Summary

CRISPR induite par la perte de fonction dans cervelet granules des cellules utilisant In Utero électroporation basée sur un transfert de gènes

Published: June 09, 2018
doi:

Summary

Études classiques de perte de la fonction des gènes à l’aide d’animaux knock-out ont souvent été coûteux et long. Axée sur l’électroporation de mutagenèse induite par CRISPR somatique est un outil puissant pour comprendre les fonctions de gènes in vivo. Nous rapportons ici une méthode pour analyser les phénotypes d’élimination directe dans les cellules en prolifération du cervelet.

Abstract

Malformation cérébrale est souvent causée par des mutations génétiques. Décrypter les mutations dans les tissus dérivés de patient a identifié des facteurs étiologiques potentiels des maladies. Pour valider la contribution d’un dysfonctionnement des gènes mutés au développement de la maladie, la génération de modèles animaux portant les mutations est une approche évidente. Alors que les cellules germinales génétiquement modèles murins (edged) sont populaires outils biologiques et présentent des résultats reproductibles, il est limité par le temps et les coûts. Pendant ce temps, non lignée germinale edged permettre souvent explorer la fonction du gène d’une manière plus réaliste. Depuis certains cerveau maladies (p. ex., tumeurs cérébrales) semblent résulter de somatique, mais pas de mutations germinales, non lignée germinale modèles de souris chimériques, où coexistent des cellules normales et anormales, pourraient être utiles pour l’analyse pertinente à la maladie. Dans cette étude, nous présentons une méthode pour l’induction de mutations somatiques CRISPR-négociée dans le cervelet. Plus précisément, nous avons utilisé le conditionnels souris knock-in, dans lequel Cas9 et GFP sont chroniquement activés par le promoteur de l’ ACG (CMV enhancer/poulet ß-actine) après Cre-médiée par recombinaison du génome. Le seul individu-conçu-guide RNAs (sgRNAs) et la séquence de recombinase Cre, tous deux encodé dans une construction de plasmide, ont été livrés sur les cellules souches/progénitrices cérébelleux à un stade embryonnaire à l’aide de in utero électroporation. Par conséquent, cellules transfectées et leur fille ont été marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP), facilitant ainsi approfondir les analyses phénotypiques. Par conséquent, cette méthode est non seulement montrant livraison axée sur l’électroporation génique sur les cellules embryonnaires cérébelleux mais propose également une nouvelle approche quantitative pour évaluer CRISPR induite par la perte de fonction phénotypes.

Introduction

Maladies du cerveau sont une des plus terribles maladies mortels. Ils résultent souvent de mutations génétiques et dérèglement subséquent. Pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies du cerveau, éternelle efforts pour déchiffrer les génomes des patients humains ont découvert un certain nombre de gènes potentiels. Jusqu’ici, modèles animaux de lignée germinale génie modifiées ont été utilisés pour in vivo gain de fonction (GOF) et l’analyse de la perte de fonction (LOF) de ces gènes candidats. En raison du développement accéléré des études de validation fonctionnelle, un plus faisable et plus souple en vivo test système génétique pour étudier la fonction du gène est souhaitable.

L’application d’un système de transfert in vivo génique à base électroporation pour le cerveau en développement de la souris est adaptée à cet effet. En fait, plusieurs études utilisant l’électroporation de in utero ont montré leur capacité à effectuer des analyses fonctionnelles dans les pays en développement cerveau1,2,3. En fait, plusieurs régions du cerveau de souris, comme le cortex cérébral4, rétine5, diencéphale6, hindbrain7, cervelet,8et9 de la moelle épinière ont été ciblées par livraison génique somatique approches, jusqu’à présent.

En effet, expression transitoire par électroporation de in vivo sur le cerveau des souris embryonnaires a longtemps été utilisée pour l’analyse GOF. Récente intégration génomique axée sur le transposon technologies encore permis à long terme et/ou conditionnelle expression des gènes d’intérêt10,11, qui est avantageux à disséquer la fonction du gène de façon spatiale et temporelle au cours développement. Contrairement à l’analyse GOF, analyse LOF a été plus difficile. Tandis que la transfection transitoire des siRNAs et porteurs de shARN Plasmides a été effectuée, les effets à long terme de LOF des gènes ne sont pas garantis en raison de la dégradation éventuelle de d’acides nucléiques exogènes introduites, telles que les plasmides et ARN doubles brins. Cependant, la technologie CRISPR/AR offre une percée dans les analyses LOF. Gènes codant pour des protéines fluorescentes (p. ex., GFP) ou bioluminescentes protéines (p. ex., luciférase firefly) ont été conjointement transfectées avec CRISPR-Cas9 et sgRNAs d’étiqueter les cellules exposées à des mutations somatiques CRISPR Cas9-médiation. Néanmoins, cette approche pourrait avoir de limites dans les études fonctionnelles sur les cellules en prolifération, car les gènes marqueurs exogènes sont dilués et dégradées après la prolifération à long terme. Alors que les cellules transfectées et leurs cellules filles subissent des mutations induites CRISPR dans leurs génomes, leurs empreintes pourraient se perdre au fil du temps. Ainsi, les approches étiquetage génétiques serait appropriées surmonter ce problème.

Nous récemment mis au point une méthode axée sur les CRISPR LOF dans les microglies cérébelleuses qui subissent une prolifération à long terme au cours de leur différenciation12. Pour étiqueter une génétiquement les cellules transfectées, nous avons construit un plasmide portant une sgRNA ainsi que de la Cre et introduit le plasmide dans le sembable Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP souris13 utilisant l’électroporation de dans l’utérus . À la différence des vecteurs de plasmide régulière encodage EGFP, cette approche avec succès marqué granule transfectée précurseurs de neurone (PNB) et leurs cellules-filles. Cette méthode fournit le grand soutien dans la compréhension en vivo la fonction des gènes d’intérêt dans les cellules en prolifération dans le développement normal du cerveau et un fond sujettes aux tumeurs.

