Abstract
Omurilik motor nöron bütünlüğünü etkileyen hastalıklar en zayıflatıcı nörolojik durumlar arasında yer almaktadır. Son on yıl içinde, bu nöromüsküler bozuklukların çeşitli hayvan modellerinin geliştirilmesi geciktirmek veya bu şartların ilerlemesini tersine çevirmeyi amaçlayan farklı tedavi senaryolar bilimsel topluluk sağlamıştır. Nöronların retrograd makine yararlanarak, bu yaklaşımlardan birisi omurilik motor nöronlarını karşılık gelen mekik terapötik genlerin amacıyla iskelet kasları hedef olmuştur. Bir kez umut verici olmasına rağmen, bu tür gen verici bir yaklaşım başarılı bugüne kadar elde etmek göstermiştir kalıt motor nöronların alt optimal sayısı engel olmuştur. Motor uç plakaları (MEP) motor nöronların α omuriliğe doğrudan sinaptik temas halindedir iskelet kas üzerinde son derece uzman bölgelerdir. Bu bağlamda, dikkat etmek önemlidir, şimdiye kadar, çabalar retrograd içinMotor nöron içine transfer genlerinin hedeflenen kaslarında MEP bölgenin konumu referans olmadan yapılmıştır. Burada basit bir protokol 1) iskelet kaslarında yüzeyinde milletvekillerinin tam yerini ortaya çıkarmak için ve 2), motor nöronların içine intramüsküler teslimat ve retrograd izleyiciler sonraki optimum retrograd taşıma yönlendirmek için bu bilgileri kullanarak açıklar. Biz Avrupa Parlamentosu üyelerinin hedefleme üzerinden omurilik motor nöronlar terapötik genlerin retrograd taşıma araştıran içine ileri çalışmalar bu izleme deneylerin sonuçlarını yararlanmak istiyoruz.
Introduction
Böyle motor nöron hastalığı gibi nörolojik koşullar kaynaklanan ve spinal- istemli hareket yanı sıra Duchenne müsküler atrofi kontrolünün kaybı, etkilenen bireylerin günlük yaşamda yüksek ve uzun ömürlü bir etkiye sahip bir zayıflatıcı bir durumdur. Son on yılda, durdurmak ya da en azından bu nöromusküler hastalıkların zararlı etkilerini geciktirmek amacıyla araştırma çabalarının dünyadaki birçok klinisyen ve bilim adamı için bir öncelik olmuştur. Bu bağlamda, bu nöromüsküler hastalığı taklit hayvan modellerinin son nesil bu koşullar 1-13 gelişimi ve ilerlemesini altında yatan fizyolojik mekanizmaları temel anlayışlar elde vesile olmuştur. Bu nöromüsküler hastalığın tedavisi omurilik doğrudan erişim gerektirir ve omurilik enjeksiyonlar 14,15 ile elde edilebilir. Gen terapisinde son gelişmeler de üst ve çizgili kaslar hedef aldılar veomurilik 1,9-13 ventral boynuz içinde yer almaktadır karşılık gelen α motor nöronlar servis terapötik genlere alt ekstremite. Ancak, bu kez umut verici bir strateji bu nörolojik durumların sonuçlarını iyileştirmek için başarısız oldu. Bu kötü sonuçların olabileceği sonucuna adil olsa da, en azından kısmen, bu koruyucu genlerin düşük etkinliğine bağlı olduğu, kimse bu gen aktarım yöntemleri, düşük etkinliğini gözardı edilemez.
