Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada
Summary
Estudos convencionais de perda-de-função de genes usando animais nocaute foram frequentemente dispendioso e demorado. Baseado em Electroporation mutagênese mediada por CRISPR somática é uma ferramenta poderosa entender gene funciona em vivo. Aqui, nós relatamos um método para analisar os fenótipos de nocaute nas células em proliferação do cerebelo.
Abstract
Malformação do cérebro é frequentemente causada por mutações genéticas. Decifrar as mutações nos tecidos derivados de paciente identificou potenciais fatores causais das doenças. Para validar a contribuição de uma disfunção dos genes mutantes para o desenvolvimento da doença, a geração de modelos animais carregando as mutações é uma abordagem óbvia. Enquanto germline geneticamente modelos do rato (GEMMs) são populares ferramentas biológicas e apresentam resultados reprodutíveis, é restrito pelo tempo e custos. Entretanto, GEMMs não-germline frequentemente permitem explorar função do gene de uma forma mais viável. Desde o cérebro algumas doenças (por exemplo, tumores cerebrais) aparecem como resultado de somático mas não germline mutações, modelos de não-germline quimérico do rato, em que coexistem células normais e anormais, podem ser útil para análise de doenças relevantes. Neste estudo, nós relatamos um método para a indução de mutações somáticas CRISPR-mediada no cerebelo. Especificamente, utilizamos o condicionais bater-em camundongos, no qual Cas9 e GFP são cronicamente ativado pelo promotor CAG (CMV realçador/frango ß-actina) após Cre-mediada recombinação do genoma. O single-guia auto-concebidos RNAs (sgRNAs) e a sequência de recombinase Cre, ambos codificados em um plasmídeo único construto, foram entregues em células tronco/progenitoras cerebelar numa fase embrionária usando eletroporação no útero . Consequentemente, células transfectadas e suas células-filhas foram rotuladas com proteína verde fluorescente (GFP), facilitando ainda mais as análises fenotípicas. Portanto, este método é não só mostrando entrega baseada em electroporation gene em células embrionárias Cerebelares mas também propõe uma nova abordagem quantitativa para avaliar mediada por CRISPR fenótipos de perda-de-função.
Introduction
Doenças do cérebro são uma das mais terríveis doenças mortais. Muitas vezes resultam de mutações genéticas e desregulação subsequente. Para entender os mecanismos moleculares de doenças cerebrais, eterno esforços para decifrar os genomas dos pacientes humanos descobriram um número de genes causadores potenciais. Até agora, modelos animais germline geneticamente modificado têm sido utilizados para na vivo ganho-de-função (GOF) e perda de função (LOF) análises de tais genes candidatos. Devido ao acelerado desenvolvimento de estudos de validação funcional, um mais viável e flexível na vivo gene ensaio sistema para estudar a função dos genes é desejável.
A aplicação de um sistema de transferência de gene electroporation-baseado na vivo para o cérebro de rato em desenvolvimento é apropriada para esta finalidade. Na verdade, vários estudos utilizando no utero electroporation mostraram seu potencial para realizar análises funcionais no desenvolvimento cerebral1,2,3. Na verdade, várias regiões do cérebro do rato, tais como o córtex cerebral4retina5, diencéfalo6, rombencéfalo7, cerebelo8e medula espinhal9 têm sido alvo de entrega genética somática abordagens, até agora.
De fato, expressão do gene transitória por eletroporação na vivo no cérebro de rato embrionárias tem sido muito utilizado para análise GOF. Recentes tecnologias de integração de genômica transposon-baseado mais habilitado a longo prazo e/ou condicional a expressão de genes de interesse10,11, que é uma vantagem para dissecar a função dos genes de uma forma espacial e temporal durante desenvolvimento. Em contraste com a análise do GOF, análise LOF tem sido mais difícil. Enquanto transfection transiente de siRNAs e plasmideos shRNA de transporte realizou-se, a longo prazo efeitos de LOF dos genes não são garantidos devido à eventual degradação dos ácidos nucleicos exogenamente introduzidas, como plasmídeos e dsRNAs. No entanto, a tecnologia CRISPR/Cas fornece uma quebra-através de análises LOF. Genes que codificam proteínas fluorescentes (por exemplo, as boas práticas agrícolas) ou proteínas bioluminescentes (por exemplo, luciferase de vaga-lume) tem sido co transfected com CRISPR-Cas9 e sgRNAs para rotular as células expostas a mutações somáticas CRISPR-Cas9-mediada. No entanto, esta abordagem pode ter limitações em estudos funcionais em pilhas proliferating, desde genes marcadores exógenos são diluídos e degradados após proliferação a longo prazo. Enquanto as células transfectadas e suas células-filhas passam por mutações induzidas pelo CRISPR em seus genomas, suas pegadas podem se perder ao longo do tempo. Assim, abordagens genéticas de rotulagem seria adequadas para superar esse problema.
Recentemente desenvolvemos um método LOF CRISPR-baseado em células grânulo cerebelar que se submetem a proliferação de longo prazo durante sua diferenciação,12. Para rotular geneticamente as células transfectadas, temos construído um plasmídeo carregando um sgRNA juntamente com Cre e introduzido o plasmídeo a cerebella de Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP de ratos13 usando no utero electroporation. Ao contrário dos vetores de plasmídeo regular codificação EGFP, essa abordagem com êxito rotulado grânulo transfectado precursores do neurônio (PNB) e suas células-filhas. Este método fornece grande apoio na compreensão função in vivo de genes de interesse nas células em proliferação no desenvolvimento normal do cérebro e um fundo propensas a tumor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando o exo utero electroporation, anteriormente informamos siRNA-baseado na vivo funcional análises de Atoh1 numa fase precoce do grânulo cerebelar celular diferenciação8. Devido à diluição de siRNA/degradação e exposição de embriões fora da parede uterina, análise fenotípica das células grânulo electroporated limitou-se a estágios embrionários. No entanto, o método atual habilitado para análise do fenótipo dos animais pós-natal.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim e Petra Schroeter para assistência técnica. Agradecemos também os Drs K. Reifenberg, K. Dell e P. Prückl de assistência úteis para experiências com animais em DKFZ; o Imaging Core instalações da DKFZ e centro de imagiologia de Carl Zeiss no DKFZ para a imagem latente de microscopia confocal. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (D.K.).
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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