Introduction
Appliceringen av elektrisk ström till en cell ger upphov till bildning av porer i cellmembranet genom en process som går under benämningen elektroporering. Porerna tillåta passage av en variation av nonpermeant molekyler genom membranet. Det elektriska fältet kan styras exakt, så att de porer som bildas är mycket små och återförsluta snabbt, med minimal störning till den cellulära fysiologin. Intressant nog kan adherenta celler odlas på ett objektglas belagt med ledande och transparent indium-tennoxid (ITO) och elektroporerades in situ, dvs på den yta där de växer, utan att vara fristående som ska elektroporeras i suspension. Celler kan växa mycket bra på denna yta, och eftersom de är fästa och utökas, kan detaljerade mikroskopisk observation. Med denna teknik kan små nonpermeant molekyler införas omedelbart och i huvudsak 100% av cellerna, vilket gör denna teknik speciellt lämplig för studier på aktiveringen Komponents av en väg efter ligand stimulering av en receptor (över 1).
Elektroporering har använts främst för införandet av DNA (även kallad electrotransfection). Emellertid kan elektroporering in situ vara värdefullt för införandet av en stor mängd olika molekyler, såsom peptider 2-4, oligonukleotider, såsom antisens-RNA, dubbelsträngade DNA-decoy-oligonukleotider att hämma transkriptionsfaktorbindnings eller siRNA 3,5, 6, radioaktiva nukleotider 7-10, proteiner 11 12 eller pro-läkemedel 13. Efter elektroporation kan cellerna lyseras för biokemiska analyser eller fixerades och färgades med antikroppar.
Den ledande ITO-beläggning är mycket tunn, 800-1,000Å, så att celltillväxt inte störs genom skillnaden i höjd för de två ytorna, eftersom cellerna växer över kanten av den ledande beläggningen. Detta ger fördelen att icke-electroporated celler kan odlas sida vid sida med electroporated ettor, för att tjäna som kontroller. Samma tillvägagångssätt kan användas för undersökning av kanalförbindelse, kommunikationen mellan (GJIC), som beskrivs i Video.
Kanalförbindelser är kanaler som förbinder det inre av angränsande celler 14. Kanalförbindelse spelar kommunikationen mellan en viktig roll i tumörbildning och metastas, medan onkogener såsom Src trycka GJIC 15,16. För att undersöka GJIC ett fluorescerande färgämne såsom Lucifer gul (LY) ofta införs i odlade celler genom mikroinjektion eller skrapa-lastning 17 och diffusion av färgämnet in i närliggande celler är mikroskopiskt observerades under fluorescensbelysning. Dessa tekniker dock alltid orsaka cellskador. Vi beskriver nu en teknik där celler odlas på en glasskiva som delvis är belagd med ITO 18. En elektrisk puls anbringades i närvaro av LY (eller andra färgämnen) camed hjälp av dess penetration in i celler som växer på den ledande delen av sliden, medan färgämnet migrering till de angränsande, icke-electroporated celler mikroskopiskt observeras genom fluorescensbelysning. För att undvika störande känsliga celler som kan tendera att lossna från monoskikt, till en samlingsdesignades som inte krävde en elektrod placeras ovanpå cellerna för att applicera elektrisk ström 19. Detta tillvägagångssätt ger möjlighet att kvantifiera GJIC i ett stort antal celler, utan någon påvisbar störning cellulär metabolism, vilket indikeras av frånvaron av en effekt på längden av G1 fasen efter serumstimulering 12, ökning av nivåerna av fos protoonkogenen protein (Raptis, opublicerad) eller två kinaser associerade med cellulär stress, p38 hog eller JNK / SAPK kinas 1. Detta tillvägagångssätt gjorde det möjligt att undersökningen av sambandet mellan nivåer av onkogen uttryck, transformation och GJIC 18, samt effekten av Src och Stat3 upon GJIC i en mängd olika celltyper, inklusive celler nyligen odlade från lungtumörprover 20-23. Dessutom in situ elektroporering med installationen som beskrivs som saknar en toppelektrod har framgångsrikt använts för demonstration av gapet korsningen stängning på adipocytic differentiering, även cellulär fastsättning på underlaget reduceras i det skedet 19,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Bordläggningen cellerna i Electroporation Chambers
- I en laminär flödesfläkt, trypsinize cellerna med steril teknik som vanligt.
