Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Функциональный анализ для Gap Junctional экспертизы; Электропорация прилипшие клетки на индий-оксид олова

Published: October 18, 2014 doi: 10.3791/51710
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

Introduction

Применение электрического тока в клетку приводит к образованию пор на клеточной мембране, с помощью процесса, называют электропорации. Поры обеспечивают прохождение различных nonpermeant молекул через мембрану. Электрическое поле может управляться точно, так что поры, образованные очень малы и быстро повторного, с минимальным нарушением к клеточной физиологии. Интересно, прилипшие клетки могут быть выращены на предметное стекло, покрытой проводящим и прозрачной оксида индия-олова (ITO) и электропорации на месте, то есть на поверхности, где они растут, не будучи оторванными быть электропорации в суспензии. Клетки могут расти очень хорошо на этой поверхности, и как они связаны и расширен, детальное микроскопическое наблюдение можно. При использовании этого метода, небольшие nonpermeant молекулы могут быть введены мгновенно и в по существу 100% клеток, что делает этот метод особенно подходит для исследований по активации компonents из тропе следующие лиганда стимуляции рецепторов (обзор 1).

Электропорация был использован в основном для введения ДНК (также называется electrotransfection). Тем не менее, электропорацию на месте может быть полезным для введения большого разнообразия молекул, таких как пептиды 2-4, олигонуклеотидов, таких как антисмысловой РНК, двухцепочечных олигонуклеотидов ДНК-ловушек для ингибирования связывания фактора транскрипции, и миРНК 3,5, 6, радиоактивные нуклеотиды 7-10, белки 11 12 или пролекарства 13. После электропорации клетки можно лизировать для биохимических анализов или фиксировали и окрашивали антителами.

Проводящий ITO покрытия является очень тонким, 800-1,000Å, таким образом, что рост клеток не нарушается по разнице в высоте двух поверхностей, как клетки растут по краю проводящего покрытия. Это дает то преимущество, что не-electropораторствовал клетки могут быть выращены бок о бок с электропорации те, в качестве контрольной группы. Тот же самый подход может быть использован для изучения зазора соединительного, межклеточных взаимодействий (GJIC), как описано в видео.

Щелевые контакты каналы, соединяющие интерьеры соседних ячеек 14. Зазор узловой, межклеточной коммуникации играет важную роль в формировании опухоли и метастаз, а онкогены, такие как Src подавить GJIC 15,16. Чтобы исследовать GJIC флуоресцентный краситель, такой как Lucifer желтый (LY) часто вводят в культивируемые клетки с помощью микроинъекции или царапать-нагрузку 17 и диффузии красителя в соседних ячеек под микроскопом наблюдали под флуоресцентным освещением. Эти методы, однако, неизменно вызывают повреждения клеток. Опишем технику, где клетки, выращенные на предметное стекло, которое частично покрытой ITO 18. Электрический импульс был применен в присутствии LY (или других красителей) чаиспользуя ее проникновение в клетки, растущие на проводящей части слайда, в то время как миграция красителя с соседними, не-электропорации клеток под микроскопом наблюдается через флуоресценции освещения. Чтобы не беспокоить чувствительные клетки, которые могут иметь тенденцию отделить от монослоя, сборка была разработана, что не требует электрод должны быть размещены в верхней части клеток для применения электрического тока 19. Этот подход дает возможность количественного GJIC в большом количестве клеток, без обнаруживаемого помех на клеточный метаболизм, как показано отсутствие эффекта от длины фазе G1 следующей сыворотки стимуляции 12, увеличение уровней ФОС протоонкоген белок (Raptis, не опубликовано) или две киназы, связанные с клеточным стрессом, р38 свиней или JNK / SAPK киназы 1. Такой подход сделал возможным изучение связи между уровнем экспрессии онкогенов, преобразования и ГДжИК 18, а также эффект Src и Stat3 на GJIC в различных типах клеток, в том числе клеток, культивированных из свежих опухолей легких образцов 20-23. Кроме того, на месте электропорации на установке, описанной в котором отсутствует верхний электрод успешно применяется для демонстрации закрытия щелевых контактов по adipocytic дифференциации, хотя сотовой крепления к подложке снижается на этом этапе 19,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Покрытие ячеек в электропорации палат