Motor uç plakaları (MEP) motor nöronların α kaynaklanan büyük periferik motorlu liflerin akson terminalleri girintilendirildiği iskelet myofibres uzman bölgeleridir. Birlikte, periferik sinir lifi uçları ve Parlamento üyeleri, yani nöromüsküler kavşak, sinaptik darbeleri nörotransmiterin ileriye salınımı, asetilkolin tarafından tetiklenen bölgesini oluşturur. Önemlisi, periferik sinir lifleri ve milletvekillerinin arasındaki ilişki iki Direc olduğunuarası, farklı motorlar yanı sıra uzak nörondan doğru moleküllerin ve organellerin taşınmasından sorumlu olmasına rağmen 16-18 somata. Bu anatomik düşüncelerin ışığında, AP üyeleri ilgili motor nöronlara teslimat ve genetik malzeme daha sonra geriye doğru taşınması için tercih edilen hedefler olarak görünmektedir. Bu bağlamda, bu motor nöron iletimi başarısı büyük ölçüde viral vektörler ve kasın AP üyeleri 19-20 intramüsküler enjeksiyon arasındaki mesafeye bağlı olması şaşırtıcı değildir. Ancak şaşırtıcı bir şekilde, laboratuar sıçan ve fare myofibres ilgili MEP bölgelerinin kesin konumu, seçim iki tür kas hastalıkları modellemek için, yakın zamana kadar mevcut değildi.
Biz sıçan ve fare 21-22 çeşitli ön ayakları kaslar için MEP bölgenin kapsamlı haritalar üretmişlerdir. Daha yakın zamanlarda, biz MEP r organizasyonu detaylarını göstermiştirFare hindlimb 23 çeşitli kaslar için egion ve şu anda sıçan hindlimb milletvekilleri özelliklerini analiz ediyoruz. Bizim ellerde, bu kasların bütün MEP bölgelerine yönelik retrograd izleyiciler kas içine enjeksiyonlar önceden bildirilen daha omurilik segmentleri kapsayan vardır daha etiketli motor nöronlar doğurdu. Burada dış yüzeyinde yanı sıra hindlimb derinliği boyunca Avrupa Parlamentosu üyelerinin yerini ortaya koymak ve fare ve sıçan hem de kasları ön ayakları son birkaç yıldır geliştirilmiştir protokol mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm deneysel prosedürleri UNSW Avustralya Hayvan Bakım ve Etik Kurulu uyulması ve Ulusal Sağlık ve hayvan deney için Tıbbi Araştırma Konseyi Avustralya yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Bu protokolde tüm işlemler, ilgili Hayvan Bakım ve Etik Kurulu gereklerine uygun olarak yapılmalıdır.
1. Asetilkolinesteraz Histokimyasal Boyama
- Asetilkolinesteraz Reaksiyon karışımı hazırlayın
- 0.1 M fosfat tamponu (PB) 200 ml asetiltiyoklolin iyodür 290 mg ekleyin. 900 rpm'de bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın.
- Sürekli karıştırma altında, glisin, 600 mg ekleyin.
- Ürün tamamen çözünene kadar yavaş yavaş sürekli karıştırma altında, reaksiyon karışımına bakır sülfat ve 420 mg ekleyin.
- Hayvan karkas deriyi kaldır kesiler yaparak (doku paylaşımı yoluyla elde edilen)Bir perfüze sıçan veya fare derisi, boyun bölgesinde cildi tutup ayağa geçmiş çekerek içine. Her kas kapsayan fasya kaldırıldı veya önemli ölçüde reaksiyon çözeltisine kas liflerinin bol pozlama sağlamak için delikli ya olduğundan emin olun.
- Reaksiyon karışımına tüm vücudu veya ilgi bacak daldırın ve 4 ° C de O / N inkübe edin.
- Damıtılmış su içinde 2 dakika boyunca karkas yıkayın. Not: Bu aşamada, kaslar mavi bir renk ve motor uç plakaları (MEP) beyaz noktalar olarak görülebilir sergiler.
- 3-5 saniye için% 10 amonyum sülfit çözeltisine karkas Açığa.
Not: kas lifleri hızla kahverengi dönecek ve Parlamento üyeleri siyah benekli noktalar olarak gözlemlenebilir olacak. Reaksiyon çok hızlı oluşur ve kas lifleri amonyum sülfit çözeltisi (örneğin,% 5) daha düşük konsantrasyonlarını kullanmayı deneyin milletvekilleri ve kas lifleri ayırt etmek çok koyu lekeli ise. Tepkime süresi almak içinAP üyeleri ve kas lifleri arasında iyi kontrast bir örnekten diğerine değişir. Bu nedenle ayıracı kesin pozlama süresini tanımlamak zordur. Reaksiyon yakından izlenmeli ve kontrast yeterli görüldüğünde durdurulmalıdır. - Distile su içinde çalkalanarak karkas iki kez yıkayın ve yavaşça kurulayın karkas.
