Summary
Общая цель этой статьи заключается в стандартизации протокол для изоляции, характеристика и дифференциации сердечной стволовых клеток (ПОК) от сердца взрослого мыши. Здесь мы описываем метод градиентного центрифугирования плотность изоляции мышиных пок и разработаны методы для культуры CSC, пролиферации и дифференцировки в кардиомиоцитов.
Abstract
Инфаркт миокарда (MI) является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Основная цель регенеративной медицины является пополнить мертвых миокарда после MI. Хотя несколько стратегий были использованы для регенерации миокарда, терапия стволовой клетки остается основной подход к пополнить мертвых миокард ми сердца. Накапливая доказательства предполагает наличие резидентов сердца стволовых клеток (CSCs) в сердце взрослого человека и их эндокринной системы и/или паракринными воздействие на сердца регенерации. Однако CSC изоляции и их характеристика и дифференциации сторону клетки миокарда, особенно кардиомиоцитов, остается технической проблемой. В настоящем исследовании мы предоставили простой метод для изоляции, характеристика и дифференциации CSCs от сердца взрослого мыши. Здесь мы описываем плотность градиентного метода для изоляции пок, где сердце переваривается 0,2% раствором коллагеназы II. Чтобы охарактеризовать изолированных пок, мы оценивали выражение CSCs/сердечная маркеров Sca-1, NKX2-5 и GATA4, и плюрипотентности/stemness маркеры OCT4, SOX2 и Nanog. Мы также определяется потенциал распространения изолированных CSCs выращивание их в чашку Петри и оценки выражения маркер распространения Ki-67. Для оценки возможности дифференциации пок, мы выбрали семь - десять дней культивированный пок. Мы передали их новая табличка с средством дифференциации cardiomyocyte. Они инкубируют в инкубатор культуры клеток на 12 дней, в то время как средний дифференциация меняется каждые три дня. Дифференцированные CSCs Экспресс cardiomyocyte специфических маркеров: актинина и тропонина I. Таким образом CSCs изолированных с настоящего Протокола имеют stemness и сердечной маркеры, и они имеют потенциал для пролиферации и дифференцировки сторону cardiomyocyte линии.
Introduction
Ишемическая болезнь сердца, включая инфаркт миокарда (MI), является одной из основных причин смерти во всем мире1. Клеточная терапия для регенерации мертвых миокарда остается основной подход к улучшению функции сердца ми сердца2,3,4,5. Различные типы стволовых клеток были использованы для пополнения мертвых миокарда и для улучшения сердечной функции сердца ми. Они могут быть широко распределены эмбриональные стволовые клетки6 и взрослых стволовых клеток. В взрослых стволовых клеток были использованы различные типы стволовых клеток, таких как мононуклеарных клеток костного мозга, полученных7,8, мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга9,10, жировой ткани 11,12и13пуповины и CSCs14,15. Стволовые клетки могут способствовать регенерации сердца через эндокринной системы и/или ответные действия16,17,18,19,20. Однако одним из основных ограничений стволовых клеток является получение достаточное количество стволовых клеток, которые могут размножаться и/или дифференцировать к конкретным сердечной линии21,22. Трансплантация аутологичных и аллогенных стволовых клеток является важной задачей в клеточной терапии9. Пок может быть лучшим подходом для сердца регенерации, потому что они являются производными от сердца, и они могут быть более легко продифференцированы в сердечной линий чем non сердечная стволовых клеток. Таким образом это уменьшает риск тератома. Кроме того эндокринной и паракринными эффекты пок, такие как exosomes и адаптивной, производный от пок, может быть более эффективным, чем другие типы стволовых клеток. Таким образом CSCs остается лучшим вариантом для сердца регенерации23,24.
