Summary

CRISPR-gemedieerde verlies van functie analyse in cerebellaire submodule cellen gebruiken In Utero Electroporation gebaseerde gentransfer

Published: June 09, 2018
doi:

Summary

Conventionele studies van de verlies-van-functie van genen met behulp van knock-out dieren zijn vaak kostbare en tijdrovende geweest. Electroporation gebaseerde CRISPR-gemedieerde somatische mutagenese is een krachtig hulpmiddel om te begrijpen gen functioneert in vivo. Wij rapporteren hier een methode voor het analyseren van de knock-out fenotypen in delende cellen van het cerebellum.

Abstract

Misvorming van de hersenen wordt vaak veroorzaakt door genetische mutaties. Ontcijferen van de mutaties in de patiënt-afgeleide weefsels geconstateerd mogelijke oorzakelijke factoren van de ziekten. Voor het valideren van de bijdrage van een dysfunctie van de gemuteerde genen voor de ontwikkeling van de ziekte, is de generatie van diermodellen uitvoering de mutaties een voor de hand liggende aanpak. Terwijl germline genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn populaire biologische tools en reproduceerbare resultaten vertonen, wordt beperkt door tijd en kosten. Ondertussen, niet-germline GEMMs inschakelen vaak verkennen genfunctie in een meer haalbare wijze. Sinds sommige hersenen ziekten (b.v., hersentumoren) lijken te leiden tot van somatische maar niet germline mutaties, niet-germline chimeer muismodellen, waarin naast de normale en abnormale cellen, nuttig voor ziekte-relevante analyse zou kunnen zijn. In deze studie rapporteren we een methode voor de inductie van CRISPR-gemedieerde somatische mutaties in het cerebellum. Specifiek, we gebruikt voorwaardelijke knock-in muizen, waarin Cas9 en GFP worden chronisch geactiveerd door de promotor van CAG (CMV versterker/kip ß-actine) na Cre-gemedieerde recombinatie van het genoom. De zelf ontworpen single-gids RNAs (sgRNAs) en de Cre recombinase volgorde, zowel gecodeerd in een enkele plasmide construct, werden geleverd in cerebellaire stam/voorlopercellen in een embryonaal stadium in utero electroporation gebruiken. Bijgevolg, transfected cellen en hun dochter cellen waren gemarkeerd met groen fluorescente proteïne (GFP), waardoor verdere fenotypische analyses. Vandaar, deze methode is niet alleen tonen gene electroporation gebaseerde levering in embryonale cerebellaire cellen maar ook voorstellen voor een nieuwe kwantitatieve benadering om te beoordelen van de CRISPR-gemedieerde verlies-van-functie fenotypen.

Introduction

Hersenziekten zijn een van de meest verschrikkelijke dodelijke ziekten. Ze gevolg vaak van genetische mutaties en latere disregulatie. Om te begrijpen van moleculaire mechanismen van hersenaandoeningen, hebben de ooit-blijvende inspanningen te ontcijferen van het genoom van menselijke patiënten een aantal mogelijke oorzakelijke genen ontdekt. Germline genetisch gemanipuleerde dierlijke modellen hebben tot nu toe gebruikt voor in vivo winst-van-functie (GOF) en verlies-van-functie (LOF) analyses van dergelijke kandidaat-genen. Als gevolg van de versnelde ontwikkeling van functionele validatieonderzoek, een meer haalbaar en flexibel in vivo gene assay systeem voor het bestuderen van genfuncties is wenselijk.

De toepassing van een in vivo electroporation gebaseerde gene transfersysteem aan de ontwikkelende hersenen van de muis is geschikt voor dit doel. In feite, hebben verscheidene studies met in utero electroporation hun potentieel functionele analyses in de ontwikkelende hersenen1,2,3uit te voeren aangetoond. Eigenlijk, zijn verscheidene gebieden van de hersenen van de muis, zoals de hersenschors4retina5, diencephalon6, hindbrain7, cerebellum8en ruggenmerg9 doelwit geweest door somatische gene levering benaderingen, tot nu toe.

