ТРИФОСФАТЫ опосредованной потери функции анализа в мозжечковой грануле клеток с помощью в утробе матери на основе электропорации перенос генов
Summary
Обычные потери функции исследования генов с помощью маскирования животных часто были дорогостоящим и трудоемким. Электропорация основанный ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутагенеза является мощным инструментом, чтобы понять, что ген функционирует в естественных условиях. Здесь мы приводим метод для анализа нокаут Фенотипы пролиферирующих клеток мозжечка.
Abstract
Пороки развития головного мозга часто является причиной генетических мутаций. Расшифровка мутации в тканях пациента производный выявила потенциальные причинных факторов заболеваний. Чтобы проверить вклад дисфункции мутировавших генов для развития болезни, поколения животных моделей, перевозящих мутации — один очевидный подход. Хотя микрофлорой генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) являются популярных биологических средств и воспроизводимые результаты, он ограничен по времени и расходов. Между тем не микрофлорой GEMMs часто позволяют изучить функции гена более осуществимым образом. Поскольку некоторые мозга заболевания (например, опухоли головного мозга), как представляется, в результате соматических но не герминальных мутаций, не микрофлорой химерных мыши модели, в которой сосуществуют нормальных и ненормальных клеток, может быть полезным для болезни значимого анализа. В этом исследовании мы приводим метод для индукции ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутаций в мозжечке. В частности, мы использовали условное стук в мышей, в которых Cas9 GFP хронически активизируются и промоутер CAG (ЦМВ усилитель/курица ß миозина) после Cre-опосредованной рекомбинации генома. Самостоятельно разработанные сингл руководство РНК (sgRNAs) и Cre рекомбиназа последовательности, оба закодированы в одной плазмидные конструкции, были доставлены в мозжечковой стволовых/прогениторных клеток на эмбриональном этапе с помощью электропорации в утробе матери . Следовательно Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), способствуя тем самым далее фенотипические анализы были помечены transfected клеток и их дочь клетки. Следовательно этот метод не только показаны доставки на основе электропорации гена в эмбриональных клеток мозжечка, но предлагает также Роман количественный подход к оценке ТРИФОСФАТЫ опосредованной фенотипов потери функции.
Introduction
Заболевания головного мозга являются одним из самых страшных смертельной болезни. Они часто являются результатом генетических мутаций и последующей регуляции. Чтобы понять молекулярные механизмы заболеваний головного мозга, когда-либо прочного усилия расшифровать геном человека пациентов обнаружили ряд возможных причинных генов. До настоящего времени микрофлорой генетически модифицированные Животные модели были использованы в естественных условиях получить из функции (Гоф) и потери функции (LOF) анализ генов такого кандидата. Из-за ускоренного развития функциональной проверки исследований желательно более осуществимым и гибкие в vivo гена пробирного систему для изучения функции гена.
Применение системы передачи на основе электропорации гена в естественных условиях на развивающийся мозг мыши подходит для этой цели. В самом деле несколько исследований, с использованием в утробе матери электропорации показали свой потенциал для проведения функционального анализа в развивающегося мозга1,2,3. На самом деле несколько регионов мозга мыши, например коре4, сетчатки5, таламус6, задний мозг7, мозжечок8и спинного9 были мишенью соматическая генная доставки подходы, пока.
Действительно выражение переходных гена путем электропорации в естественных условиях на мозги эмбриона мыши уже давно используется для GOF анализа. Последние технологии на основе transposon геномной интеграции далее включены долгосрочные и/или условное выражение генов интерес10,11, который выгодно чтобы вскрыть функции гена на основе пространственных и временных во время развития. В отличие от GOF анализ анализ LOF была более сложной. Хотя была выполнена переходных трансфекции малые интерферирующие РНК и перевозящих индуцируемый плазмид, долгосрочные последствия LOF генов не гарантируется из-за возможной деградации экзогенно введено нуклеиновых кислот, таких как плазмидов и двуцепочечных РНК. Однако ТРИФОСФАТЫ/Cas технология обеспечивает прорыв в LOF анализы. Гены, кодирующие флуоресцентных белков (например, GFP) или биолюминесцентных белков (например, Светлячок Люцифераза) были совместно transfected ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и sgRNAs для обозначения клетки подвергаются ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной соматических мутаций. Тем не менее этот подход может иметь ограничения в функциональных исследований пролиферирующих клеток, так как разбавленный и деградированных после долгосрочного распространения экзогенных маркерных генов. В то время как transfected клеток и их дочь клетки претерпевают ТРИФОСФАТЫ индуцированной мутации в их геном, их следы могут заблудиться со временем. Таким образом генетических меток подходов будет подходящим для преодоления этой проблемы.
Мы недавно разработали метод основанный ТРИФОСФАТЫ LOF в клетках мозжечковой гранул, которые проходят долгосрочного распространения во время их дифференциации12. Генетически маркировать transfected клеток, мы построен плазмида, перевозящих sgRNA вместе с КРР и введены плазмида cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мышей13 с помощью электропорации в утробе матери . В отличие от обычных плазмида векторов кодирования EGFP, этот подход успешно помечены грануле transfected нейрон прекурсоров (ВНП) и их дочь клетки. Этот метод обеспечивает большую поддержку в понимании в естественных условиях функции генов интерес в пролиферирующих клеток в развитие нормального мозга и опухоли подверженных фон.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью электропорации exo внутриутробно , мы уже ранее сообщали, что на основе малых интерферирующих РНК в vivo функциональный анализ Atoh1 на ранней стадии мозжечковой гранулы ячейки дифференцировки8. Из-за малых интерферирующих РНК разрежения/деградации и воздейс…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы ценим Лаура Sieber, Анна Нойербург, Ясин Harim и Петра Шретер для оказания технической помощи. Мы также благодарим Drs. K. Райфенберг, K. Dell и P. Prückl за полезную помощь для экспериментов на животных в DKFZ; Imaging основной зал DKFZ и Carl Zeiss изображений центра в DKFZ для воображения confocal микроскопии. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft, ка 4472/1-1 (д.к.).
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