Хотя CSCs лучшего кандидата для сердца регенерации в ми сердца вследствие их сердечного происхождения, одним из основных ограничений с CSCs является меньше урожайности ввиду отсутствия метода эффективной изоляции. Другое ограничение может быть нарушением дифференцировки CSCs сторону кардиомиоцитов lineage2,25,,2627. Чтобы обойти эти ограничения, важно разработать эффективный протокол для изоляции, характеристика и дифференциации к сердечной линии CSC. Существует без одного приемлемого маркер для CSCs и конкретных клетк поверхности на основе маркера изоляции CSCs дает меньше пок. Здесь мы стандартизировать подход простой градиентного центрифугирования изолировать CSCs от мыши сердца, что является экономически эффективным и приводит к увеличению урожайности пок. Эти изолированные CSCs могут быть выбраны для конкретных клетк поверхности маркеры активации флуоресценции клеток короткое замыкание. Помимо изоляции пок мы предоставили протокол для культуры, характеристика и дифференциации к cardiomyocyte линии CSC. Таким образом мы представляем элегантный способ изоляции, характеризуют, культура и дифференцировать CSCs от сердца взрослого мыши (рис. 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Корпус, анестезии и жертву мышей были выполнены после утвержденного протокола IACUC медицинского центра Университета Небраски.
1. материалы
- Использование 10 - до 12-недельных C57BL/6J черный самцов мышей, держал доме на объекте институциональных животных, для изоляции CSCs. CSCs может также быть изолированы от не беременных самок мышей.
- Стерилизовать всех необходимых хирургических инструментов, включая Ножницы хирургические, тонкой хирургические ножницы, щипцы изогнутые хвостовика и хирургическое лезвие, автоклавирования их до эвтаназии мыши.
- Подготовить CSC изоляции буферов в стерилизованные состоянии и сохранять их на 4 ° C на льду. Эти буферы включают polysucrose и раствор diatrizoate натрия, с учетом плотности 1,077 г/мл, неполной Дульбекко изменение средних орла, 1 x ветчина сбалансированного солевого раствора (HBSS) и мобильных культуры класс 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Подготовьте 1% коллагеназы II Стоковый раствор (фильтруются и стерилизации) и рабочий раствор 0,2% в HBSS.
- Хранить материалы культуры ткани в стерилизованные состояние в области биобезопасности кабинета, включая Петри 10-мм, 6-ну пластина, плита 24-Ну, T-25 и T-75 культуры колбы, 15 мл и 50 мл конические трубы и одноразовые Серологические Пипетки с 40 мкм и 100 -мкм ячейки сита с фильтрами 0,22 мкм.
- Стерилизуйте 10-мкл, 200 мкл и 1000 мкл наконечники в автоклаве.
- Чтобы сохранить стерильном состоянии на протяжении всего эксперимента используйте нитриловые перчатки и 70% этиловом спирте.
- Отбеливать 10% как дезинфицирующее средство.
- Используйте коммерчески доступных CSC обслуживания среднего и кардиомиоцитов дифференциации среднего для культуры и дифференциация пок, соответственно.
2. изоляция метод сердечной стволовых клеток
- Усыпить взрослого самца четыре или пять (или небеременных женщин) мышей, используя камеру CO2 . Исправьте каждую мышь оружия на отдельном рассечение картон с булавки или липкой ленты.
- Spray 70% этанол на мыши, чтобы избавиться от внешних микробов и поддерживать состояние стерилизованные во время уборки сердца. Сделать надрез с ножницами в середине живота и вырезать кожу от живота до грудной клетки в прямой линии. Снимите кожу с обеих сторон от средней вырезать, чтобы очистить брюшной области кожи и волос. С помощью ножницы и щипчики, вырезать диафрагмы ниже грудной клетки.
- Откройте грудной полости мыши путем разрезания грудной клетки внутри вытяжки. Подвергать сердце и удалить крови рядом с центром. Вымойте окрестности сердца с ледяной PBS избавиться от любой крови районе сердца.