  1. В ламинарном потока, Trypsinize клетки с использованием стерильной техники, как обычно.
    Примечание: Очень важно, чтобы устранить путем центрифугирования все следы трипсина, так как они могут помешать распространению клеток на стекле, следовательно, образование слипчивых и щелевых контактов.
  2. Внесите 1 мл клеточной суспензии в стерильных камерах электропорации, поставляемых с на месте электропоратора (рисунок 1), и место в 37 ° С, CO 2 инкубаторе.
    Примечание: адгезию клеток может быть улучшена путем высева на фибронектин, коллаген, поли-лизин или клеточной и тканевой клей (см материалы таблицу).
  3. Когда клетки сформировали сливающийся слой они готовы к GJIC экспертизы.

2 Электропорация Порядок

Электропорация для экспертизы GJIC может проводиться вне ламинарном потока,так как это занимает всего несколько минут. Если более длинные периоды инкубации требуется для конкретного эксперимента, то она может быть проведена полностью в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Во всех случаях, камеры, где выращивают клетки должны быть стерильными.

  1. Подготовьте 5 мг / мл Люцифера желтый раствор: растворить 10 мг LY порошок (поставляется с электропоратора) в 2 мл кальция среде без роста. Для экспериментов, что требует большего времени инкубации, фильтр-стерилизовать решение и хранят при 4 ° С.
  2. Аспирируйте питательную среду и промыть клетки с бескальциевой среды, стараясь не поцарапать монослой или высушить клетки. Если клетки сушат они обычно имеют более темные ядра и забрать LY без электропорации. Эффект более выражен в середине слайда, который подвергается воздействию более потоков воздуха (4F) Рис.
  3. С пипетки Eppendorf, пипетки раствора красителя к клеткам (400 мкл для всей камере), на краю камеры, бEing осторожны, чтобы не коснуться слой клеток.
  4. Поместите камеру в держателе, поставляемой с электропоратора и применить импульс соответствующей величины (см Обсуждение).
  5. Тщательно аспирата некоторые решения LY. Она может быть использована во второй раз менее важных экспериментов.
  6. Добавить бескальциевой DMEM, содержащей 10% диализу сыворотку.
  7. Инкубируйте клетки в течение 3-5 мин в инкубаторе, чтобы обеспечить передачу краску через щелевые контакты.
    Примечание: Включение диализованного сыворотки в этой точке помогает закрытие пор.
  8. Вымойте неинкорпорированную краситель с бескальциевой DMEM для живого наблюдения клеток. С другой стороны, клетки могут быть закреплены на этой стадии, путем добавления 4% формальдегидом в скважине, а затем промывали PBS (фосфатно-солевой буфер). Во всех случаях стиральная должны удалить все фон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В предварительные эксперименты, чтобы определить оптимальные условия, если напряжение слишком низкое, то можно позволить клетки восстановить в incubatoг в течение нескольких минут и электропорации одном слайде во второй раз, чтобы сохранить в стоимость горок.