Protocol

Toutes les expériences sur des animaux ont été menées conformément à la réglementation du bien-être des animaux et ont été approuvés par les autorités responsables (Regierungspräsidium de Karlsruhe, numéros d’homologation : G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 et G133/14). 1. générer des plasmides pU6-sgRNA-Cbh-Cre Concevoir la sgRNA afin de cibler un gène d’intérêt selon le protocole publiées antérieurement14.Remarque : Dans cette ex…

Representative Results

Analyse fonctionnelle in vivo , il est essentiel d’identifier les cellules qui gène exogène (s) ont été introduites. Si l’expression d’un marqueur, comme GFP dans des cellules non-proliférantes peut être suivis pendant une longue période de temps, le signal se perd dans l’ordre dans les cellules en prolifération. Une illustration de cet effet est illustrée dans la Figure 1. Pour contourner la perdre l’empreinte des cellules transfe…

Discussion

Utilisant l’exo utero électroporation, nous avons déjà rapporté axée sur les siARN in vivo des analyses fonctionnelles de Atoh1 à un stade précoce des granules de cérébelleux cellulaire différenciation8. En raison de la dilution et la dégradation des siARN et l’exposition des embryons à l’extérieur de la paroi utérine, analyse phénotypique de l’électroporation microglies se limitait aux stades embryonnaires. Toutefois, la méthode actuelle activé analyse …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous apprécions Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim et Petra Schroeter pour l’assistance technique. Nous remercions également Drs K. Reifenberg, K. Dell et P. Prückl d’une aide précieuse pour l’expérimentation animale au DKFZ ; l’imagerie installations centrales le DKFZ et le centre de formation image de Carl Zeiss dans le DKFZ pour l’imagerie de la microscopie confocale. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (D.K.).

Materials

Alexa 488 Goat anti-Chicken ThermoFisher A11039 1:400 dilution
Alexa 568 Donkey anti-Mouse Life Technologies A-10037 1:400 dilution
Alexa 594 Donkey anti-Rabbit ThermoFisher A21207 1:400 dilution
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit Life Technologies A31573 1:400 dilution
Alkaline Phosphatase (FastAP) ThermoFisher EF0654
Autoclave band Kisker Biotech 150262
BamHI (HF) NEB R3136S
BbsI (FastDigest) ThermoFisher FD1014
Cellulose Filter Paper (Whatman) Sigma-Aldrich WHA10347525
Cloth Tork 530378
Confocal laser scanning microscope Zeiss LSM800
D-Luciferin biovision 7903-1
DAPI Sigma-Aldrich D9542 1:1000 dilution
Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) VWR 4566
DMEM Glutamax ThermoFisher 31966047
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
EcoRI (HF) NEB R3101S
Electro Square Porator BTX ECM830
Endofree Maxi Kit Qiagen 12362
Ethanol Merck 107017
Eye ointment (Bepanthen) Bayer 81552983
Fast Green Merck 104022
FBS ThermoFisher 10270-016
Filter (0.22 µm) Merck F8148
Fluorescent cell imager (ZOE) Biorad 1450031
Forceps straight Fine Science Tools 91150-20
Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) Fisher Scientific 15387311
GFP antibody Abcam ab13970 1:1000 dilution
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass Capillary with Filament Narishige GD1-2
Heating Pad ThermoLux 463265 / -67
Image Processing software (ImageJ and Fiji) NIH
Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) Carl Roth AKP0.1
Isoflurane Zoetis TU061219
IVIS Lumina LT Series III Caliper Perkin Elmer CLS136331
Kalt Suture Needles Fine Science Tools 12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix Kapa Biosystems KK2601
Ki67 antibody Abcam ab15580 1:500 dilution
Light Pointer Photonic PL3000
Liquid blocker pen Kisker Biotech MKP-1
Metamizol WDT
Microgrinder Narishige EG-45
Microinjector Narishige IM300
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Microscope software ZEN Zeiss
Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) Fine Science Tools 18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek) VWR 4583
p27 antibody BD bioscience 610241 1:200 dilution
Paraformaldehyde Roth 335.3
PBS (1x) Life Technologies 14190169
pCAG-EGxxFP Addgene 50716
Polyethylenimine Sigma-Aldrich 408727
pX330 plasmid Addgene 42230
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Quick Ligation Kit NEB M2200S
Ring Forceps Fine Science Tools 11103-09
Slides (SuperFrost) ThermoFisher 10417002
Software for biostatistics (Prism 7) GraphPad Software, Inc
Spitacid EcoLab 3003840
Stereomicroscope Nikon C-PS
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
Surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Surgical scissors with blunt tip Fine Science Tools 14072-10
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) SMI 220340
T4 DNA Ligation Buffer NEB B0202S
T4 PNK NEB M0201S
Tissue scissors Blunt (11.5 cm) Fine Science Tools 14072-10
TOP2B antibody Santa Cruz sc13059 1:200 dilution
Trypsin (2.5 %) ThermoFisher 15090046
Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum Xceltis GmbH CUY650P5
Vaporizer Drägerwerk AG GS186

References

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Citer Cet Article
Feng, W., Herbst, L., Lichter, P., Pfister, S. M., Liu, H., Kawauchi, D. CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer. J. Vis. Exp. (136), e57311, doi:10.3791/57311 (2018).

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