- Вскрыть сердца, используя хирургические ножницы и щипчики. Место сердце в чашке Петри 100-мм, содержащие 10 мл ледяной PBS.
- Пульсируют сердца, используя щипцы изогнутые хвостовика и удаления остатков крови внутри сердца.
- Используйте весь сердца для изоляции пок.
- Передать все четыре или пять всего сердца 50 мл Конические трубки, содержащие 10 мл ледяной HBSS. Держите трубку на льду до дальнейшей обработки.
- Протрите внутри и за пределами биобезопасности кабинета с 70% этанола для создания стерилизовать среды. Стерилизуйте сердце содержащие трубы и другие необходимые материалы с 70% этиловом спирте. Поместите сердце содержащих трубки в биобезопасности кабинета для дальнейшей обработки.
- Трансфер сердца в чашке Петри 100-мм, содержащие 10 мл ледяной HBSS. Снова помойте сердца, ощупывание для удаления любых остатков крови внутри сердца. Измените решение HBSS после каждого мытья, чтобы обеспечить полное удаление крови.
- Вырежьте сердца на мелкие кусочки с помощью тонкой Ножницы хирургические или хирургическое лезвие в чашке Петри 100-мм, содержащие 5-7 мл раствора HBSS. Держите каждого сердца с парой щипцов и использовать пару Ножницы хирургические штрафа или хирургическое лезвие сердце нарезать 2 - 4 мм. Измените решение HBSS часто обеспечить HBSS крови бесплатно. Фарш сердца в HBSS решения.
- Центрифуга фарш из ткани на 500 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и держать гранулы.
- Ресуспензируйте гранулы в 5-6 мл 0,2% раствора II коллагеназы в 50-мл Конические трубки. Объем раствора коллагеназы должен быть почти 1,5 - 2 раза объема гранулы.
Примечание: для переваривания ткани, 0,2% коллагеназы, я и 2,5 U/мл dispase раствора можно заменить 0,2% коллагеназы II. Используйте почти равное количество dispase решения коллагеназы я решение. - Тщательно перемешайте гранулы с 0,2% раствор II коллагеназы, агитируя трубки или качалка трубку на шейкер на 75 x g 45-60 минут при 37 ° C. Встряхните трубки вручную через каждые 20-30 мин для повышения lysis.
- Нарезанных лизированных тканей смеси с помощью Пипетки серологические 5 мл и наконечник пипетки в 1-мл отмежеваться кусок ткани в одноклеточных подвеска.
Примечание: Для получения максимального восстановления пок, нарезанных лизис микс по крайней мере 5 минут. Если относительно большие куски ткани, Отрежьте кончик кончика пипетки 1 мл с ножницами или хирургическое лезвие и использовать его для Тритурация. - Остановите ферментативные lysis ткани, добавив коммерчески доступных среднего обслуживания CSC. Добавьте почти 2-3 x столько обслуживания среднего объема лизированных тканей на шаге 2.14.
- Передайте суспензию переваренной клеток через стрейнер ячейки 100 мкм для удаления любых кусочки непереваренной ткани.
- Повторите шаг 2.16 с помощью стрейнер клетки 40 мкм.
- Отдельные клетки через плотность градиентного центрифугирования. Для разделения клетки аккуратно наложение равный объем фильтрата над polysucrose и натрия diatrizoate раствор. Например, во-первых, добавить 20 мл раствора натрия и polysucrose diatrizoate в 50-мл Конические трубки, а затем, добавить 20 мл фильтрата из шага 2.17 над polysucrose и натрия diatrizoate раствор.