3 Микроскопическое исследование

  1. Соблюдайте клетки под флуоресцентным освещением, использованием инвертированного микроскопа, оснащенный соответствующим фильтром для красителя используется. Для Люцифера желтого, возбуждение 423nm, 555nm выбросов, WBV фильтр для микроскопом Nikon IX70.
  2. Ликвидировать последствия мениска путем размещения стеклянной крышкой скольжения в верхней части пластика также, после заполнения его к вершине с жидкостью, чтобы изучить клеток морфологию под фазового контраста. Для улучшения изображений, также может быть отделен от ползуна, и покровное размещены на раме. При фиксированных клеток, также могут быть заполнены с глицерином для микроскопического наблюдения, в то время как для живых клеток она должна быть заполнена средой роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стиральная и фотосъемка легче, если клетки фиксировали с формальдегидом после перевода красителя (шаг 2.7 выше). Если клетки нетT фиксировано, флуоресценции выводится из клеток в течение примерно 60 мин в зависимости от типа клеток, напряжения и количества обычно выводят в то время как в основной клеток флуоресценции сохраняется в течение нескольких часов. Однако, флуоресценция исчезает или рассеивается после O / N инкубации, даже в фиксированных клетках. По этой причине, фотографии должны быть приняты вскоре после электропорации (рисунок 2).

4 Количественное определение межклеточной коммуникации

  1. Сфотографировать клетки с 20-кратным цели под флуоресценции и фазового контраста (рисунок 3).
  2. Определите и отметьте со звездой электропорации клетки на границе с не-электропорации области (рис 2, стрелки, электропорации край).
  3. Определите и отметьте с точки флуоресцирующих клеток на не-электропорации стороны, где краситель передал через щелевые контакты (3А и 3В).
  4. Разделить общее количествофлуоресцирующих клеток на не-электропорации области по количеству электропорации клеток по краю (3А и 3В).
    Примечание: Передача по меньшей мере, 200 смежных электропорации клеток пограничных рассчитывается для каждого эксперимента. Полученное число является значением GJIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 2 показан печени крыс эпителиальных T51B клетки 22, электропорации с LY и сфотографированных под флуоресценции (панели А и Б), или фазоконтрастной (C) освещение, следующие фиксации и промывки. В панели А, край электропорации области отмечены красным цветом. Градиент флуоресценции справа от красной линии обозначает передачу через щелевые контакты. На рисунке 3А и 3В, количественный анализ разрыв соединительного связи показано: Клетки на краю электропорации области были выявлены и отмечены звездочкой, а клетки, где краситель был переданные с точки были отмечены. Отношение показывает среднее число клеток, что краситель, переданных в, за электропорации клетки границы. В этом примере есть 57 точек и 10 звезд, т.е. GJIC = 5,7.

В С и D, на сигнал датчика и активатором транскрипции-3 (Stat3) была подавлена ​​в T51B клеток тhrough стабильной экспрессии siРНК, с вектором лентивирусов, и это приводит к снижению GJIC, как показано на absense передачи 22.

