CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri
Summary
Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.
Abstract
Beyin malformasyonu kez tarafından genetik mutasyonlar neden olur. Hasta elde edilen dokular mutasyonların deşifre olası etken faktörleri hastalıkları tespit etti. İşlev bozukluğu hastalığı geliştirme mutasyona uğramış genler katkısını doğrulamak için mutasyon taşıyan hayvan modellerin üretimi bir açık yaklaşım. Genetik olarak germline iken fare modelleri (GEMMs) popüler biyolojik araçlardır ve tekrarlanabilir sonuçlar sergi, zaman ve maliyeti ile sınırlıdır. Bu arada, Sigara germline GEMMs kez daha uygun bir şekilde keşfetmek gen işlevini etkinleştirin. Bazı beyin beri hastalıklar (Örn, beyin tümörleri) üzerinden somatik neden gibi görünüyor ama değil germline mutasyonlar, Sigara germline chimeric fare modelleri, hangi normal ve anormal hücreleri bir arada, hastalık ilgili analiz için yararlı olabilir. Bu çalışmada, beyincik bedensel mutasyonlar CRISPR-aracılı indüksiyon için bir yöntemi bildirin. Özellikle, hangi Cas9 ve GFP kronik aktif CAG (CMV artırıcı/tavuk β-aktin) düzenleyici tarafından Cresonra koşullu çakma fareler, kullanılan-aracılı rekombinasyon genom kopyası. Kendini tasarlanmış tek-Kılavuzu RNA’ların (sgRNAs) ve Cre recombinase sıra, hem bir tek plazmid yapı kodlanmış serebellar kök/progenitor hücre içine rahim içinde Elektroporasyon kullanarak bir embriyonik aşamada teslim edildi. Sonuç olarak, transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri böylece daha fazla fenotipik analizleri kolaylaştırmak yeşil flüoresan protein ile (GFP), etiketli. Bu nedenle, bu yöntem sadece Elektroporasyon tabanlı gen teslim embriyonik serebellar hücrelere gösterilen ama ayrıca CRISPR-aracılı işlev kaybı fenotipleri değerlendirmek için yeni bir kantitatif yaklaşım öneriyor.
Introduction
Beyin hastalıkları en korkunç ölümcül hastalıklardan biri vardır. Onlar genellikle genetik mutasyonlar ve sonraki bozukluk sonucu. Moleküler mekanizmalar beyin hastalıkları anlamak için şimdiye kadar süren çabaları insan hasta genleri deşifre için potansiyel sorumlu genlerin bir dizi keşfettim. Şimdiye kadar genetik olarak germline hayvan modelleri vivo içinde kazanç–fonksiyonu (GOF) ve işlev kaybı (LOF) analizleri gibi aday gen için kullanılan. Fonksiyonel doğrulama çalışmaları hızlandırılmış gelişimi nedeniyle, gen işlevi okuyan bir daha uygun ve esnek vivo içinde gen tahlil arzu edilen sistemdir.
Vivo Elektroporasyon tabanlı gen aktarım sistemi uygulamaya gelişmekte olan fare beyin bu amaç için uygundur. Aslında, rahim içinde Elektroporasyon kullanarak çeşitli çalışmalar gelişmekte olan beyin1,2,3fonksiyonel analizler yapmak için potansiyel göstermiştir. Aslında, fare beynin korteksinin4, retina5, diencephalon6, arka beyin7, beyincik8ve spinal kord9 gibi birden fazla bölge somatik gen teslim tarafından hedef almış yaklaşımlar, öylesine uzakta.
Nitekim, geçici gen ekspresyonu vivo içinde Elektroporasyon embriyonik fare beyin üzerinde tarafından uzun GOF analiz için kullanılmıştır. Son transposon dayalı genomik tümleştirme teknolojileri daha fazla gen işlevi sırasında kayma ve zamansal bir şekilde incelemek için avantajlı olan uzun vadeli ve/veya koşullu ifade faiz10,11, genlerin etkin geliştirme. GOF Analizi aksine, LOF analiz daha zor oldu. Çift ve shRNA taşıyan plazmidlerin geçici transfection gerçekleştirildi iken, genlerin LOF uzun vadeli etkileri plazmit ve dsRNAs gibi exogenously tanıttı nükleik asitleri nihai bozulması nedeniyle garanti edilmez. Ancak, LOF analizlerde aracılığıyla bir ara CRISPR/CA teknolojisi sağlar. Floresan proteinler (Örneğin, GFP) veya kollarındaki proteinler (Örneğin, ateş böceği luciferase) kodlama genler ile CRISPR-Cas9 ve sgRNAs CRISPR-Cas9-aracılı somatik mutasyon maruz hücreleri etiketlemek için ortak transfected. Eksojen marker gen seyreltilmiş ve uzun vadeli yayılması sonra bozulmuş beri bununla birlikte, bu yaklaşım sınırlamalar fonksiyonel çalışmalar Proliferasyona hücreleri üzerinde olabilir. Transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri onların genleri CRISPR kaynaklı mutasyonların tabi iken, onların ayak izleri zamanla kayıp alabilirsiniz. Böylece, genetik etiketleme yaklaşımlar bu sorunu aşmak için uygun olacak.
Son zamanlarda onların farklılaşma12sırasında uzun vadeli yayılması geçmesi serebellar granül hücre CRISPR tabanlı LOF yönteminde geliştirdik. Transfected hücrelerin genetik olarak etiketlemek için bir sgRNA Cre ile birlikte taşıyan bir plazmid inşa ve plazmid rahim içinde Elektroporasyon kullanarak Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP fareler13 cerebella tanıttı. EGFP kodlama düzenli plazmid vektörel çizimler bu yaklaşım başarıyla nöron öncüleri (GNPs) transfected granül etiketli ve onların kızı hücreleri. Bu yöntem vivo içinde işlev ilgi normal beyin gelişimi ve tümör eğilimli bir arka plan Proliferasyona hücrelerinde genlerin anlamada büyük destek sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exo utero Elektroporasyon kullanarak, daha önce Atoh1 in vivo siRNA tabanlı fonksiyonel analizleri serebellar granül erken bir aşamada farklılaşma8hücre bildirdin. SiRNA seyreltme/bozulma ve embriyoların rahim duvarı dışında maruz kalma nedeniyle, fenotipik analiz electroporated granül hücre embriyonik aşamada sınırlıydı. Ancak, geçerli yöntem postnatal hayvanların fenotip analizini etkin.
Bizim önceki çalışma tümör baskıla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laura Sieber, Anna Neuerburg, yasin Harim ve Petra Schroeter teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Drs. K. Reifenberg, K. Dell ve P. Prückl DKFZ, hayvan deneyleri için yararlı yardım için teşekkür ederiz; Imaging Core tesislerinde DKFZ ve Carl Zeiss görüntüleme Merkezi DKFZ confocal mikroskobu görüntüleme için. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (dk) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