Примечание: Prewarm polysucrose и раствор diatrizoate натрия при 37 ° C, прежде чем использовать с клетками. Добавьте фильтрата из шага 2.17 над polysucrose и натрия diatrizoate раствор очень тщательно и медленно во избежание любого смешивания двух решений. Это считается важным шагом. - Центрифуга трубка, содержащая оба решения на 500 x g 20 мин при комнатной температуре с помощью центрифуги ведро качели. Установите центрифуги на более низкой скорости ускорение и замедление, чтобы избежать смешивания двух решений и для надлежащего разделения пок. Это важный шаг в CSC изоляции. Положите трубка, содержащая градиентной смеси очень медленно без беспорядков внутри центрифуги и установите его для центрифугирования.
- Примите вне Баффи пальто наряду с дополнительное решение от верхнего слоя с помощью пипетки 1 мл или Пластиковая пипетка Пастера в трубу стерилизовать 15 мл. Этот Баффи слой будет содержать пок.
Примечание: Принять дополнительные меры предосторожности во время закупорить Баффи пальто не принимать вне на polysucrose и натрия diatrizoate раствор слой, потому что он является токсичным для CSCs. - Добавить равный объем CSC обслуживания среды суспензию клеток из шага 2.20 и смешайте его правильно для нейтрализации остаточных polysucrose и натрия diatrizoate раствор, если он присутствует.
- Центрифуга выше суспензию клеток на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
- Ресуспензируйте гранулы в 7-10 мл неполной DMEM среды и центрифуги на 500 x g 5 мин при 4 ° C, чтобы избавиться от любых остатков polysucrose и раствор diatrizoate натрия.
- Соберите Пелле, который содержит очищенного пок.
- Ресуспензируйте гранулы в 1 мл CSC обслуживания среды, определения числа CSC и использовать таблетки для культуры. Для подсчета числа CSC, используйте Трипановый синий окрашивание и Горяева. С четырех самцов мышей сердца урожайность ПОК-~1.8 млн.
- С 0,02% раствора желатина, содержащий 0,5% фибронектин покрытием семян пок в пластине 6-ну культуры. Использование 2 мл полного обслуживания среды для посева. Инкубируйте пластину культуры в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2.
- Замените среднего культуры CSCs полного среднего обслуживания CSC каждый день до третьего дня. После этого изменения среды на разные дни.
- Определите рост пок, наблюдая их под микроскопом.
3. Культура обслуживания и прохождение сердечной стволовых клеток
- Культура изолированных пок в коммерчески доступных обслуживания среде. Замените свежие содержание среднего питательной среды на разные дни. Когда культура CSC достиг confluency, передайте CSCs новой пластины с покрытием с желатином и фибронектин, как указано в шаге 2.26. Отсоедините культивировали пок, буфер диссоциации ферментативные клетки. Следуйте стандартным протоколом диссоциации клеток от плиты культуры. На данном этапе CSCs рассматриваются на проход 0 (P0) стадии.
- CSCs P0 культуры в новой желатина и фибронектин покрытием плиты в полной CSC обслуживания среде при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора, позволяют им быть вырожденная, а затем следуйте шаг 3.1 для того чтобы получить проход 1 (P1) пок. магазин P1 пок в жидком азоте или использовать их для experi заявлениями.
- Семя 0,5 миллиона клеток в 6-ну плиту или 1 миллион клеток в T-25 поддерживать культуру КБК на ее начальном этапе.
- Проход пок, когда они становятся притока 85% - 90%. Пок может быть культивировали в средстве обслуживания до четырех до шести недель.
Примечание: Держите первоначального посева плотность CSCs относительно высокой (40% - 50%), потому что, на более низкую плотность посева, CSCs может измениться их морфологии для плоских и удлиненные.
4. характеристика сердечной стволовых клеток
- Характеризовать культивировали пок, наблюдать их под ФАГ контраст или микроскопом ярко поле. Поместите CSC-содержащие пластину на цели флуоресцентный Микроскоп. Задайте масштаб довольно низкий (10 X) сосредоточиться клетки. Используйте диафрагмы фазово контрастной соблюдать клетки. Увеличить масштаб до 20 X, изменив объектива образ CSCs. увеличение цель 40 X и изображения пок. В течение двух дней CSCs появляются почти круглой формы, но размер ячейки увеличивается с течением времени и в течение семи дней, CSCs появляются почти цилиндрической формы (рис. 1а - 1 C).