Рисунок 1
Рис.1 Электропорация электрод и монтаж слайд. (A) Вид сверху: Клетки выращивают на предметное стекло, покрывают проводящим и прозрачной оксида индия-олова (ITO). Пластиковая камера соединена на слайде, чтобы образовать контейнер для клеток и LY. Покрытие лазером по прямой линии в середине, по существу, образуя два электрода. Плотина используется, чтобы отвлечь текущие вверх, создавая тем самым резкий переход в напряженности электрического поля. Для обеспечения непроводящих областей, ITO также запечатлелись в двух прямоугольников. Текущие (красные стрелки) от генератора импульсов проходит от каждой контактной точки до другой, с помощью проводящего трассе между прямоугольников, распространяется в прямойионный параллельно средней барьер, а затем через плотину через среду с другой стороны, электропорации клетки в области параллельных плотины. Для ясности, передняя часть камеры удаляется (B) Вид сбоку.: Слайд с клеток, растущих на ITO покрытием (светло-зеленый) и травления, голыми стеклянных регионах показаны. При электропорации среду, содержащую LY добавляется в камере до уровня выше высоты плотины затем электрический путь между электродами (+) и (-), и клетки, растущие в этой области, формируется. Обратите внимание, что слой ITO показан преувеличенно толщины для ясности, хотя его фактическая толщина (800) намного меньше, чем толщина клеток. (С) области электропорации и не являющихся электропорации клеток показан в увеличенном. Краситель плотно возле плотины, где все клетки электропорации и исчезает через электропорации края как концентрация ослабевает через множественное щелевых контактов TransfERS. Большие стрелки показывают направление передачи красителя через щелевые контакты. Обратите внимание, что размер и толщина клеток преувеличены для наглядности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2 Электропорация T51B, печени крысы эпителиальные клетки. LY электропорировали в T51B печени крыс эпителиальных клеток (мягкая, 12 вольт). После 5 мин. инкубации клетки были сфотографированы под флуоресценции (А, В) или фазового контраста (С) освещения. Обратите внимание на обширную трансфер через щелевые контакты, показанный градиентом флуоресценции, проходящий от края электропорации области (стрелки, красная линия в А). В то же время, нет видимых повреждений клеток, ы видели под фазе контраста (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 Количественное передачи щелевых контактов. Клетки на краю электропорации области, что взял LY путем электропорации (доноров LY в не-электропорации клеток) были отмечены звездочкой. Клетки, где LY переданные в счет щелевых были отмечены точками. В (А) и (В), есть 57 точек и 10 звезд, т.е. GJIC = 5,7. Клетки в (С) и (D) не имеют щелевые контакты, как показано на отсутствие градиента флуоресценции. Стрелки указывают на краю электропорации области. Бар = 100 мкм.эс / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Фигура 4 (А) T51B клетки, которые были повреждены, очищая при манипуляции. Эти клетки могут подобрать LY даже без электропорации и может передать его на своих соседей с помощью щелевых контактов. (В) и (С) Клетки, поврежденные импульса, который является слишком сильным. (B) T51B печени крысы эпителиальные клетки подвергали электропорации в легкой установки , 20 вольт. Клетки на левой протравленной линии (стрелки) были повреждены в результате электропорации. В этом случае клетки не оторвать, однако внимательный взгляд на фазового контраста фотографии (средняя панель, белая стрелка) показывает клетки имеют темные ядра, в то время как они светятся очень слабо, если вообще (верхней панели). Однако передавать йгрубые щелевых очевидно, к клеткам с правой стороны, которые не электропорации. Нижняя фотография была сделана путем объединения УФ и фазового контраста освещения, чтобы облегчить просмотр краю электропорации. Эпителиальные (C) T51B печени крыс клетки электропорации в средние настройки, 30 вольт. Клетки на слева от протравленную линии были серьезно повреждены импульсом. Обратите внимание, как клетки оторвались и не светиться. Некоторые выжившие вокруг края подобрали LY и, кажется, передачей его на своих соседей справа через щелевые контакты. (D) T51B клетки электропорации с 10 мкг / мл йодистого пропидия. Обратите внимание на интенсивное окрашивание ядер. (Е) Купола эпителиальных клеток. T51B клетки электропорации в легкой обстановке, 15 Вольт. Обратите внимание на еще электропорации клеток в левой. Однако, когда конфлюэнтны, T51B клетки образуют купола, что могут отклеиться во время манипуляции и промывки, и окружающие клетки могут таке до LY. Обратите внимание на широкую перенос красителя. (F) Клетки, которые высушенные может подобрать LY без electroporation.The ростовой среды был удален из T51B клеток и клеток были оставлены в вытяжном шкафу с ламинарным потоком в течение 30 мин. LY Затем добавляли к клеткам в течение 1 мин и клетки последующей фиксации, промывают и сфотографироваться под флуоресценции (верхняя панель) или поэтапного отличие (нижняя панель) освещения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5 Grb2-SH2 блокирование пептид ингибирует EGF-опосредованной Эрк активацию в неповрежденных, живых клеток. Сочетание GJIC и передачи сигнала исследований. После связывания лиганда, количество рецепторов факторов роста, таких как эпидермальный фактор роста Receptor (EGFR) находятся в транс-фосфорилируется по конкретным остаткам тирозина. Они составляют сайты стыковки для Src-гомологии-2 областей сигнальных датчиков, таких как Grb2, который связан с SOS Курсы фактора GTP / ВВП, который, таким образом доведены до мембраны и активирует Ras. Это приводит к активации каскада Raf / MEK / Erk и фосфорилирования Erk в последовательности Р ТЕ Р Y. Таким образом, зондирования конкретных фосфо-Erk антител могут служить мерой активации рецептора EGF. После фиксации, клетки исследовали с помощью анти-Perk антителом (Cell Signalling), за которым следует биотин-сочетании вторичного антитела, стрептавидин-Лошадь-Raddish пероксидазы и диаминобензидином подложки, что дает коричневый цвет 29. В этом эксперименте, фосфопептид блокирования домена Grb2-SH2 (PVPE р Y INQS) был введен в месте электропорации яNto NIH 3T3, растущие в электропорации камер и роста арестован в истощенной средой. 5 мин после нанесения импульса, клетки стимулировали EGF в течение 5 мин, фиксированный, зондируют в течение активированного фосфо-ERK1 / 2 от иммунопероксидазных stainingand клеток из той же области, сфотографированного в светлого (вверху) или фазового контраста (внизу) освещения. Обратите внимание, что блокирование пептид Grb2-SH2 резко сократилось сигнал EGF, т.е. Эрк фосфорилирования (площадь). Ингибирование сигнала продолжается в ~ 3-4 ряда соседних клеток в не-электропорации области (волнистые кронштейн), вероятно, связано с движением 1123 Da пептида через щелевые контакты. Эта находка является убедительные доказательства, что наблюдаемый торможение должно быть связано с пептида, а не артефакт электропорации, так как клетки в этой области не получали ток, но приобрела пептида из своих соседей. В то же время, нет заметного воздействия на морфологию клеток,показано с помощью фазового контраста. Стрелка указывает на краю электропорации области. Увеличение: 240x. Для получения дополнительной информации и управления см ссылку 29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги в протоколе

