल्शियम फॉस्फेट सह वर्षा 26 या liposomes के विभिन्न प्रकार के रूप में अभिकर्मक प्रोटोकॉल की एक बड़ी संख्या है. हालांकि, वे विशेष रूप से संकेत पारगमन के अध्ययन के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है कि सूक्ष्म तरीके में सेल प्रभावित कर सकता है. उदाहरण के लिए, संकेत ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेख के उत्प्रेरक के Tyr-705 फास्फारिलीकरणइसके ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के साथ संबद्ध है जो आयन -3 (Stat3) नाटकीय रूप से भी डीएनए के अभाव में कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक की प्रक्रिया की वृद्धि हुई है. इस वजह से वेग कोशिका आसंजन और cadherin सगाई, एक ज्ञात Stat3 उत्प्रेरक 27 को सेल बदल तथ्य यह है कि हो सकता है. Electroporation या रेट्रोवायरल संक्रमण Stat3 स्तर 6 को प्रभावित नहीं किया है, जबकि कुछ liposomes, एक समान है लेकिन कम स्पष्ट प्रभाव था.

पेप्टाइड्स की शुरूआत
एक आम तरीका एचआईवी जैसे जीन से निकाली गई जैसे कोशिका झिल्ली को पार कि दृश्यों के साथ एक संलयन पेप्टाइड का निर्माण है. हालांकि, झिल्ली के माध्यम से स्थानांतरण एक अपेक्षाकृत धीमी प्रक्रिया है और संकेत निषेध के रूप में कुशल नहीं है. एक ligand द्वारा निम्नलिखित रिसेप्टर सक्रियण होने वाली घटनाओं के अनुक्रम के अध्ययन के लिए, एक पेप्टाइड की तुरंत शुरूआत के लिए क्षमता, peptidomimetic या अन्य यौगिक एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हैई. FITC मिलकर पेप्टाइड (Raptis, अप्रकाशित) के साथ पता चला lipophilic पेप्टाइड, कोशिका झिल्ली में एम्बेडेड है क्योंकि उसके तेज में तेजी लाने के लिए एक सेल पारगम्य पेप्टाइड के electroporation, संभव होने की संभावना नहीं है. यह (एक ही पेप्टाइड की electroporation संकेत 29 की एक पूरी निषेध हासिल की, जबकि उदाहरण के लिए Grb2-SH2 डोमेन अवरुद्ध एक सेल पारगम्य पेप्टाइड के उपयोग के माध्यम से EGF द्वारा Erk सक्रियण के निषेध, 28 केवल आंशिक था कि दिलचस्प है ध्यान दें चित्रा 5). Liposomes पर आधारित अन्य तकनीक, अस्तित्व में भी कर रहे हैं. हालांकि, वे सामग्री (चित्रा 5, squiggly ब्रैकेट पेश किया जा रहा करने के लिए संकेत अवरोध के कारण होना चाहिए कि मजबूत संभव प्रदर्शन की पेशकश कर सकते हैं, जो खाई जंक्शन अध्ययन के साथ संयोजन के रूप में, इलाज लोगों के साथ कंधे से अनुपचारित कोशिकाओं की ओर से परीक्षा की अनुमति नहीं देते , सी).

गैप जंक्शन पढ़ाई
Microinjectionरंगों या परिमार्जन लोडिंग की सामान्यतः कार्यरत हैं, लेकिन वे हमेशा सेलुलर क्षति को पेश कर रहे हैं. Photobleaching के बाद एक और तकनीक, प्रतिदीप्ति वसूली आक्रामक नहीं है, लेकिन यह महंगा उपकरणों की आवश्यकता है, और phototoxic पदार्थों के गठन के एक मुद्दा हो सकता है, जबकि कुछ कोशिकाओं, एक समय पर जांच की जा सकती. पैराशूट परख डाई calcein AM (हरा) के साथ पहले से लोड हो रहा है कोशिकाओं के होते हैं, तो अंतराल जंक्शनों 15 मिनट -3 घंटे के भीतर फार्म के रूप में कोशिकाओं, एक सेल परत पर पालन दे. कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में इस तरह से इलाज किया जा सकता है, लेकिन इस परख में अंतराल जंक्शनों के लिए फार्म कोशिकाओं की क्षमता सेल प्रकार 30 से काफी भिन्न होता है.