OBS: Det är mycket viktigt att eliminera genom centrifugering alla spår av trypsin, eftersom de kan hindra spridning av cellerna på glaset, därav bildandet av Adherens och gap-junctions. - Pipett 1 ml av cellsuspensionen i sterila elektroporering kammare försedda med in situ elektroporator (Figur 1), och lägg i en 37 ° C, CO 2 inkubator.
OBSERVERA: Celladhesion kan förbättras genom utstrykning på fibronektin, kollagen, poly-lysin eller cell och vävnadslimmet (se Material tabell). - När cellerna har bildat ett sammanhängande lager de är redo för GJIC undersökning.
2. Elektroporation Förfarande
Elektroporation för GJIC undersökning kan genomföras utanför ett laminärt flöde huva,eftersom det tar bara några minuter. Om längre inkubationstider är avsedda för ett specifikt experiment, då den kan utföras helt och hållet i ett laminärt flöde huva. I samtliga fall måste kamrarna där cellerna odlas vara sterila.
- Förbered en 5 mg / ml Lucifer gul lösning: Lös 10 mg LY pulver (medföljer elektroporator) i 2 ml Calcium fritt odlingsmedium. För experiment som kräver längre inkubationstider, filter-sterilisera lösningen och förvara vid 4 ° C.
- Aspirera tillväxtmedium och tvätta cellerna med kalcium fritt medium, försiktigt så att inte repa monolager eller torka cellerna. Om cellerna torkas de har oftast mörkare kärnor och plocka upp LY utan elektroporering. Effekten är mer uttalad i mitten av bilden som är mer utsatta för luftdrag (Figur 4F).
- Med en Eppendorf pipett, pipett färglösningen till cellerna (400 | il för hela kammaren), vid kanten av kammaren, bEing noga med att inte röra vid cellager.
- Placera kammaren i hållaren medföljer elektroporator och applicera en puls av lämplig styrka (se Diskussion).
- Försiktigt aspirera några av LY-lösning. Det kan återanvändas för andra gången för mindre viktiga experiment.
- Lägg Kalcium-fri DMEM innehållande 10% dialyserat serum.
- Inkubera cellerna under 3-5 min i inkubatorn för att tillåta färgämnesöverföring genom gap junctions.
OBS: Införandet av dialyse serum vid denna tidpunkt hjälper porslutning. - Tvätta unincorporated färgämnet med kalcium-DMEM för levande cell observation. Alternativt kan cellerna fixeras i detta skede genom tillsats av 4% formaldehyd till brunnen, tvättades sedan med PBS (fosfatbuffrad saltlösning). I samtliga fall måste tvättn avlägsna all bakgrund.
OBS: I preliminära experiment för att bestämma de optimala förhållanden om spänningen är för låg, så är det möjligt att låta cellerna återhämta sig under incubator under några minuter och electroporate samma slide en andra gång, för att spara in kostnaden för diabilder.
3 Mikroskopisk undersökning
- Observera celler under fluorescensbelysning, med hjälp av ett inverterat mikroskop utrustat med lämpligt filter för färgämne som används. För Lucifer gul är excitation 423nm, emission 555nm, WBV filter för en Nikon IX70 mikroskop.
- Eliminera meniskeffekter genom att placera en glaskupa-slip ovanpå plasten väl, efter att ha fyllt det till toppen med vätska, för att undersöka cellmorfologin i fas kontrast. För bättre bilder, kan det väl tas bort från bilden, och täckglas placeras på ramen. För fixerade celler, kan brunnen fyllas med glycerol för mikroskopisk observation, medan för levande celler måste den fyllas med tillväxtmedium.
OBS: Tvätt och fotografering är lättare om cellerna fixeras med formaldehyd efter överföringen av färgämnet (steg 2.7 ovan). Om cellerna finns ingent fast, fluorescens elimineras från cellerna inom ca 60 min beroende på den celltyp, spänning och mängden av LY infördes samtidigt i fixerade celler fluorescens bibehålls under flera timmar. Dock bleknar fluorescens eller avleder efter O / N inkubation, även i fasta celler. Av denna anledning måste fotografier tas snart efter elektroporering (Figur 2).
4 Kvantifiering av kommunikationen mellan
- Fotografera cellerna med en 20x mål enligt fluorescens och faskontrast (Figur 3).