- Fotoğraf ilgi tüm kaslar için milletvekilleri yakalanır sağlamak ekstremitenin lateral ve medial yönleri, hem de.
2. İntramüsküler Enjeksiyonlar Motor Sonu Plakalar de
- Mikropipet çektirmesi ile cam mikropipetler çekin (pistonları ile kademeli mikropipetlerin kullanılması tavsiye edilir). Inceleyici bir mikroskobun yardımıyla, mikropipet lümenin iç çapı yaklaşık olarak 0.5 mm, öyle ki bir çift forseps ile mikropipetler ipuçlarını bölünürler.
- Kullanılan tüm cerrahi aletler taze otoklava ve inci emin olunCerrahi alanda sterildir.
- Floro-Gold (distile su içinde% 5) ile mikropipetler doldurun.
- Izofloran (O 2% 4) ile bir indüksiyon odasında hayvan anastetize neden olur. Refleksi kontrol edin ve indüksiyon odasından çıkarmadan önce onun yokluğunda sağlamak. Sıçan burun üzerinde bir burun konisi Güvenli ve anestezi bakımı için isofluorane (O 2% 2) teslim. Hayvanın ayak parmakları Pinch ve yavaşça pedal çekilmesi ve kornea refleksleri hem bulunmadığına emin olmak için hayvanın gözü dokunun. Not: ketamin ve xylazil bir karışımı da kullanılabilir (80 ve 10 mg / kg, intraperitonal olarak verilen). Ketamin bir zamanlama 8 ("Kontrollü") ilaç ve uyulması gerekecektir ilacın satın alınması, kullanılması, depolanması ve bertaraf ile ilgili gerekli protokoller olduğunu.
- Prosedürü sırasında gözlerin kurumasını önlemek için göz yağlayıcı.
- T Tıraşargeted bacak ve kullanım gazlı bez, üç klorheksidin alternatif scrubs ve% 70 alkol ile traş bölgeyi silin. Cerrahi alana hayvan aktarın.
- Temiz bir underpad hayvan koyun ve hedeflenen kas (lar) iyi erişim sağlamak için uygun bir şekilde yerleştirin.
- Uzakta yatan kas hedeflenen kas üzerindeki deriyi kaldırın ve cerrahi makas ile deride bir kesi yapmak için diş kılıf ile forseps bir çift kullanın. Kesi tamamen ilgi kas (lar) maruz yeterince büyük olduğundan emin olun. Fasya minimal bozulma olduğundan emin olun.
- Zihinsel kas (lar) üzerine MEP bölgenin konumunu ve şeklini devrik MEP fotoğrafları kullanın.
Not: Bir ince keçe işaretleyici ilgi kas (lar) üzerine fotoğraftan MEP bölgesini çoğaltmak yardımcı olabilir. - Her bir s 1-2 ul 3-4 enjeksiyonlar, Flor-Gold için (MEP bölgenin tüm uzunluğu boyunca çok sayıda enjeksiyon gerçekleştirmehould) yeterli olabilir. Yavaşça herhangi sızıntıyı gidermek için kas (lar) silin.
- Birbirine yakın künt forseps ile kazıma cilt iki ucunu getirin ve cerrahi klipler ile yarayı kapatmak. Yaranın tüm açıklık boyunca 0.1 mi bupivakainin (su içinde% 0.5) (ya da başka lokal anestezikler) sızın.
- Kapalı anestezi Makineyi açın ve tamamen anestezi kurtarılır kadar hayvan izleyin.
- Kas içi enjeksiyonların uygulanmasından ve hayvanların perfüzyon arasında 14 gün boyunca bekleyin.
3. Perfüzyonları
- Periton içine enjeksiyon yoluyla bir hayvana (150 mg / kg, örneğin Lethabarb) pentobarbiton sodyum çözeltisi öldürücü doz uygulayın.