- Выполнить иммуноокрашивания пок с маркерами плюрипотентности/stemness (OCT4, SOX2 или Nanog), распространение (Ki-67) (рисунок 2A - 2D) и сердечного происхождения/прогениторных клеток (Sca-1, NKX2-5 или GATA4) (рис. 3а - 3 C).
- Для иммуноокрашивания пок семян 10000 пок в пластине 24-ну культуры.
- На следующий день (после 18-24 ч), исправьте пок в 300 мкл параформальдегида 4% за 10 мин.
- Вымойте CSCs с 500 мкл ледяной PBS, 3 x с интервалом 5-мин.
- Разрушения CSCs с 300 мкл 0,2% Тритон X-100 разводят в PBS в 10 мин.
- Вымойте CSCs с 500 мкл ледяной PBS, 3 x с интервалом 5-мин.
- Выполнять блокирование CSCs с 300 мкл 1% BSA, разбавленных в PBST (PBS + 0.1% 20 анимации) или 300 мкл 10% нормальной курица сыворотку разводят в PBST за 1 час.
- Инкубировать пок в 200 мкл основное антитело, разбавленный преграждая разрешение на ночь при 4 ° C. Разбавьте основное антитело как рекомендованный таблицы антител или по стандартизации.
- Вымойте CSCs с 500 мкл ледяной PBS, 3 x с интервалом 5-мин.
- Инкубировать пок в 200 мкл вторичные антитела, разбавляют в блокировании решение (см. шаг 4.2.6) за 1 ч при комнатной температуре. Разбавьте вторичные антитела, как рекомендованный таблицы антител или по стандартизации.
- Вымойте CSCs с 500 мкл ледяной PBS, 3 x с интервалом 5-мин.
- Counterstain пок с 200 мкл DAPI (1 мкг/мл) разводят в PBS в течение 5 мин.
- Вымойте CSCs 1 x с 500 мкл ледяной PBS. Затем добавьте 300 мкл ледяной PBS в каждой скважине.
- Выполнение визуализации с помощью микроскопа флуоресценции. Следуйте инструкциям флуоресцентных изображений, таким образом, чтобы избежать прямой свет на плите. Держите пластину культуры под микроскопом. Фокус ячейки при различных увеличениях. Наблюдать за клетки под фазово контрастной и возбуждения различные фильтры и сохранить изображения.
- Магазин пластину в темноте при 4 ° C.
5. дифференцировка сердца стволовых клеток в Cardiomyocyte
- Для дифференциации пок семян 500000 пок в 6-ну плита с 2 мл prewarm (37 ° C) коммерчески доступных CSC обслуживания среды.
- Инкубировать пластину, содержащие пок в инкубатор CO2 при 37 ° C. Разрешить CSCs для присоединения и размножаться до югу вырожденная роста. Если носитель желтеет, замените свежие содержание среднего питательной среды.
- В 85-90% confluency, заменить средство обслуживания 2 мл prewarm (37 ° C) кардиомиоцитов дифференциации среднего. Инкубируйте пластину в инкубатор CO2 при 37 ° C до 2-3 недель.
- Изменение среднего дифференциации, каждые 2-3 d. наблюдать CSCs морфология под микроскопом каждый раз во время среднего изменения для обеспечения надлежащей культуры условий.
