Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes
Summary
Estudios convencionales de pérdida de función de genes knockout animales han sido a menudo costoso y desperdiciador de tiempo. Basada en la electroporación CRISPR-mediada mutagénesis somática es una poderosa herramienta para entender gen funciona en vivo. Aquí, Divulgamos un método para analizar los fenotipos de nocaut en la proliferación de las células del cerebelo.
Abstract
Malformación cerebral es causada a menudo por mutaciones genéticas. Descifrar las mutaciones en los tejidos derivados del paciente ha identificado posibles factores causales de las enfermedades. Para validar el aporte de una disfunción de los genes mutados para desarrollo de la enfermedad, la generación de modelos animales que las mutaciones es un enfoque obvio. Germinales genéticamente modificados modelos de ratón (GEMMs) son populares herramientas biológicas y exhiben resultados reproducibles, es restringido por el tiempo y los costos. Mientras tanto, no del germline GEMMs a menudo permiten explorar funciones de los genes de una manera más factible. Desde un cerebro enfermedades (p. ej., tumores cerebrales) parecen resultar de somático pero no las mutaciones del germline, modelos de ratón quimérico no germinales, en el que coexisten células normales y anormales, pueden ser útiles para el análisis de enfermedades relevantes. En este estudio, Divulgamos un método para la inducción de mutaciones somáticas CRISPR-mediada en el cerebelo. Concretamente, utilizamos el condicionales knock-en ratones, en el que Cas9 y GFP son crónicamente activados por el promotor de CAG (CMV potenciador de pollo ß-actina) después de Cre-mediada por recombinación del genoma. El solo diseño-guía RNAs (sgRNAs) y la secuencia de recombinase de Cre, ambas codificadas en una único plásmido construcción, fueron entregados en las células progenitoras cerebelosa en un estado embrionario con electroporación en el útero . Por lo tanto, células transfected y su hija fueron etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP), facilitando así mayores análisis fenotípicos. Por lo tanto, este método no sólo mostrando entrega basada en la electroporación del gene en células embrionarias cerebelosas sino que también propone un nuevo enfoque cuantitativo para evaluar fenotipos de pérdida de función CRISPR-mediada.
Introduction
Enfermedades cerebrales son una de las más terribles enfermedades mortales. A menudo resultan de mutaciones genéticas y dysregulation posterior. Para entender los mecanismos moleculares de las enfermedades del cerebro, eterno intento descifrar los genomas de pacientes humanos ha descubierto un número de genes causativos posibles. Hasta ahora, se han utilizado modelos animales genéticamente modificado de germline en vivo ganar-de-función (GOF) y análisis de la pérdida de funciones (LOF) de tales genes candidatos. Debido al acelerado desarrollo de los estudios de validación funcional, es deseable un más flexible y factible en vivo gene sistema de ensayo para estudiar la función genética.
La aplicación de un sistema de transferencia en vivo basada en la electroporación gene en el cerebro de ratón en desarrollo es conveniente para este propósito. De hecho, varios estudios mediante electroporación en el útero han demostrado su potencial para llevar a cabo análisis funcionales en el cerebro en desarrollo1,2,3. En realidad, han sido objeto de varias regiones del cerebro del ratón, tales como la corteza cerebral4retina5, diencéfalo6, cerebelo7, cerebelo8y médula espinal9 por genes somáticos enfoques, hasta la fecha.
De hecho, expresión génica transitoria por electroporación en vivo en cerebros de ratón embrionario ha sido utilizada para el análisis de fibra optica. Recientes tecnologías de integración genómica basada en transposones más permitido a largo plazo o condicional expresión de genes de interés10,11, que es ventajoso para disecar la funciones de los genes de una manera espacial y temporal durante desarrollo. En contraste con el análisis de fibra optica, análisis LOF ha sido más difícil. Si bien se realizaron transitorios de la transfección de plásmidos portadores de shRNA y siRNAs, efectos a largo plazo de LOF de los genes no están garantizadas debido a la eventual degradación de ácidos nucleicos exógeno introducidos, tales como plásmidos y dsRNAs. Sin embargo, la tecnología CRISPR/Cas proporciona una brecha en el análisis LOF. Genes que codifican proteínas fluorescentes (p. ej., GFP) o proteínas bioluminiscentes (p. ej., luciferasa de la luciérnaga) han sido co transfected con Cas9 CRISPR y sgRNAs a las células expuestas a CRISPR-Cas9-mediada por mutaciones somáticas de la etiqueta. Sin embargo, este enfoque podría tener limitaciones en los estudios funcionales en células proliferantes, puesto que genes marcadores exógenos son diluidos y degradados después de la proliferación a largo plazo. Mientras que las células transfected y sus células hijas sufren mutaciones inducidas por CRISPR en sus genomas, sus huellas pueden perderse con el tiempo. Así, enfoques Etiquetadoras genéticos sería convenientes resolver este problema.
Recientemente se desarrolló un método LOF CRISPR basado en células de gránulo cerebeloso que experimentan proliferación a largo plazo durante su diferenciación12. Para la etiqueta genéticamente las células transfected, construyó un plásmido lleva un sgRNA junto con Cre e introduce el plásmido en el cerebelo de ratones de Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP13 mediante electroporación en el útero . A diferencia de los vectores del plasmid regular codificación EGFP, este enfoque etiquetados con éxito transfected gránulos precursores de neuronas (SPNG) y sus células hijas. Este método proporciona gran ayuda en la comprensión en vivo la función de los genes de interés en células proliferantes en el desarrollo normal del cerebro y un tumor propensos a fondo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mediante electroporación de exo el útero , previamente hemos informado siRNA basado en vivo análisis funcionales de Atoh1 en una etapa temprana del gránulo cerebeloso de la célula diferenciación8. Debido a la disolución o degradación del siRNA y la exposición de embriones fuera de la pared uterina, análisis fenotípico de las células del gránulo de electroporated se limitaba a estadios embrionarios. Sin embargo, el método actual permitieron el análisis del fenotipo …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim y Petra Schroeter para asistencia técnica. También agradecemos a los Drs. K. Reifenberg, Prückl P. y K. Dell ayuda útil para los experimentos con animales en el DKFZ; la imagen núcleo instalaciones del DKFZ y el centro de la proyección de imagen de Carl Zeiss en el DKFZ proyección de imagen de microscopía confocal. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (D.K.).
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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