- Pedal çekilmesi yokluğunda ve kornea refleksleri tarafından onaylandıktan anestezi derin bir düzeyde, ulaşılana kadar yakından hayvan izlemek.
- Bir perfusio üzerine yerleştirilen bir diseksiyon gemide sırtında hayvan yerleştirinn lavabo.
- Sternum tabanını kaplayan derinin kaldırılması için diş kılıf ile forseps bir çift kullanın. Hemen sternum altında güçlü cerrahi bir makasla küçük bir cilt kesisi yapın ve daha sonra kavrama sternum kılıç şeklinde kıkırdak forseps kullanabilir. Kılıç şeklinde kıkırdak tutarken, koltukaltı için sternum, göğüs boşluğunun her iki tarafında kesi büyütmek.
- Kalp maruz diyaframı kesin.
- Kan pıhtılaşmasını önlemek için doğrudan kalp apeksine heparin 0.ml enjekte edilir.
- Sol ventrikül içine bir kanül yerleştirilmesine imkan vermek için tepe kesin ve daha sonra hızlı bir şekilde Hemostatik yardımı ile yerine kanül kelepçe.
- İnce bir makas ile sağ atrium bir kesi yapmak ve hemen peristaltik pompa başlar. Atrium dışarı akan sıvının kan neredeyse ücretsiz ve karaciğer rengi açık kahverengi oluncaya kadar 0.1 M PB ile serpmek. Daha sonra, Solu serpmekhayvanın tüm vücut kadar paraformaldehid (0.1 M PB% 4) tion sertleşmektedir.
4. Servikal Spinal Kord Diseksiyon ve Histoloji Hazırlık
- Kendi karın hayvan karkas yatırın.
- Bir neşter ile vücudun orta hatta cilt kesin ve iliak kemik seviyesine kafatası tabanından yansıtmak.
- Kesmek ve omurganın dorsal yönünü ortaya çıkarmak için paravertebral kaslar yansıtmaktadır.
- Atlas, ikinci servikal segmentte (yani, C2) kemik spinoz sürecini tanımlayın ve ilgili temel dorsal kök bulmak için cerrahi rongeurs veya forseps bir çift ile çıkarın.
- Kalıcı keçe işaretleyici ile boyama sağ C2 kök tanımlayın.
- Bir sonraki vertebra tek çıkarın ve alternatif renkler (yani, C2, C4, C6 ve C8 yeşil ve C3 renkli olabilir sağ dorsal kökleri işaretlemek, C5, C7, T1 col olabilirORed mavi).
- Küçük bir cerrahi iğne kullanın (örneğin, 30 G iğne) hafifçe delmek omuriliğin alt ucunu kaplayan dura aracılığıyla. Uzunlamasına yarık yapmak için rostrally iğne taşırken yukarı bakacak şekilde iğne eğim sayesinde, kordon uzak dura kaldırın.
- Dura Reflect.
- Yeni bir neşter bıçağı ile bir veya iki kademeli bloklar halinde omurilik enine doğru kesin.
- Dikkatlice iki komşu kökleri arasındaki neşter bıçağı yarım her bloğun sol tarafında küçük bir referans işareti yapmak, her blok için, in situ omurilik segmentleri bırakın ve. Blokların ventral görünür olması için referans işareti dokusu sayesinde yeterince derin olduğundan emin olun. Diseksiyon sonra doku parçasının oryantasyon yardımcı olmak için, hayvan anatomisi ile ilgili olarak, ya öne ya da arkaya doğru işaret eden, yaklaşık 45 ° 'lik bir açı ile referans işareti sağlayın.
- Paraformaldehitten (0.1 M PB% 4) çözeltisi içeren küçük, açıkça etiketlenmiş şişeler içine bireysel blokları toplayın ve RT O / N bırakın.
- Sukroz (0.1 M PB% 30) ihtiva eden bir çözelti ihtiva eden, temiz, açık bir şekilde etiketlenmiş şişelerde blokları aktarın ve en az iki gün boyunca 4 ° C'de tutun.
- Cryo-kalıplar kesimleri yerleştirin ve doku dondurma ortamı ile onları kaplı. Boyuna histolojik hazırlanması için, yukarı bakacak şekilde dorsal bloklar yönlendirmek ve cryo-kalıplarda blok yönlendirmek için referans işareti kullanın.
- -20 ° C'de krio-kalıpları dondurun ve 50 um kalınlığında kesitler bir kriyostat ile kesilmiş. Not: bölümler doğrudan yapışma mikroskop slaytlar üzerine monte ve / N O kurumaya bırakılabilir. Seçenek olarak ise, bölümler 0.1 M PB ile doldurulmuş 48 oyuklu plakalar içinde yüzen edilebilir ve daha sonra, slaytlar üzerinde doku bölümleri yönlendirmek için referans işareti kullanılarak monte edilebilir.
5. Lomber Spinal Cord Diseksiyon ve Histoloji Hazırlık
- Geri geldi hayvan karkas yatırın.
- Hayvanın karın boyunca bir orta hat kesi gerçekleştirin ve iç organları çıkarın. Vertebral kolonun ventral maruz arka karın duvarı kasları parçalara ayır.
- T13 ventral kök kemiği çıkar kısa kuyruk-en kaburga ve onun bitişiğindeki T13 omur bulun.
- Ardışık T13 teker, iki veya üç omur rostral birini çıkarın (örneğin, T12, T11 ve gerekirse, T10) ince cerrahi rongeurs ile ventral kord ventral yönünde giriş noktası kadar T13 ventral kök takip etmek ve Kalıcı keçe işaretleyici ile işaretleyin.
- Bu noktadan itibaren, alternatif renkler ile boyama, L1, L2, L3, L4, L5, L6 ve S1 için ventral kök giriş noktaları yerini belirlemek için aynı işlemi tekrarlayın.
- Lum için Bölüm 4,5-4,10 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayınOmurilik diseksiyonu bar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Asetilkolinesteraz histokimyasal boyama kaslarının genişliği boyunca motor uç plakaları yerini ortaya koymaktadır. 1 bütün sıçan ön ayakları üzerinde gerçekleştirilen bu tür boyama sonuçlarını gösterir Şekil. Bu, amonyum sülfit çözeltisinin konsantrasyonu optimize etmek için önerilmektedir (örn.,% 5-7 yerine% 10) da bir örnek çözelti içine daldırılmaktadır zaman olarak kas lifleri üzerinde spesifik olmayan arka plan boyaması çok ise, Aşırı. Şekil 2 fare triseps brachii motor uç plakası bölgenin uzunluğu boyunca retrograd nöronal izleyici bir enjeksiyondan sonra servikal omurilikte etiketli motor nöron bir sütun göstermektedir. retrograd etiketli motor nöronlar, tipik olarak. omurilik birden süreçleri boyunca boylamasına sütuna oluşturan 3 sel vasıtasıyla elde edildi etiketli belkemiği ipliği motor nöronlannın farklı sayıda göstermektedir Şekiltriceps brachii'nin motor uç plakası bölgenin hedef özelliklerin etkili Floro-altın. MEP bölgenin belirli bölmeler hedef aksine Maksimal alımı, MEP bölgenin tüm açıklıklı içine teslim edildikten sonra gözlenmiştir.
Şekil 1: Motor End Tabaklar için Asetilkolinesteraz Histokimyasal Boyama sonrasında Sıçan Yanal ön ayakları Görünüm (A) öncesi ve Amonyum Sülfit Çözüm (B) Maruz Kalma sonra. (A), motor uç plakaları kas lifleri bir yeşil-mavi renk kabul ederken kas bütün genişliğini haçlar sürekli bir çizgi oluşturan beyaz benekli noktalar olarak görülür. (B) 'de, aynı ön ayakları amonyum sülfit çözeltisi içine daldırıldıktan sonra sunulmuştur. Amonyum sülfit çözeltisi içinde kalkınma sonra, motor uç plakaları tukahverengi kas lifleri üzerinde rn siyah. şekillerin her iki tarafında oklar (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus ve (3) trişin brachii'nin motor uç plakalarının konumu işaret eder.
Şekil 2:. Floro-Altın-etiketli Motor Nöronlar WM Revealing Servikal Seviyelerde Omurilik Ventral Horn ile 50 mikron boyuna Bölüm fotomikrografları beyaz madde temsil ve GM omurilik gri madde temsil eder. kesikli çizgi, şekil gözlenen omurilik bölümünde gri ve beyaz madde arasındaki sınırı göstermektedir. içerlek aynı filtrenin altında 20X amacı ile alınmıştır oysa fotomikrograf DAPI filtre altında 10X amacı ile alınmıştır. Her iki panelde de Floro-altın markalama proksimal akson / dendriti yanı sıra, motor nöron sitoplazmada gözlenebilirc süreçleri. Orijinal olarak Tosolini ark yayınlandı figürü. Fare ön ayakları Motor Sonu Plaka Bölgeler Tam Boy Hedefleme (2013) Omurilik Motor Nöronlar Cephesi Sorumlu içine Floro-Altın Alımı artırır. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Şekil 3:. Seçici Floro-altın trişin brachii'nin Motor sonu plaka bölgesinde ve belkemiği ipliği motor nöronlannın sonuçlanan Etiketleme Hedefleme (A) triseps brachii'nin lifler üzerinde motor uç plakalarının konumunun şematik bir temsilidir. ayrı ayrı hedef alındı MEP bölgenin üç farklı bölümleri, yeşil, kırmızı ve mavi noktalarla temsil edilmektedir. Mavi noktalar huk iken yeşil ve kırmızı noktalar sırasıyla tüm MEP bölgenin anterior ve posterior yarılarını temsilkas karın içine FG bolus enjeksiyonu konumunu nt. çift başlı ok bir ön-arka eksen kas yönlendirir. (B) (A) 'da gösterildiği gibi, triseps brachii'nin MEP bölgenin farklı bölümlerinin seçici hedeflemesi takiben elde edilen etiketleme gösteren bir bileşik diyagramdır. (B) Her nokta bir tek etiketli motorlu nöron temsil eder. Siyah sütun tipik etiketleme temsilcisi kas MEP bölgenin tüm açıklıklı içine FG aşağıdaki enjeksiyon gözlenen. Yeşil motor nöron kolon kası ön yarısında FG enjeksiyonu ile elde edilir iken, kırmızı motor nöron kolonu, kas arka yarısında FG enjeksiyonları takiben elde edilir. Mavi sütuna gösterdiği gibi kas "göbek" ile sınırlı Enjeksiyonlar, omurilik segmentleri sadece küçük bir sayıda motor nöronları vermiştir. Başlangıçta yayınlamak olarak figürüTosolini ve diğerleri ed. Fare ön ayakları Motor Sonu Plaka Bölgeler Tam Boy Hedefleme (2013) Omurilik Motor Nöronlar Cephesi Sorumlu içine Floro-Altın Alımı artırır. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İntramüsküler hedefleme ve nöromüsküler durumun deneysel tedavi için gelen α motor nöronlar terapötik transgenlerin sonraki retrograd transferi, yeni bir strateji değildir. Örneğin, bu dağıtım yöntemi SOD1 fareler ve sıçanlar 1,9-12 ALS ilerlemesi farklı aşamalarında olarak SMA 13 olan farelerde kas dejenerasyonu geciktirmek için kullanılmaktadır. Umut verici iken, bu gen terapisi senaryoları etkinliği sınırlı kalmıştır. Bu bağlamda, belkemiği ipliği motor nöronlar tarafından transgenlerin alımı kas lifleri motor uç levhalardan seçici hedeflemesi geliştirilebilir öneriyoruz. Yukarıda bahsedilen çalışmalarda, viral vektörlerin intramüsküler enjeksiyonlar, hedeflenen kaslarında MEP bölgenin konumu referans olmadan yapıldı, dikkat etmek önemlidir.
Motor uç plakalarının dağıtımının bizim analizler boyuncaHindlimb ve ön ayakları (MEP), birkaç ilkeler ortaya çıkmıştır. İlk olarak, MEP bölge kas genişliği boyunca yayılmıştır. Ayrıca, AP üyeleri tutarlı myofibres yönüne ilişkin olan dik hizalanmıştır. Özellikle, MEP bölge daima kasın kalın bölümünde yer değil, bir alan genellikle 'karın' olarak anılacaktır ve sık sık hap kas içi enjeksiyonlar hedefidir. Mevcut analizler 21 sıçan C57BL6 fare 22-23 ve Uzun Evans yapılmıştır ve Avrupa Parlamentosu üyelerinin dağılımı hayvanların bu iki suş her birinde korunduğunu tespit edildi dikkati çekiyor. Bununla birlikte, MEP dağılımı aynı tür içinde hayvanların farklı suşları arasında muhafaza edilir olsa da olmasa da belgelenmiştir gerekmektedir.
Başlangıçta, biz küçük, mul rehberlik etmek amacıyla ön ayakları ve hindlimb çeşitli kaslar için MEP bölgenin konumunu belgelediretrograd nöronal tracer Flor-Gold tiple kas içi enjeksiyonlar. Bu MEP haritaları motor nöronların içine mekik transgenleri için kullanılabilir. Bu durumda, bununla birlikte, kullanılan virüs türüne göre (örn., Adenovirüs, lentivirüs, vb), serotip yanı sıra titre uygun enjeksiyon hacimlerini ayarlamak için önemlidir. Fasya sağlam tutulması ilgi kas (lar) sınırları içinde sınırlı virüs tutmak için iyi bir yoldur. Motor nöron sahte transfeksiyon önlemek için başka bir yolu komşu kaslar hafifçe enjeksiyondan sonra kas yüzeyini silmek için innerve. Hedeflenen kas tedarik motor nöronların havuzu içinde onu içeren daha uygun olabilir transdüksiyon yüksek düzeyde elde nerede Bu önlemler bazı deneysel tasarımlarda alakasız olabilir. Yine de, bu bariz güvenlik nedenleriyle iyi bir uygulama vardır. Birden fazla izole kas enjekte edilmesi gerekiyorsa, mümkünse seçmek için akıllıca olabilircilt insizyonu boyutunu en aza indirmek için birbirine yakın kas bir grup. Sıçanlar ve fareler (değil, kaslara bağlı yani.) Çok gevşek bir cilde sahip, bu yüzden büyük cilt kesiler yapmak zorunda kalmadan birkaç kasları hedef nispeten kolaydır.
Ideal gibi tedavi omurilik motor nöronlar tüm nüfusun genelinde olumlu gen transferi olur gibi nöronların retrograd makineler kullanılarak ALS ve diğer nöromüsküler koşulları için etkili gen tedavisi bir sorun olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, örneğin, bir nörotrofin gibi ilgi terapötik gen, bir salgılama proteini kodlayan ise iletimi sürdürülebilir seviyelerinin elde edilmesi için, tüm motor nöronların ve hedeflemek için gerekli değildir. Transduse edilmiş olan çok yakın Gerçekten de, transdüksiyona motor nöronlar, parakrin mekanizması 24 boyunca nörotrofinlerin eksojen molekülleri özümseyebilir gösterilmiştir. Bu 'seyirci etkisi' büyük ka artırırmotor nöronların karşılık içine mekik salgı protein kodlayan genlerin hedefleyen kas içi etkinlik gösterir. Öte yandan, solunum kontrol kaybı ALS ölüm nihai nedeni olduğu gerçeğini göz önüne alındığında, tedavi viral yapıları intramüsküler enjeksiyonlar interkostal kaslar 1 yapılabilmiş veya intraplevral 25 nefes alan motor nöronları korumak için. Kolayca iskelet kasları üzerinde milletvekillerinin yerini ve organizasyonu vurgulamak için bir yöntem tanımlayarak, mevcut protokol nöromüsküler işlev bozukluklarının için yeni gen tedavisi stratejileri keşfetmek için değerli bir araç olacağına. Bu protokol ayrıca alt motor nöron hastalıklarında nöromüsküler kavşak bütünlüğünü korumak için minimal invaziv bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma RM Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırmalar Merkezi (NHMRC) projesi hibe ile desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
