CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동
Summary
녹아웃 동물을 사용 하 여 유전자의 손실의 기능 연구를 기존의 자주 비용과 시간이 많이 소요 되었습니다. CRISPR 중재 체세포 mutagenesis Electroporation 기반 유전자에 vivo기능을 이해 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 소 뇌의 세포 증식에 녹아웃 고기를 분석 하는 방법을 보고 합니다.
Abstract
뇌 기형은 유전자 변이 의해 발생 합니다. 환자 유래 조직에 돌연변이 해독 하는 것은 질병의 잠재적인 원인이 되는 요인을 확인 했다. 질병 발전에 돌연변이 유전자의 기능 장애의 기여의 유효성을 검사 하는 돌연변이 운반 하는 동물 모델의 생성 한 명백한 접근 이다. 생식 유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)는 인기 생물 학적 도구 및 재현성 결과 전시, 시간 및 비용에 의해 제한 된다. 한편, 비 생식 GEMMs 종종 더 실현 가능한 방식으로 탐험 유전자 함수를 사용합니다. 이후 일부 뇌 질환 (예, 뇌종양) 체세포에서 발생할 나타나지만 하지 생식 돌연변이, 비 생식 공상 마우스 모델, 정상 및 비정상 세포가 공존, 질병 관련 분석에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 소 뇌에 체세포 돌연변이 CRISPR 중재의 유도 하는 방법을 보고합니다. 특히, 우리는 조건부 노크에 마우스는 Cas9 그리고 GFP 는 만성 활성화 CAG (CMV 증강/치킨 ß-말라) 발기인 Cre후 활용-중재 하는 게놈의 재결합. 자체 디자인된 단일-가이드 RNAs (sgRNAs)와 모두 단일 플라스 미드 구문에서 인코딩된 Cre recombinase 시퀀스, electroporation utero에서 를 사용 하 여 배아 단계에서 소 뇌 줄기/시 조 세포로 전달 되었다. 따라서, transfected 세포와 딸 세포 그들의 phenotypic 분석 더 촉진 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 했다. 따라서,이 방법은 뿐만 아니라 보여주는 electroporation 기반 유전자 배아 소 뇌 세포로 전달 하지만 CRISPR 중재 기능 손실 고기를 평가 하는 새로운 양적 접근 방식을 제안.
Introduction
뇌 질환 가장 무서운 인간의 질병 중 하나입니다. 그들은 유전자 변이 후속 dysregulation에서 수시로 유래한 다. 뇌 질환의 분자 메커니즘을 이해 하기 인간의 환자의 게놈 해독 영원한 노력 잠재적인 원인이 유전자의 수를 발견 했습니다. 지금까지 생식 유전자 조작 동물 모델 vivo에서 이득-의-(GOF) 기능과 같은 후보 유전자의 기능 손실 (LOF) 분석에 대 한 이용 되어 있다. 기능 유효성 검사 연구의 가속된 발달 때문에 더 가능 하 고 유연한 vivo에서 유전자 분석 결과 대 한 시스템 유전자 기능을 공부 하 고 바람직합니다.
개발 쥐의 뇌에는 vivo에서 유전자 electroporation 기반 전송 시스템의 응용 프로그램은이 목적에 적합 합니다. 사실, electroporation utero에서 를 사용 하 여 여러 연구 개발 두뇌1,2,3기능 분석을 그들의 잠재력을 보여왔다. 사실, 마우스 뇌의 대뇌 피 질4, 망막5, diencephalon6, hindbrain7,8, 소 뇌 및 척수9 등의 여러 지역 체세포 유전자 전달에 의해 표적이 되었고 지금까지 접근 한다.
실제로, vivo에서 electroporation 배아 마우스 두뇌에 의해 일시적인 유전자 발현은 오래 GOF 분석을 위해 사용 되었습니다. 최근 게놈 통합 transposon 기반 기술을 더 사용 관심10,11, 유전자의 장기 및/또는 조건부 식은 동안 공간 및 시간적으로 유전자 기능을 해 부에 유리 개발입니다. GOF 분석, 달리 LOF 분석 더 도전 하고있다. ShRNA 들고 플라스 미드 siRNAs의 과도 transfection를 수행 하는 동안 LOF 유전자의 장기 효과 플라스 미드 등 dsRNAs 것 소개 된 핵 산의 최종 저하로 인해 보장 되지 않습니다. 그러나, CRISPR/Ca 기술을 LOF 분석 통해 휴식을 제공합니다. 인코딩 형광 성 단백질 (예를 들어, GFP) 또는 (예를 들어, 반딧불 luciferase) 발광 단백질 유전자와 CRISPR-Cas9 sgRNAs CRISPR Cas9 중재 하는 체세포 돌연변이에 노출 하는 셀을 공동 페 되어 있다. 그럼에도 불구 하 고,이 방법은 한계에에서 있을 기능 연구 확산 셀에 exogenous 마커 유전자 희석 장기 확산 후 저하 때문. Transfected 세포와 그들의 딸 세포 그들의 게놈에서 돌연변이 CRISPR 유도 받 다, 하는 동안 시간이 지남에 그들의 발자국 손실 얻을 수 있습니다. 따라서, 유전자 표기 방법이이 문제를 극복 하기 위해 적합 한 것입니다.
우리는 최근 자신의 차별화12동안 장기 확산을 받아야 하는 소 뇌과 립 세포에 CRISPR 기반 LOF 방법을 개발. 유전자는 transfected 세포 레이블을, 우리는 Cre 함께 sgRNA를 들고 플라스 미드를 건설 하 고 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 마우스13 electroporation utero에서 를 사용 하 여 cerebella에 플라스 미드를 도입. 일반 플라스 미드 벡터 EGFP 인코딩, 달리이 방법을 성공적으로 표시 transfected과 립 신경 선구자 (GNPs)와 그들의 딸 세포. 정상적인 두뇌 개발 및 종양 발생 배경에서 증식 세포의 유전자의 기능 vivo에서 이해에 큰 지원을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
엑 소 utero electroporation 사용 하 여, 우리는 이전 비보에 siRNA 기반 기능 분석 Atoh1의 소 뇌과 립의 초기 단계에서 세포 감 별 법8보고 했습니다. SiRNA 희석/저하 및 배아 자 궁 벽 외부의 노출, phenotypic 분석 electroporated과 립 세포의 배아 단계에 국한 되었다. 그러나, 현재 메서드는 출생 후 동물의 표현 형의 분석을 사용할 수 있습니다.
우리의 이전 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 기술 지원에 대 한로 라 Sieber, 애 나 Neuerburg, 야신 하림, 그리고 페트라 Schroeter 주셔서 감사합니다. 우리 또한 DKFZ; 동물 실험에 대 한 유용한 지원 박사 K. Reifenberg, K. 델, P. Prückl 감사 합니다. 이미징 핵심 시설은 DKFZ와 칼 Zeiss 이미징 센터는 DKFZ에 confocal 현미경 이미징. 이 작품은 도이치 가운데, 카 4472/1-1 (대표이사)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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