CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して
Summary
ノックアウト動物を用いた遺伝子の機能喪失従来は、高価で時間のかかる多くの場合されています。CRISPR 媒介体細胞突然変異誘発のエレクトロポレーション ベースは遺伝子の生体内の機能を理解するための強力なツールです。小脳の細胞増殖にノックアウトの表現型を解析する手法を報告する.
Abstract
脳の奇形はしばしば遺伝の突然変異によって引き起こされます。解読患者由来組織の突然変異は病気の潜在的な原因となる要因を識別しています。発病する変異遺伝子の機能不全の貢献度を検証するため、突然変異を運ぶ動物モデルの生成はわかりやすいアプローチの 1 つです。生殖細胞系遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) 人気のある生物学的ツールと再現性のある結果を展示、それは時間とコストによって制限されています。一方、非生殖 GEMMs は、しばしばより現実的な方法で探索の遺伝子機能を有効にします。いくつかの脳から体に起因する病気 (例えば、脳腫瘍) が見えて、ない生殖細胞系突然変異、非生殖細胞キメラ マウス モデル、正常と異常な細胞が共存疾患関連する分析のために有用かもしれない。本研究では、小脳に CRISPR 媒介体細胞突然変異の誘導法を報告します。具体的には、利用条件付きノックアウトのマウス、 Cas9とGFPの慢性的なアクティブ化するCAG (CMV エンハンサー/鶏 β-アクチン) プロモーターでCre後-ゲノムの組換えを介した。自己設計されていたシングル ガイド Rna (sgRNAs) と単一プラスミド構築でエンコードされた両方 Cre リコンビナーゼ シーケンスは、子宮内でエレクトロポレーションを使用して萌芽期の段階で小脳幹/前駆細胞に渡されました。その結果、transfected セルおよびその娘細胞は緑色蛍光タンパク質 (GFP) ため、さらに表現型解析が容易で付けられました。したがって、このメソッドは、胚性小脳細胞へのエレクトロポレーション法による遺伝子導入を示すだけでなく、また CRISPR 媒介機能喪失の表現型を評価する定量的手法を提案します。
Introduction
脳疾患は、最も恐ろしいの致命的な病気の一つです。彼らはしばしば起因遺伝的変異とその後破綻。脳疾患の分子機構を理解するには、人間の患者のゲノムを解読する永遠に続く努力は、潜在的な原因となる遺伝子の数を発見しました。これまでのところ、体内の利得の機能 (GOF) とそのような候補者の遺伝子の機能喪失 (LOF) 解析の生殖細胞系遺伝子組み換え動物モデルが利用されています。機能検証研究の加速の開発によりより実現可能で柔軟な生体内遺伝子アッセイ系遺伝子の機能を研究するためお勧めします。
マウス脳の発達する生体内でエレクトロポレーションを用いた遺伝子伝達システムのアプリケーションは、この目的に適しています。実際、子宮内エレクトロポレーションを使用していくつかの研究は、発展途上の脳1,2,3の機能解析を行うことの可能性を示しています。実際には、マウスの脳、大脳皮質4網膜5間脳6、7菱脳、小脳8脊髄9などのいくつかの地域は、体細胞の遺伝子導入による対象となっています。これまでアプローチ。
確かに、マウス萌芽期の脳に生体内でエレクトロポレーションによる一時的な遺伝子発現は GOF 分析のため長い間使用されています。さらに最近のトランスポゾンを用いたゲノム統合技術有効利息10,11, 遺伝子の長期および/または条件式中に空間的で、一時的な方法で遺伝子機能を解剖に有利であります。開発。GOF 解析と対照をなして LOF 分析は難しくされています。Sirna と shRNA 運ぶプラスミドのトランスフェクションが実行されますが、外因に導入された核酸、プラスミドなど二本の最終的な劣化による遺伝子の LOF の長期効果は保証されません。ただし、LOF 解析におけるブレークスルー CRISPR/Cas 技術を提供します。蛍光蛋白質 (例えばGFP) または (例えばホタルのルシフェラーゼ) の発光タンパク質をコードする遺伝子は、CRISPR Cas9 と sgRNAs CRISPR Cas9 媒介体細胞突然変異の細胞をラベルする co transfected されて持っています。それにもかかわらず、このアプローチ制限機能研究では増殖細胞外因性マーカー遺伝子を希釈し、長期的な増殖後低下するので。Transfected セルおよびその娘細胞は、CRISPR による突然変異、ゲノムを受ける中、彼らの足跡を時間をかけて失われて得るかもしれない。したがって、遺伝的ラベリングのアプローチはこの問題を克服するために適当でしょう。
我々 は最近、分化12長期的な増殖を受ける小脳顆粒細胞における CRISPR ベース LOF 方式を開発しました。遺伝子 transfected セルにラベルを付ける、 Creと共に sgRNA を運ぶプラスミドを構築し、Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP マウス13 子宮内エレクトロポレーションを用いた小脳にプラスミドを導入します。異なり、通常のプラスミッドのベクトルは EGFP をエンコード、このアプローチ ラベル付け transfected 顆粒ニューロン前駆体 (GNPs) とその娘細胞。このメソッドは、通常の脳の発達と腫瘍が発生しやすい背景における増殖細胞に興味の遺伝子の生体内で機能を理解する上で素晴らしいサポートを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
Exo 子宮エレクトロポレーションを使用すると、以前 siRNA ベースは生体内での機能解析 Atoh1 小脳顆粒の初期の段階で細胞分化8を報告した.SiRNA 希釈/劣化と子宮壁外胚の露出のため electroporated 顆粒細胞の表現型の分析は、胚の段階に限られていた。ただし、現在のメソッドは生後動物の表現型の分析を有効にします。
私たちの以前の研究を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
テクニカル サポートにローラ ジーバー、アンナ Neuerburg、ヤシン ハリムとペトラ, を申し上げます。我々 もありがとう夫妻・ k ・ Reifenberg、k. デル、P. Prückl DKFZ; で動物実験の支援イメージング コアの施設、DKFZ とカール ツァイス イメージング センター、DKFZ 共焦点顕微鏡画像。この作品は、ドイツ研究振興協会、KA 4472/1-1 (に称えられ) によって支えられました。
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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