Электропорации материал
Чистота материала, подлежащего электропорации является очень важным. Если клетки очень плоским, то более высокие концентрации красителя для отслеживания должны быть использованы (до 20 мг / мл в течение ют) и в таких случаях, чистота еще более важное значение, чем в клетках с более сферической формы 1. Кроме того, LY были использованы большое разнообразие других красителей или nonpermeant молекул, таких как серии Alexa красителей для использования в качестве зондов для каналов, состоящих из различных коннексинов 25. Тем не менее, красители, такие как бромистый этидий или пропидийиодидом которые интеркалированного в ДНК так, что ядра очень сильно флуоресцируют, что делает количественный анализ переноса краски более трудным (Рисунок 4D). В слежения красители должны быть готовы и моет проводится в бескальциевой среде роста, потому что приток кальция может прервать Junctional коммуникации, а также снизить CELл жизнеспособность. Все растворы должны храниться при температуре 37 о С до электропорации, что облегчает закрытие пор и 1 жизнеспособности.

Определение оптимального напряжения и емкости
Напряженности электрического поля является критическим параметром для проникновения клеток, а также жизнеспособности. Применение нескольких импульсов было показано, что предлагают лучшие результаты с точки зрения проникновения и жизнеспособности клеток, чем один импульс. Insitu PORATOR аппарат Сотовые проектов имеет три настройки для емкости и числа импульсов: Мягкий (10 импульсов, 10 мкс Apart, 0,1 сек между импульсами), средний (20 импульсов, 80 мкс Apart, 0,2 сек между импульсами) и сильный (50 импульсов , 120 мкс друг от друга, 0,5 сек между импульсами), в то время как напряжение может быть точно управляется независимо (2-45V). На самом деле, плоские клетки требуют более низких напряжениях, чем трансформированных те, клеток в группе или клеток с малой площадью адгезии к субстрату (например, насекомое клетки Sf9), Возможно, вследствие больших количеств тока, проходящего через длительного клетки, которая находится в контакте с большей проводящей области. Для получения более подробной информации по этому вопросу смотрите 1.