Inderdaad, voorbijgaande genexpressie door in vivo electroporation op embryonale muis hersenen heeft lange tijd gebruikt voor GOF analyse. Recente genomic integratie transposon gebaseerde technologieën verder ingeschakeld op lange termijn en/of voorwaardelijke expressie van genen van belang10,11, die is het voordelig om te ontleden genfunctie in een ruimtelijke en temporele wijze tijdens ontwikkeling. In tegenstelling tot de GOF analyse, analyse van LOF geweest uitdagender. Terwijl voorbijgaande transfectie van siRNAs en shRNA-uitvoering plasmiden werd uitgevoerd, langetermijneffecten van LOF van genen niet worden gegarandeerd vanwege eventuele aantasting van de exogenously geïntroduceerde nucleic zuren, zoals plasmiden en dsRNAs. De CRISPR/Cas-technologie zorgt echter voor een doorbraak in LOF analyses. Genen coderend voor fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeldGFP) of bioluminescente eiwitten (bijvoorbeeldfirefly luciferase) hebben samen met CRISPR-Cas9 en sgRNAs op het etiket van de cellen die blootgesteld aan CRISPR-Cas9-gemedieerde somatische mutaties zijn transfected. Deze aanpak zou toch beperkingen in functionele studies op delende cellen, aangezien exogene markers zijn verdund en gedegradeerd na lange termijn proliferatie. Terwijl de transfected cellen en hun dochter cellen ondergaan CRISPR-geïnduceerde mutaties in hun genoom, misschien hun voetafdrukken na verloop van tijd de weg kwijt. Dus zou genetische labeling benaderingen geschikt zijn voor dit probleem.

Recent ontwikkelde we een CRISPR gebaseerde LOF methode in cerebellaire submodule cellen die op lange termijn proliferatie tijdens hun differentiatie12ondergaan. Om genetisch label transfected cellen, we gebouwd een plasmide uitvoering van een sgRNA samen met Cre en het plasmide in de cerebella van Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP muizen13 gebruiken in utero electroporation geïntroduceerd. In tegenstelling tot regelmatige plasmide vectoren EGFP codering, deze aanpak met succes met het label transfected submodule neuron precursoren (BNP) en de cellen van hun dochter. Deze methode biedt veel steun bij het begrijpen van in vivo functie van genen van belang in de delende cellen in de ontwikkeling van de normale hersenen en een tumor-naar voren gebogen achtergrond.

Protocol

Alle dierproeven verliepen dierenwelzijn reglementeringen en zijn goedgekeurd door de verantwoordelijke autoriteiten (Regierungspräsidium Karlsruhe, erkenningsnummers: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 en G133/14). 1. het genereren van pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmiden Het ontwerp van de sgRNA te richten op een gen-of-interest volgens de eerder gepubliceerde protocol14.Opmerking: In dit experiment, twee sgRNAs zijn ontworpen om het richten van de muis Top2b</…

Representative Results

Voor in vivo functionele analyse is het cruciaal voor het identificeren van de cellen waarin exogene gene(s) bijgekomen. Terwijl de expressie van een markering, zoals GFP in niet-prolifererende cellen kan worden gevolgd-up voor een lange periode van tijd, het signaal sequentieel verdwaalt in delende cellen. Een illustratie van dit effect wordt geïllustreerd in Figuur 1. Om te omzeilen de voetafdruk van transfected cellen in LOF analyses verliezen, o…

Discussion

Met behulp van exo utero electroporation, hebben we eerder gemeld op basis van siRNA in vivo functionele analyses van Atoh1 in een vroeg stadium voor cerebellaire granule cel differentiatie8. Als gevolg van siRNA verdunning/afbraak en blootstelling van embryo’s buiten de baarmoederwand was fenotypische analyse van de cellen van de submodule electroporated beperkt tot de embryonale stadia. Analyse van het fenotype van postnatale dieren is echter de huidige methode ingeschakeld.</p…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij waarderen Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim en Petra Schroeter voor technische bijstand. Wij danken ook Drs. K. Reifenberg, K. Dell en P. Prückl voor nuttige bijstand voor dierproeven op DKFZ; de Imaging Core faciliteiten van de DKFZ en de Carl Zeiss Imaging Center in de DKFZ voor confocale microscopie imaging. Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (DK).