- После 12 d в средних дифференциации CSC культуры изображение CSCs для дифференциации маркеры после стандартного иммуноокрашивания протокола (см. шаги 4.2.1 - 4.2.14). Сохраните флуоресцентного изображения для выражения кардиомиоцитов маркеров (рис. 4A - 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящем исследовании мы изолированы CSCs от 10 до 12-week-old сердец самцов мышей C57BL/6J. Здесь мы представили простой метод для изоляции CSC и характеристик с использованием маркеров плюрипотентности. Мы также представили изящный метод дифференциации CSC и характеристика пок, которые различаются к линии кардиомиоцитов. Мы наблюдали шпинделя форму морфология 2 - для 3-дней культивированный CSCs под микроскопом фазово контрастной (рис. 1A и 1B). Мы обнаружили, что изменение в морфологии CSCs 7 дней культуры в среде обслуживания, во время которого стволовые клетки становятся удлиненными (рис. 1 c). Мы характеризуется CSCs для маркеров плюрипотентности и обнаружил, что они выражают OCT4, SOX2 и Nanog (рисунок 2A - 2 C). Мы также обнаружили, что CSCs размножаться в культурной среде и выразить маркер распространения Ki-67 (Рисунок 2D). Для характеристики сердечного происхождения пок, мы определили выражения сердечной маркеров Sca-1, NKX2-5 и GATA4 в пок. Мы нашли выражение сердца маркеров в культивированный пок (Рисунок 3А - 3 C). Чтобы определить дифференциация CSCs сторону cardiomyocyte линии, мы культивировали пок в cardiomyocyte дифференциации среднего за 12 дней. После 12 дней, мы imaged дифференцированной CSCs cardiomyocyte маркеры актинина и тропонина I. Мы наблюдали, что cardiomyocyte маркеров были выражены в дифференцированных пок (Рисунок 4A - 4B). В целом эти результаты показывают, что мы успешно изолированные CSCs от сердца мыши и что эти CSCs может размножаться и дифференцировать к линии кардиомиоцитов.
Рисунок 1: морфология культивировали CSCs. Эти панели показывают фазово контрастной визуализации культивировали пок, а именно представитель CSCs после 2 дней культивирования в среде обслуживания (A1) 20 X и (А2) 40 X цели, представитель CSCs после 3 дней культивирования в среде обслуживания ( B1) 20 X и цели (B2) 40 X и представитель CSCs после 7 дней культивирования в среде обслуживания (C1) 20 X и целей (C2) 40 X. Масштаб бары находятся 100 мкм для 40 X увеличениях и 200 мкм для 20 X увеличениях.
Рисунок 2: характеристика CSCs для плюрипотентности маркеров. Эти панели показывают представитель флуоресценции изображений культивированный CSCs для маркеров плюрипотентности (OCT4, SOX2 и Nanog) и распространения (Ki-67). Панели A показывают выражения OCT4 (зеленый) и DAPI (синий) в ПОК в (A1) 20 X и увеличениях (А2) 40 X. Панелей B Показать выражения SOX2 (зеленый) и DAPI (синий) в ПОК (B1) 20 X и увеличениях (B2) 40 X. Панели C Показать выражения Nanog (зеленый) и DAPI (синий) в ПОК в (C1) 20 X и увеличениях (C2) 40 X. Панели D показывают выражения Ki-67 (красный) и DAPI (синий) в ПОК в (D1) 20 X и увеличениях (D2) 40 X. Масштаб бары находятся 100 мкм для 40 X увеличениях и 200 мкм для 20 X увеличениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: характеристика CSCs для сердца маркеров. Эти панели показывают представитель флуоресценции изображений культивированный CSCs для сердца маркеров. Панели A показывают выражения Sca-1 (красный) и DAPI (синий) в ПОК в (A1) 20 X и увеличениях (А2) 40 X. Панели B Показать выражения NKX2-5 (зеленый) и DAPI (синий) в ПОК (B1) 20 X и увеличениях (B2) 40 X. Панелей C Показать выражения GATA4 (красный) и DAPI (синий) в ПОК в (C1) 20 X и увеличениях (C2) 40 X. Масштаб бары находятся 100 мкм для 40 X увеличениях и 200 мкм для 20 X увеличениях.