Потенциальные проблемы и методы их устранения

Если клетки были Царапины во время манипуляций, они могут подобрать краску и светиться без электропорации (рисунок 4А). Количество энергии, поставляемой с клетками влияет на эффективность электропорации. Если пульс слишком слабо (т.е. слишком низкое напряжение и параметры импульсов), затем клетки выглядят нормально в условиях фазового контраста, но они не светятся, за исключением, возможно для некоторых клеток, которые могут быть мертвы или были Царапины во время манипуляции (4А) . Если пульс слишком сильным, под контрастных клеток фазовых кажется, есть очень темные ядра (Рисунок 4В), но может сохранить некоторую LY, и даже разрешить передачу некоторое красителя в соседние клетки. В канунн высшие импульсы клетки разрушаются (Рисунок 4C). Такие клетки лизируют, следовательно, они не сохраняют LY и флуоресцируют очень слабо, если вообще. Некоторые эпителиальные клеточные линии, такие как T51B форма купола структур, которые могут возникнуть во время от средних изменений. Окружающие клетки могут затем светиться как краситель может быть передано через щелевые контакты (Рисунок 4E). Примеры оптимальных условий электропорации для репрезентативных линий приведены в таблице 1.

Преимущества по сравнению с другими методами и значимости

Введение ДНК
Существует большое количество протоколов трансфекции, таких как кальций-фосфатных соосаждения 26 или различных видов липосом. Тем не менее, они могут повлиять на ячейку в тонкие способы, которые могут быть очень важно, особенно для передачи сигнала исследований. Например, Tyr-705 фосфорилирование сигнала датчика и активатора транскриптаионно-3 (Stat3), который коррелирует с его транскрипционной активности резко возрастает в соответствии с процедурой кальций-фосфатных трансфекции даже в отсутствие ДНК. Это может быть связано с тем, что осадок изменяет ячейку в клеточной адгезии и кадгерина взаимодействия, известного активатора Stat3 27. Некоторые липосомы был подобный, но менее выраженный эффект, в то время как электропорации или ретровирусную инфекцию не повлиять на уровень Stat3 6.

Введение пептидов
Общий метод состоит в построении слитого пептида с последовательностями, которые пересекают клеточные мембраны, такие как производные от ВИЧ-Tat гена. Однако передача через мембрану является относительно медленным процессом и ингибирование сигнала не столь эффективным. Для изучения последовательности событий, происходящих после активации рецептора с лигандом, способность для мгновенного введения пептида, пептидомиметик или другое соединение, предлагает важную advantagэ. Электропорация мобильному проницаемым пептида ускорения его поглощение невозможно, скорее всего, потому, что липофильный пептид встраивается в клеточную мембрану, как выяснилось с FITC-связанных пептидов (Raptis, не опубликовано). Интересно отметить, что ингибирование активации Erk ЭФР за счет использования клеточной проницаемой пептида, блокирующего домен Grb2-SH2 Например, было только частичное 28, в то время как электропорация одного и того же пептида достигнуто полное ингибирование сигнала 29 ( Рисунок 5). Другие методы, основанные на липосом также в существовании. Тем не менее, они не позволяют рассмотрение необработанных клетках бок о бок с обработанных единиц, в сочетании с щелевых исследований, которые могут предложить самым решительным образом демонстрацию, что ингибирование сигнал должен быть связано с материалом внедряются (Рисунок 5, искаженное кронштейн , с).