- Identifiera och markera med en stjärna electroporated celler vid gränsen till icke-elektroområdet (Figur 2, pilen, elektro kant).
- Identifiera och markera med en prick fluorescerande celler på den icke-electroporated sidan, där färgen har överförs genom gap junctions (Figur 3A och 3B).
- Dividera det totala antaletfluorescerande celler på icke-electroporated område med antal elektroporerade celler längs kanten (fig 3A och 3B).
OBS: Överföringen från minst 200 sammanhängande elektroporerade gränsceller beräknas för varje experiment. Det erhållna talet är det GJIC värde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar råttlever epiteliala T51B celler 22, elektroporerade med LY och fotograferade i fluorescens (panel A och B), eller fas-kontrast (C) belysning, efter fixering och tvättning. I panel A, är kanten av electroporated området markeras med rött. Gradienten av fluorescens till höger om den röda linjen markerar överföring via gap junctions. I figur 3A och 3B, är kvantifiering av kanalförbindelsekommunikation som visas: Cellerna vid kanten av electroporated området identifierades och markeras med en stjärna, medan celler där färgämnet hade överförts var märkta med en punkt. Förhållandet visar det genomsnittliga antalet celler som färgämnet överförs till, per elektrogränscell. I det här exemplet finns det 57 punkter och 10 stjärnor, dvs GJIC = 5,7.
I C och D, Signal Givare och aktivator av transkription-3 (Stat3) har nedregleras i T51B celler through stabil siRNA uttryck med en lentivirusvektor, och detta orsakar en minskning av GJIC, såsom visas genom frånvaro av överföring 22.
Figur 1 Elektroporation elektrod och skensatsen. (A) Uppifrån: Celler odlas på ett objektglas, belagt med ledande och transparent indium-tennoxid (ITO). En plastkammare binds upp på gejden, för att bilda en behållare för cellerna och LY. Beläggningen är laseretsade i en rak linje i mitten, i huvudsak bildar två elektroder. En fördämning används för att avleda de nuvarande uppåt, vilket skapar en skarp övergång i elektrisk fältintensitet. Att tillhandahålla icke-ledande områden är ITO också etsad i två rektanglar. Nuvarande (röda pilar) från pulsgeneratorn flödena från varje kontaktpunkt till den andra, via ett ledande motorvägen mellan rektanglarna, sprider sig i en direktion parallella med mittbarriär, sedan över dammen genom mediet till den andra sidan, electroporating cellerna i områden som är parallella med dammen. För tydlighets skull är den främre delen av kammaren bort (B) från sidan.: Glid med cellerna växer på ITO belagt (ljusgrön) och etsade, nakna glas regioner visas. När elektroporering medium innehållande LY sätts till kammaren till en nivå ovanför höjden av fördämningen sedan en elektrisk väg mellan elektroderna (+) och (-), och de celler som växer i detta område, bildas. Observera att ITO lagret visas med överdriven tjocklek för tydlighet även om dess verkliga tjockleken (800 A) är mycket mindre än tjockleken av cellerna. (C) Området elektroporerade och icke elektroporerade celler visas förstorad. Färgämnet är tät nära dammen där alla celler elektro och bleknar över electroporated kanten när koncentrationen försvagas genom flera gap junction transfers. Stora pilar visar riktningen för färgöverföring genom gap junctions. Observera att storleken och tjockleken av cellerna är överdrivna för tydlighets skull. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Elektroporation av T51B, råttleverepitelceller. LY var elektro in T51B råttlever epitelceller (mild, 12 volt). Efter en 5 min. inkubation, celler fotograferades i fluorescens (A, B) eller fas kontrast (C) belysning. Observera den omfattande överföringen genom gap junctions, som visas av lutning av fluorescens, som sträcker sig från kanten av electroporated området (pilar, röd linje i A). Samtidigt finns det ingen synlig skada på cellerna, en s ses under fas-kontrast (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Kvantifiering av gap junction överföring. Cellerna vid kanten av electroporated området som plockas upp LY genom elektroporering (givare av LY till de icke-elektro celler) var märkta med en stjärna. Celler där LY överförs till genom gap junctions