Materials

Alexa 488 Goat anti-Chicken ThermoFisher A11039 1:400 dilution
Alexa 568 Donkey anti-Mouse Life Technologies A-10037 1:400 dilution
Alexa 594 Donkey anti-Rabbit ThermoFisher A21207 1:400 dilution
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit Life Technologies A31573 1:400 dilution
Alkaline Phosphatase (FastAP) ThermoFisher EF0654
Autoclave band Kisker Biotech 150262
BamHI (HF) NEB R3136S
BbsI (FastDigest) ThermoFisher FD1014
Cellulose Filter Paper (Whatman) Sigma-Aldrich WHA10347525
Cloth Tork 530378
Confocal laser scanning microscope Zeiss LSM800
D-Luciferin biovision 7903-1
DAPI Sigma-Aldrich D9542 1:1000 dilution
Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) VWR 4566
DMEM Glutamax ThermoFisher 31966047
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
EcoRI (HF) NEB R3101S
Electro Square Porator BTX ECM830
Endofree Maxi Kit Qiagen 12362
Ethanol Merck 107017
Eye ointment (Bepanthen) Bayer 81552983
Fast Green Merck 104022
FBS ThermoFisher 10270-016
Filter (0.22 µm) Merck F8148
Fluorescent cell imager (ZOE) Biorad 1450031
Forceps straight Fine Science Tools 91150-20
Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) Fisher Scientific 15387311
GFP antibody Abcam ab13970 1:1000 dilution
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass Capillary with Filament Narishige GD1-2
Heating Pad ThermoLux 463265 / -67
Image Processing software (ImageJ and Fiji) NIH
Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) Carl Roth AKP0.1
Isoflurane Zoetis TU061219
IVIS Lumina LT Series III Caliper Perkin Elmer CLS136331
Kalt Suture Needles Fine Science Tools 12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix Kapa Biosystems KK2601
Ki67 antibody Abcam ab15580 1:500 dilution
Light Pointer Photonic PL3000
Liquid blocker pen Kisker Biotech MKP-1
Metamizol WDT
Microgrinder Narishige EG-45
Microinjector Narishige IM300
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Microscope software ZEN Zeiss
Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) Fine Science Tools 18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek) VWR 4583
p27 antibody BD bioscience 610241 1:200 dilution
Paraformaldehyde Roth 335.3
PBS (1x) Life Technologies 14190169
pCAG-EGxxFP Addgene 50716
Polyethylenimine Sigma-Aldrich 408727
pX330 plasmid Addgene 42230
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Quick Ligation Kit NEB M2200S
Ring Forceps Fine Science Tools 11103-09
Slides (SuperFrost) ThermoFisher 10417002
Software for biostatistics (Prism 7) GraphPad Software, Inc
Spitacid EcoLab 3003840
Stereomicroscope Nikon C-PS
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
Surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Surgical scissors with blunt tip Fine Science Tools 14072-10
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) SMI 220340
T4 DNA Ligation Buffer NEB B0202S
T4 PNK NEB M0201S
Tissue scissors Blunt (11.5 cm) Fine Science Tools 14072-10
TOP2B antibody Santa Cruz sc13059 1:200 dilution
Trypsin (2.5 %) ThermoFisher 15090046
Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum Xceltis GmbH CUY650P5
Vaporizer Drägerwerk AG GS186

References

  1. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  2. Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
  3. Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
  4. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  5. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
  6. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
  7. Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
  8. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
  9. Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
  10. Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
  11. Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
  12. Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
  13. Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  14. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  15. Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  16. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
  18. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
  19. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
  20. Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
check_url/fr/57311?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Feng, W., Herbst, L., Lichter, P., Pfister, S. M., Liu, H., Kawauchi, D. CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer. J. Vis. Exp. (136), e57311, doi:10.3791/57311 (2018).

View Video