Рисунок 4: характеристика дифференциации CSC к линии cardiomyocyte. Эти панели показывают представитель фазово контрастной и флуоресценции изображений 12-дней продифференцировано CSCs. (A) этой панели отображается выражение cardiomyocyte маркер актинина в дифференцированной пок, с (a) образ фазы контракт, (b ) флуоресценции образ DAPI (окрашивание ядро), (c) флуоресценции образ актинина (зеленый) и (d) объединенное изображение панели - c. Увеличениях являются 40 X. (B) Эта группа показывает выражение cardiomyocyte маркер тропонин я в дифференцированной пок, с () фазы контракт изображения, (b) флуоресценции DAPI (окрашивание ядро), (c) флуоресценции изображение тропонин I (зеленый) и (d) объединенного изображения из панелей - c. Увеличениях являются 40 X. Масштаб бары находятся 100 мкм для 40 X увеличениях и 200 мкм для 20 X увеличениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Схематическое представление различных этапов CSC изоляции, культуры и дифференциация. Мы использовали хирургически удалены сердца от четырех до пяти взрослых мышей для изоляции пок. Поэтапный процесс изоляции CSC, культуры и дифференциации сторону кардиомиоцитов линий представлены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ниже приводятся критические шаги настоящего Протокола изоляции CSC. 1) условие стерилизованные должна поддерживаться для извлечения сердца от мышей. Любое загрязнение во время извлечения сердце может повлиять на качество пок. 2) крови должна быть полностью удалена до измельчения сердце, которое осуществляется несколько моек всего сердца и сердца штук с HBSS решения. 3) части сердца должны полностью лизированы в одной ячейки подвеска с коллагеназы решения. 4) polysucrose и натрия diatrizoate градиент решение для разделения клетки должны быть prewarmed. 5) средство для CSC культуры должны быть prewarmed. 6) слияния CSCs во время посева в культуры блюдо должно быть высоким, потому что, в низкой confluency, пок может изменить их морфологии. 7 номер CSC следует забил после изоляции от всего сердца и перед покрытием в культуры блюдо. Количество CSCs показывает эффективность изоляции от всего сердца. Подсчет CSCs имеет важное значение для посева пок в пластину культуры.
Мы использовали взрослых мышей изолировать пок, используемые другими исследователями в грызунов модели23,28. Пок могут быть изолированы от новорожденных грызунов сердца29,30 и даже биопсия сердца человека31. Протоколы изоляции сообщалось ранее CSC имеют некоторые ограничения, такие как меньше доходности, комплекс изоляции процедуры, длительность для дифференциации и менее cardiomyocyte дифференциация потенциальных32,33, 34. Протокол изоляции CSC, представленные здесь проста: она занимает меньше времени и является экономически эффективным и более эффективным в CSC урожайности. Кроме того, изолированные пок, Sca-1+ ve (общепринятых маркер для мыши CSCs) (1A1 цифры - 3 c 2). Для дифференциации пок другие протоколы нужно три-четыре недели35,36. Однако этот протокол требует 12 дней (цифры 4A - 4B). Градиентного центрифугирования изоляции на основе CSC представленные здесь дает ~1.8 миллион CSCs от сердца четырех самцов мышей.
Хотя доходность CSCs является высоким, ограничение этого протокола является единообразие и чистоту изолированных пок. Потому что нет ни одного приемлемого маркер для CSCs, трудно использовать маркер single клетк поверхности для выбора пок. Однако CSCs изолируются этот протокол может использоваться для получения единообразных населения пок, основанный на конкретных маркер или несколько маркеров пок, используя флуоресценции активированный ячейку сортировку. Таким образом этот метод изоляции CSC экономически с высоким выходом и имеет возможность получить равномерное CSC населения, основанные на конкретных клетк поверхности marker(s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается, в частях, национальные институты здравоохранения грантов HL-113281 и HL116205 пункты Кумар Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