markerades med en punkt. I (A) och (B), det finns 57 punkter och 10 stjärnor, dvs GJIC = 5,7. Celler i (C) och (D) behöver inte kanalförbindelser, såsom visas genom frånvaron av en gradient av fluorescens. Pilarna pekar på kanten av electroporated området. Bar = 100 pm.es / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 (A) T51B celler som har skadats genom skrapning under manipulation. Dessa celler kan hämta LY även utan elektroporering och kan överföra det till sina grannar genom gap junctions. (B) och (C) Celler som skadats av en puls som är för stark. (B) T51B råttlever epitelceller ades elektro vid mild inställning , 20 volt. Cellerna på den vänstra av den etsade raden (pil) har skadats genom elektroporering. I detta fall cellerna inte lossnar, men en närmare titt på den faskontrast fotografi (mittpanel, vit pil) visar att cellerna har mörka kärnor, medan de fluorescerar mycket svagt, om alls (övre panelen). Men överför thgrovt kanalforbindelser är uppenbar, till cellerna på den högra sidan som inte är electroporated. Botten fotografiet gjordes genom att kombinera UV och faskontrast belysning, för att underlätta visning av kanten av elektroporering. (C) T51B råttlever epitelceller elektroporerade på en medelhög nivå, 30 volt. Cellerna på vänster på etsade linjen har blivit allvarligt skadad av pulsen. Notera hur cellerna har lossnat och fluorescerar inte. Några överlevande runt kanten har plockat upp LY och verkar vidarebefordra den till sina grannar till höger via gap junctions. (D) T51B celler elektroporerade med 10 mikrogram / ml Propidiumjodid. Notera den intensiva färgning av kärnorna. (E) Kupoler av epitelceller. T51B celler elektroporerades vid mild inställning, 15 Volt. Notera även elektroporering av celler till vänster. När sammanflytande, T51B celler bildar kupoler som kan komma av under manipulation och tvättning, och de omgivande cellerna kan take upp LY. Notera den omfattande färgöverföring. (F) Celler som har torkat kan plocka upp LY utan electroporation.The tillväxtmedium avlägsnades från T51B celler och cellerna lämnades i ett laminärt flöde huva för 30 min. LY därefter till cellerna under 1 min och cellerna därefter fast, tvättas och fotograferades under fluorescens (övre panelen) eller fas-kontrast (nedre panelen) belysning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 Den Grb2-SH2 blockerande peptid hämmar EGF-medierad Erk aktivering i intakta, levande celler. Kombination av GJIC och signaltransduktion studier. Efter ligandbindning, ett antal tillväxtfaktorreceptorer, såsom epidermal tillväxtfaktor Receptor (EGFR) är trans fosforylerat på specifika tyrosinrester. Dessa utgör dockningsplatser för Src-homologi-2 domäner av signalomvandlare såsom Grb2, som är bunden till GTP / GDP utbytesfaktor sos, som därmed kommer till membranet och aktiverar Ras. Detta resulterar i aktivering av Raf / Mek / Erk kaskad och fosforylering av Erk vid ett P TE P Y-sekvens. Därför kan sondering med specifika Fosfor-Erk antikroppar vara ett mått på aktivering av EGF-receptorn. Efter fixering, celler sonderades med en anti-Perk antikropp (Cell Signaling), följt av en biotin-kopplad sekundär antikropp, streptavidin-Häst-raddish peroxidas och Diaminobenzidine substratet, vilket ger en brun färg 29. I detta experiment var en fosfopeptid blockerar Grb2-SH2-domänen (PVPE p Y INQS) infördes genom in situ elektroporering jagnto NIH 3T3-celler som växer i elektroporering kammare och tillväxt greps i använt medium. 5 min efter puls ansökan cellerna stimuleras med EGF i 5 min, fast, sonderade för aktiverade fosfor-ERK1 / 2 från immunoperoxidas stainingand celler från samma område fotograferades under bright (överst) eller fas kontrast (botten) belysning. Observera att Grb2-SH2 blockerar peptiden minskade dramatiskt EGF-signalen, dvs Erk fosforylering (område a). Hämningen av signal sträcker in ~ 3-4 rader av intilliggande celler i icke-elektroområdet (snirklig fäste), sannolikt på grund av förflyttning av 1123 Da peptiden genom gap junctions. Detta fynd utgör övertygande bevis för att den observerade inhibition måste bero på peptiden, snarare än en artefakt av elektroporering, eftersom celler i detta område inte fick någon ström, men förvärvade peptiden från sina grannar. Samtidigt finns det ingen påvisbar effekt på cellmorfologi somvisat genom faskontrast. Pilen pekar på kanten av electroporated området. Förstoring: 240x. För mer information och kontroller se referens 29. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Electroporated material