Щелевых исследования
Микроинъекциякрасителей или очистить загрузкой обычно используются, но они неизменно ввести повреждение клеток. Другая техника, восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания не инвазивными, но это требует дорогостоящего оборудования, и несколько клеток могут быть рассмотрены в то время, в то время как формирование фототоксических веществ может быть проблемой. Парашют анализ состоит из предварительного натяжения клеток с кальцеин краситель AM (зеленый), затем позволяя клетки придерживаться на мобильный слоя, как щелевые контакты образуют в течение 15 мин-3 часа. Большое количество клеток может быть обработан таким образом, но способность клеток образовывать щелевые контакты в этом анализе чрезвычайно зависит от типа клеток 30.

Ограничения

Требуемое напряжение выше для внедрения молекул большего размера и электрических зарядов. При высоких напряжений, необходимых для введения крупных плазмид, могут быть некоторые гибель клеток. Относительные напряжения, необходимые для различных молекулбыли описаны ранее 9,12. Хотя мы описываем электропорации с использованием конкретного устройства, электропорации, это возможно для кого опыт работы с электрическими приборами, чтобы сделать его с помощью подробное описание в 19, или сделать более простой установке с верхним электродом выше клеток, и травления с кислотами 1.

Будущие направления

Программное обеспечение было разработано для точного количественного GJIC 31. Дальнейшее усовершенствование является разработка квантовых точек, которые флуоресцируют только когда они находятся в клетке, так что нет необходимости промывать неинкорпорированную краситель. Это позволяет избежать стресса стирки, в то время как процесс можно наблюдать в прямом эфире, не фиксированных клеток в реальном времени. Введение пептидов прервать сигнальных путей является мощным подход для оценки в естественных условиях актуальности взаимодействия, определенных с использованием очищенных компонентов. Рассмотрение горшкаференциальное различных пептидов ингибировать конкретный путь является первым важным шагом в развитии пептидомиметических препаратов, для рационального лечения новообразований.

Другие комментарии

Слайды можно мыть Extran-1000 решения с помощью небольшой кисти, чтобы достигнуть поверхности ITO в скважине, и промывают водой. Если клетки были зафиксированы на слайде, это может быть необходимо, чтобы удалить следы белка трипсином или другими протеолитическими ферментами в первую очередь. Натрия додецилсульфат, содержащие моющие средства следует избегать. Промытые горки можно стерилизовать с перекисью газа. Тем не менее, это очень важно, чтобы избежать вскрыть скважины на слайд, потому что, если любые LY решение утечек в держатель может вызвать короткое замыкание.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Cellgro http://www.cellgro.com/ 50-013-PB
DMEM without Calcium Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) SH30319-01
Donor Calf Serum  PAA: http://www.paa.com/ Cat.# B15-008
Fetal Bovine Serum PAA: http://www.paa.com/ Cat.# A15-751
Electroporation apparatus Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ ACE-100
Chambers Cell Projects Ltd UK ACE-04-CC 4-wells
Chambers Cell Projects Ltd UK ACE-08-CC 8-wells
Lucifer Yellow Cell Projects Ltd UK ACE-25-LY High purity
CelTak BD Biosciences 354240 Cell and tissue adhesive
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Collagen BD Biosciences 354236
Poly-Lysine Sigma Aldrich P8920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
  2. Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
  3. Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
  4. Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
  5. Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
  6. Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
  7. Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
  8. Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
  9. Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
  10. Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
  11. Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
  12. Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
  13. Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
  14. Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  15. Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
  16. Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  17. Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
  18. Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
  19. Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
  20. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
  21. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
  22. Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
  23. Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
  24. Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
  25. Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
  26. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  27. Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
  28. Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
  29. Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
  30. Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
  31. Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
  32. Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
  33. Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
  34. Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  35. Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).

Tags

Молекулярная биология выпуск 92 электропорации оксид индия-олова передачи сигналов разрыв узловой связи пептиды Stat3
Функциональный анализ для Gap Junctional экспертизы; Электропорация прилипшие клетки на индий-оксид олова
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geletu, M., Guy, S., Firth, K.,… More

Geletu, M., Guy, S., Firth, K., Raptis, L. A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide. J. Vis. Exp. (92), e51710, doi:10.3791/51710 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter