فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات
Summary
كثيرا ما كانت التقليدية دراسات فقدان لوظيفة الجينات باستخدام الحيوانات خروج المغلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. على أساس انهانسر كريسبر بوساطة الطفرات الجسدية أداة قوية لفهم وظائف الجينات في الجسم الحي. هنا، نحن التقرير طريقة لتحليل تعمل خروج المغلوب في تكاثر خلايا المخيخ.
Abstract
وكثيراً ما تشوه الدماغ بسبب الطفرات الوراثية. فك رموز الطفرات في الأنسجة المستمدة من المريض قد حددت المحتملة العوامل المسببة للأمراض. للتحقق من صحة بمساهمة من خلل تحور الجينات لتطوير المرض، هو توليد نماذج حيوانية تحمل الطفرات أحد النهج الواضح. بينما germline وراثيا نماذج الماوس (جيمس) هي أدوات البيولوجية شعبية ويحمل النتائج استنساخه، فإنه مقيد بالوقت والتكاليف. وفي الوقت نفسه، تمكن جيمس غير الخط غالباً ما استكشاف الجينات الدالة بطريقة أكثر جدوى. منذ الدماغ بعض الأمراض (مثل، أورام الدماغ) تظهر نتيجة جسدية ولكن لا germline الطفرات، نماذج الماوس تشيميريك غير germline، تتعايش فيه الخلايا العادية وغير العادية، يمكن أن تكون مفيدة لتحليل الأمراض ذات الصلة. في هذه الدراسة، ونحن التقرير طريقة لاستحثاث الطفرات الجسدية بوساطة كريسبر في المخيخ. على وجه التحديد، أننا استخدمت الشرطي تدق في الفئران، التي Cas9 و التجارة والنقل هي مزمنة المنشط بالمروج كاج (CMV محسن/الدجاج ß-أكتين) بعد لجنة المساواة العرقية-بوساطة جزئ الجينوم. الذاتي المصممة الواحد-دليل الكشف (سجرناس) وتسلسل recombinase لجنة المساواة العرقية، سواء ترميز في بناء بلازميد واحد، سلمت إلى الخلايا الجذعية الدماغ/السلف في مرحلة جنينية في الرحم انهانسر باستخدام. ونتيجة لذلك، كانت تسمية transfected الخلايا وخلاياها ابنه مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، مما ييسر المزيد من التحليلات المظهرية. ومن ثم، هذا الأسلوب هو عرض التسليم على أساس انهانسر الجينات في خلايا الدماغ الجنينية بل تقترح أيضا رواية نهج كمي لتقييم الخسارة من الدالة كريسبر بوساطة تعمل.
Introduction
أمراض الدماغ واحدة من أفظع أمراض مميتة. أنهم غالباً ما تنجم عن طفرات وراثية والتقلبات اللاحقة. لفهم الآليات الجزيئية لأمراض المخ، اكتشف من أي وقت مضى تدوم الجهود الرامية إلى فك الجينوم البشري المرضى عددا من الجينات المسببة المحتملة. حتى الآن، استخدمت نماذج حيوانية germline وراثيا في فيفو مكسب-من-وظيفة (صندوق القناص) وخسارة للدالة (LOF) تحليلات لمثل هذه الجينات المرشحة. نظراً لتسارع تطور الدراسات الفنية التحقق من الصحة، أكثر عمليا ومرناً في فيفو جينات مقايسة نظاما لدراسة وظيفة الجينات المرغوب فيه.
تطبيق نظام نقل الجينات على أساس انهانسر في فيفو على الدماغ الماوس مناسبة لهذا الغرض. في الواقع، أظهرت عدة دراسات في الرحم انهانسر باستخدام قدرتها على إجراء التحليلات الفنية في تطوير الدماغ1،2،3. في الواقع، تعرضت عدة مناطق في الدماغ الفأرة، مثل قشرة الدماغ4والشبكية5، الجملة6، هيندبراين7، المخيخ8، والحبل الشوكي9 إيصال الجينات الجسدية النهج، حتى الآن.
في الواقع، التعبير الجيني عابر خلال في فيفو انهانسر على أدمغة الفأر الجنينية قد استخدمت منذ فترة طويلة لتحليل صندوق القناص. تمكين التكنولوجيات المستندة إلى ينقول التكامل الجينوم الأخيرة زيادة التعبير طويل الأجل و/أو المشروطة للجينات لفائدة10،11، ومفيد تشريح وظيفة الجينات بطريقة المكانية والزمانية خلال التنمية. وعلى النقيض من تحليل صندوق القناص، تم التحليل LOF أكثر تحديا. بينما أنجز تعداء عابر سيرناس ووالبلازميدات تحمل شرنا، ليست مضمونة الآثار الطويلة الأجل ل LOF للجينات بسبب التدهور في نهاية المطاف من مناشئ أدخلت الأحماض النووية، مثل البلازميدات ودسرناس. ومع ذلك، توفر تقنية كريسبر/Cas فاصل عبر في تحليلات LOF. وقد تم transfected الجينات ترميز البروتينات الفلورية (مثلاً، التجارة والنقل) أو البروتينات طرحه (مثلاً، لوسيفراس اليراع) شاركت مع كريسبر-Cas9 وسجرناس لتسمية الخلايا تتعرض لطفرات جسدية كريسبر-Cas9-بوساطة. ومع ذلك، هذا النهج قد يكون القيود في الدراسات الفنية في تكاثر الخلايا، حيث تضعف الجينات علامة خارجية وتدهورت بعد انتشار طويلة الأجل. بينما transfected الخلايا والخلايا ابنه لها الخضوع الطفرات المستحثة كريسبر في جينومات بهم، قد تضيع على أقدام على مر الزمن. وهكذا، سيكون النهج وضع العلامات الوراثية المناسبة للتغلب على هذه المشكلة.
مؤخرا قمنا بتطوير أسلوب المستندة إلى كريسبر LOF في الخلايا الحبيبية للدماغ التي يخضع لها الانتشار الطويل الأجل خلال هذه المفاضلة12. لتسمية الخلايا transfected وراثيا، شيدت بلازميد تحمل سجرنا جنبا إلى جنب مع لجنة المساواة العرقية ، وأدخلت بلازميد cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP الفئران13 استخدام انهانسر في الرحم . خلافا لترميز اجفب ناقلات بلازميد العادية، هذا النهج بنجاح المسمى الحبيبية transfected الخلايا العصبية السلائف (قومي) وخلاياها ابنه. هذا الأسلوب يوفر دعما كبيرا في فهم في فيفو وظيفة جينات فائدة في الخلايا المتكاثرة في نمو الدماغ الطبيعي وخلفية معرضة لورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام انهانسر الرحم أكسو ، أبلغنا سابقا على أساس siRNA في فيفو الوظيفية تحليلات Atoh1 في مرحلة مبكرة من الحبيبية للدماغ الخلية التمايز8. سبب siRNA تمييع/تدهور والتعرض للأجنة خارج جدار الرحم، اقتصر التحليل المظهرية من الخلايا الحبيبية اليكتروبوراتيد المراحل الجنينية. وم?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نقدر سيبر لورا وأنا نوربورج، هاريم ياسين وشروتر بترا للمساعدة التقنية. كما نشكر الدكتور ك. ريفينبيرج، ك. Dell وص Prückl لمساعدة مفيدة للتجارب على الحيوانات في هذا؛ التصوير الأساسية تسهيلات هذا ومركز تصوير كارل زايس في هذا للتصوير المجهري [كنفوكل]. وأيد هذا العمل الأوقيانوغرافية دويتش، كا 4472/1-1 (ل D.K.).
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