Renheten hos det material som ska elektroporeras är mycket viktigt. Om cellerna är mycket platt, måste då högre koncentrationer av spårnings färgämnet användas (upp till 20 mg / ml för LY) och i sådana fall är renheten ännu viktigare än i celler med en mer sfärisk form 1. Förutom LY en stor variation av andra färgämnen eller nonpermeant molekyler har använts, såsom en serie av Alexa-färgämnen för användning som sönder för kanaler som består av olika connexiner 25. Emellertid är färgämnen, såsom etidiumbromid eller propidiumjodid interkaleras i DNA, så att kärnorna fluorescerar mycket starkt, vilket gör kvantifiering av färgämnesöverföring svårare (Figur 4D). De spårning färgämnen måste förberedas och tvättar bedrivs i Calcium fritt odlingsmedium, eftersom en kalciuminflöde kan avbryta Junktional kommunikation, samt minska cell livskraft. Alla lösningar måste hållas vid 37 ° C före elektroporering, vilket underlättar porslutning och lönsamhet 1.
Fastställande av optimal spänning och kapacitans
Elektrisk fältstyrka är en kritisk parameter för cellgenomträngning, samt livskraft. Tillämpningen av flera pulser har visat sig ge bättre resultat i form av genomträngning och cellviabilitet än en enda puls. Den Insitu Porator apparaten Cell Projekt har tre inställningar för kapacitans och pulsnummer: Mild (10 pulser, 10 xs mellanrum, 0,1 sekunder mellan pulserna), Medium (20 pulser, 80 xs mellanrum, 0,2 sekunder mellan pulserna) och Stark (50 pulser , 120 ^ s isär, 0,5 sek mellan pulserna), medan spänning kan fint styras oberoende (2-45V). Faktum platta celler kräver lägre spänningar än trans sådana, celler i en klump eller celler med en liten vidhäftningsområdet till underlaget (t.ex. insekts Sf9 celler), Möjligen på grund av de större mängderna av strömmen som passerar genom en utsträckt cell som är i kontakt med en större ledande område. För ytterligare information om detta ämne, se 1.
Potentiella problem och felsökning
Om cellerna har skrapats under de manipulationer, kan de ta upp färgämnet och fluorescera utan elektroporation (Figur 4A). Den mängd energi som levereras till cellerna påverkar effektiviteten av elektroporation. Om pulsen är för svag (dvs för låg spänning och pulsinställningar), sedan cellerna verkar normala i fas kontrast men de fluorescerar inte, utom kanske för vissa celler som kan vara döda eller har skrapats under manipulation (Figur 4A) . Om pulsen är för stark, enligt fas kontrast celler verkar ha mycket mörka kärnor (figur 4B), men får behålla en del LY, och till och med låta några färgöverföring till angränsande celler. Vid even högre pulser cellerna förstörs (Figur 4C). Sådana celler lyseras, därför är de inte behåller LY och fluorescerar mycket svagt, om alls. Vissa epitelcellinjer såsom T51B formulär dome strukturer som kan komma upp under medel förändringar. De omgivande cellerna kan sedan fluorescerar som färgämnet kan överföras genom gap junctions (Figur 4E). Exempel på optimala elektroporation förutsättningar för representativa linjer visas i tabell 1.
Fördelar jämfört med andra tekniker och betydelse
DNA-introduktion
Det finns ett stort antal transfektion protokoll, såsom kalcium-fosfat-sam-utfällning 26 eller olika typer av liposomer. De kan emellertid påverka cellen på ett subtilt sätt som kan vara mycket viktigt, särskilt för signaltransduktion studier. Till exempel den Tyr-705-fosforylering av signalomvandlare och aktivator av transkriptetjon-3 (Stat3) som korrelerar med dess transkriptionsaktivitet ökas dramatiskt genom förfarandet i Kalcium-fosfat transfektion även i frånvaro av DNA. Detta kan bero på det faktum att fällningen förändrar cell till cell adhesion och cadherin ingrepp, en känd Stat3 aktivator 27. Vissa liposomer hade en liknande men mindre uttalad effekt, medan elektroporering eller retroviral infektion inte påverkade STAT3 nivå 6.
Införandet av peptider
En vanlig metod är byggandet av en fusionspeptid med sekvenser som korsar cellmembranet, såsom härledda från HIV-tat-genen. Emellertid är överföringen genom membranet en relativt långsam process och signal inhiberingen är inte lika effektiva. För studien av den följd av händelser som inträffar följande receptoraktivering av en ligand, möjligheten för omedelbar införande av en peptid, erbjuder peptidomimetisk eller annan förening en viktig advantage. Elektroporation av ett cellgenomsläpp peptid att påskynda upptaget inte är möjligt, sannolikt eftersom den lipofila peptiden är inbäddad i cellmembranet, som avslöjades med FITC-kopplade peptider (Raptis, opublicerad). Det är intressant att notera att den inhibering av Erk-aktivering av EGF genom användning av en cellpermeabel peptid blockerar Grb2-SH2-domänen till exempel, var endast partiell 28, medan elektroporering av samma peptid uppnått en fullständig inhibering av den signal 29 ( Figur 5). Andra tekniker, baserade på liposomer är också i existens. Men de inte tillåta undersökning av obehandlade celler sida vid sida med behandlade dem, tillsammans med gap junction studier, som kan erbjuda starkast möjliga demonstrationen att signal inhibition måste bero på det material som införs (Figur 5, snirklig fäste , c).
Gap junction studier
Mikroinjektionav färgämnen eller skrapa-laddning används ofta, men de alltid införa cellskador. En annan teknik, fluorescens återhämtning efter fotoblekning är inte invasiva men det kräver dyr utrustning, och få celler kan undersökas på en gång, medan bildningen av fototoxiska ämnen kan vara ett problem. Fallskärmen Analysen består av pre-lastceller med färgämnet kalcein AM (grön) och sedan låta cellerna fastnar på ett cellager, som gap junctions bildas inom 15 min-3 timmar. Ett stort antal celler kan behandlas på detta sätt, men den förmågan hos cellerna att bilda gap junctions i denna analys varierar enormt med celltypen 30.
Begränsningar
Den spänning som krävs är högre för införande av molekyler av större storlek och elektriska laddningar. Vid de höga spänningar som krävs för införandet av stora plasmider, kan det finnas någon celldöd. De relativa spänningar som krävs för olika molekylerhar beskrivits tidigare 9,12. Även om vi beskriver elektroporering hjälp av en särskild elektroapparat, är det möjligt för någon med erfarenhet av elektriska apparater för att göra det med hjälp av den detaljerade beskrivningen i 19, eller göra en enklare installation med en toppelektrod ovanför cellerna, och etsa med syror 1.
Framtida riktningar
Programvara har utvecklats för att exakt kvantifiera GJIC 31. En ytterligare förbättring är utvecklingen av kvantprickar som fluorescerar endast när de väl är i cellen, så att det finns inget behov av att tvätta unincorporated dye. Detta undviker stress av tvätt, samtidigt som processen kan observeras i levande, inte fixerade celler i realtid. Införandet av peptider för att avbryta signalvägar är en kraftfull metod för att bedöma relevansen av interaktioner med hjälp av renade komponenter in vivo. Undersökningen av pottenrential- olika peptider för att hämma en specifik väg är det första viktiga steget i utvecklingen av peptidomimetiska läkemedel, för en rationell behandling av neoplasi.
Övriga kommentarer
Bilderna kan tvättas med Extran-1000-lösning med hjälp av en liten pensel för att nå ITO ytan i brunnen, och sköljdes med vatten. Om cellerna har fixerats på objektglaset, kan det vara nödvändigt att avlägsna spår av proteinet med trypsin eller andra proteolytiska enzymer först. Natriumdodecylsulfat innehållande detergenter måste undvikas. Tvättade diabilder kan steriliseras med peroxid gas. Det är dock mycket viktigt att undvika att bryta förseglingen av brunnen på bilden för om någon LY lösnings läckor i hållaren grund av risk för kortslutning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
- Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
- Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
- Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M.
- Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
- Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
- Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
- Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
- Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
- Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
- Raptis, L., Firth, K. L.
- Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
- Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H.
- Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
- Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
- Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
- Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
- Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
- Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
- Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
- Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
- Meda, P.
- Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
- Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
- Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
- Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).