सीमाएं

आवश्यक वोल्टेज बड़ा आकार और विद्युत शुल्क के अणुओं की शुरूआत के लिए अधिक है. बड़े plasmids के परिचय के लिए आवश्यक उच्च voltages पर, कुछ कोशिका मृत्यु हो सकती है. अलग अणुओं के लिए आवश्यक रिश्तेदार voltagesपहले से 9,12 वर्णित किया गया है. हम एक विशिष्ट electroporation तंत्र का उपयोग कर electroporation का वर्णन है, यह किसी को 19 में विस्तृत विवरण का उपयोग कर इसे बनाने, या कोशिकाओं के ऊपर एक शीर्ष इलेक्ट्रोड के साथ एक सरल सेटअप करना, और एसिड 1 के साथ खोदना बिजली के उपकरणों के साथ अनुभव के लिए संभव है.

भविष्य के निर्देश

सॉफ्टवेयर ठीक GJIC 31 यों विकसित किया गया है. एक और सुधार अनिगमित डाई धोने के लिए कोई जरूरत नहीं है, ताकि वे सेल में हैं केवल एक बार प्रतिदीप्ति कि क्वांटम डॉट्स का विकास है. प्रक्रिया वास्तविक समय में रहते हैं, नहीं तय की कोशिकाओं में मनाया जा सकता है, जबकि धोने के तनाव से बचा जाता है. संकेत दे रास्ते को बाधित करने के पेप्टाइड्स की शुरूआत शुद्ध घटकों का उपयोग पहचान बातचीत की प्रासंगिकता के vivo मूल्यांकन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. बर्तन की परीक्षाएक विशिष्ट मार्ग को बाधित करने के लिए विभिन्न पेप्टाइड्स की ential रसौली का तर्कसंगत उपचार के लिए peptidomimetic दवाओं के विकास में पहला महत्वपूर्ण कदम है.

अन्य टिप्पणियां

स्लाइड्स में अच्छी तरह से आईटीओ की सतह तक पहुंचने के लिए एक छोटा सा तूलिका का उपयोग Extran-1000 समाधान के साथ धोया, और पानी के साथ rinsed जा सकता है. कोशिकाओं स्लाइड पर तय किया गया है, तो यह पहले trypsin या अन्य एंजाइमों के साथ प्रोटीन के निशान को दूर करने के लिए आवश्यक हो सकता है. सोडियम dodecyl सल्फेट युक्त डिटर्जेंट से बचा जाना चाहिए. धोया स्लाइड्स पेरोक्साइड गैस के साथ निष्फल किया जा सकता है. हालांकि, यह धारक में किसी भी भंडारण समाधान लीक यह एक शॉर्ट सर्किट के कारण हो सकता है क्योंकि अगर स्लाइड पर अच्छी तरह से सील तोड़ने से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Cellgro http://www.cellgro.com/ 50-013-PB
DMEM without Calcium Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) SH30319-01
Donor Calf Serum  PAA: http://www.paa.com/ Cat.# B15-008
Fetal Bovine Serum PAA: http://www.paa.com/ Cat.# A15-751
Electroporation apparatus Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ ACE-100
Chambers Cell Projects Ltd UK ACE-04-CC 4-wells
Chambers Cell Projects Ltd UK ACE-08-CC 8-wells
Lucifer Yellow Cell Projects Ltd UK ACE-25-LY High purity
CelTak BD Biosciences 354240 Cell and tissue adhesive
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Collagen BD Biosciences 354236
Poly-Lysine Sigma Aldrich P8920

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 92 electroporation ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड संकेत पारगमन अंतर junctional संचार पेप्टाइड्स Stat3
गैप junctional परीक्षा के लिए एक कार्यात्मक परख; ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड पर पक्षपाती कोशिकाओं के electroporation
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Geletu, M., Guy, S., Firth, K., Raptis, L. A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide. J. Vis. Exp. (92), e51710, doi:10.3791/51710 (2014).

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