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Chemistry

उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण द्वारा एक Rhodopsin परिवहन परख

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58703
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh, 2McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

Summary

यहां, हम रेटनाइटिस pigmentosa के साथ जुड़े rhodopsin म्यूटेंट के परिवहन को यों तो एक उच्च सामग्री इमेजिंग विधि वर्णित है । एक बहु-तरंग दैर्ध्य स्कोरिंग विश्लेषण सेल सतह पर या पूरे सेल में rhodopsin प्रोटीन यों तो इस्तेमाल किया गया था ।

Abstract

Rhodopsin खुलासा उत्परिवर्तनों रॉड photoreceptor मौत है कि autosomal प्रमुख रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी), एक प्रगतिशील चकाचौंध रोग है कि प्रभावी उपचार की कमी के रूप में प्रकट होता है के लिए सीसा । हम परिकल्पना कि cytotoxicity rhodopsin उत्परिवर्ती का खुलासा औषधीय उत्परिवर्ती rhodopsin प्रोटीन स्थिर द्वारा समाप्त किया जा सकता है । P23H उत्परिवर्तन, अंय वर्ग द्वितीय rhodopsin उत्परिवर्तनों के बीच, एक संरचनात्मक अस्थिर rhodopsin उत्परिवर्ती प्रोटीन है कि endoplasmic जालिका (एर) में जमा है, जबकि जंगली प्रकार rhodopsin स्तनधारी में प्लाज्मा झिल्ली को ले जाया जाता है encodes कक्षों. हमने पहले एक luminescence आधारित उच्च प्रवाह स्क्रीन (HTS) का प्रदर्शन किया और औषधीय chaperones के एक समूह की पहचान की जो ईआर से प्लाज्मा झिल्ली तक P23H rhodopsin के परिवहन को बचाया । यहां, एक immunostaining एक उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण के बाद विधि का उपयोग कर, हम quantified उत्परिवर्ती rhodopsin प्रोटीन राशि पूरे सेल में और प्लाज्मा झिल्ली पर । इस विधि जानकारीपूर्ण और प्रभावी HTS निंनलिखित झूठी सकारात्मक से सच हिट की पहचान है । इसके अतिरिक्त, उच्च सामग्री छवि विश्लेषण के लिए हमें एक ही प्रयोग से एक से अधिक मापदंडों को बढ़ाता है प्रत्येक यौगिक के औषधीय गुणों का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम होना चाहिए । इस परख का प्रयोग, हम छह आरपी संबद्ध rhodopsin म्यूटेंट की ओर 11 विभिंन यौगिकों के प्रभाव का विश्लेषण, इन rhodopsin म्यूटेंट की संरचनात्मक स्थिरता के बारे में एक मात्रात्मक और गुणात्मक समझ के लिए एक 2 डी औषधीय प्रोफ़ाइल प्राप्त करने और इन म्यूटेंट के प्रति विभिन्न यौगिकों की प्रभावकारिता.

Introduction

प्रोटीन खुलासा मांसपेशियों dystrophy में शामिल है, तंत्रिका अध..., साथ ही साथ अंधा कर रही बीमारियों, रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी)1सहित । आरपी एक विरासत और प्रगतिशील रेटिना अध... समारोह और रॉड photoreceptors या रेटिना pigmented उपकला (RPEs)2,3के homeostasis को प्रभावित करने के ६० से अधिक जीन में उत्परिवर्तनों के साथ जुड़े है । कोई प्रभावी उपचार वर्तमान में आरपी के लिए उपलब्ध है । Rhodopsin उत्परिवर्तनों autosomal प्रमुख (विज्ञापन) आरपी मामलों के बारे में 25-30% के लिए खाते । अधिक से अधिक १५० rhodopsin उत्परिवर्तनों4 (मानव जीन उत्परिवर्तन डाटाबेस, http:/www. hgmd. cf. ac. यूके/), द्वितीय श्रेणी के उत्परिवर्तनों rhodopsin प्रोटीन है कि रॉड photoreceptor मौत के लिए योगदान के संरचनात्मक अस्थिरता का कारण है और दृष्टि हानि5,6,7,8। P23H उत्तरी अमेरिका में सबसे अधिक बार rhodopsin उत्परिवर्तन है, जो भी कक्षा द्वितीय rhodopsin उत्परिवर्तनों9,10का एक विशिष्ट उदाहरण है । अपने निहित संरचनात्मक अस्थिरता के कारण, rhodopsin स्तनधारी कोशिकाओं में endoplasmic जालिका (एर) में संचित है, जबकि जंगली प्रकार rhodopsin प्लाज्मा झिल्ली5पर स्थित है । । खुलासा rhodopsin P23H उत्परिवर्ती प्रमुख नकारात्मक cytotoxicity है कि haploinsufficiency के कारण नहीं है दर्शाती है, लेकिन एर जुड़े प्रोटीन क्षरण मार्ग और बाधित रॉड बाहरी खंड संगठन के सक्रियकरण से संबंधित है । रॉड photoreceptor सेल तनाव को कम करने के लिए, एक रणनीति के उत्परिवर्ती rhodopsin के देशी तह एक औषधीय निगरानी का उपयोग कर स्थिर है ।

इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम एक सेल आधारित उच्च प्रवाह स्क्रीन प्रदर्शन (HTSs)11,12,13 एक β-galactosidase टुकड़ा पूरक परख का उपयोग करने के लिए P23H rhodopsin उत्परिवर्ती प्लाज्मा पर उत्पात झिल्ली. इस HTS परख के मजबूत और सरल प्रोटोकॉल हमें प्रत्येक स्क्रीन के लिए के बारे में ७९,००० छोटे अणुओं की गतिविधियों का पता लगाने के लिए सक्षम होना चाहिए । हालांकि, क्योंकि इस HTS परख luminescence संकेतों पढ़ता है, β-लड़की अवरोधकों सहित झूठी सकारात्मक, रंग या साइटोटोक्सिक यौगिकों हिट सूची में शामिल है इंतज़ार कर एक माध्यमिक परख द्वारा की पहचान की है ।

पारंपरिक immunostaining और प्रतिदीप्ति इमेजिंग विधियों का उपयोग वर्षों से स्तनधारी कोशिकाओं में rhodopsin परिवहन का अध्ययन करने के लिए किया गया है5,14,15,16. हालांकि, इन पारंपरिक तरीकों को rhodopsin परिवहन की दिशा में 10 से अधिक यौगिकों के औषधीय प्रभाव यों तो इस्तेमाल नहीं किया जा सकता क्योंकि एक विश्वसनीय इमेजिंग विश्लेषण छवियों की एक बड़ी संख्या में एक अत्यधिक सुसंगत हालत है, जो है के तहत लिया की आवश्यकता है पारंपरिक इमेजिंग तरीकों से संशोधित नहीं । यहां, हम एक माध्यमिक परख के रूप में एक immunostaining आधारित उच्च सामग्री इमेजिंग प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए rhodopsin म्यूटेंट11,13,17के सेल भूतल परिवहन को बढ़ाता है । प्लाज्मा झिल्ली पर rhodopsin लेबल करने के लिए, हम सेल झिल्ली permeabilization के कदम छोड़ दिया और immunostained rhodopsin म्यूटेंट द्वारा एक मोनोक्लोनल (बी-30) विरोधी rhodopsin पहचानने की एन-टर्मिनल epitope के rhodopsin पक्ष में सेल झिल्ली18. पूरे सेल में उत्परिवर्ती rhodopsin कल्पना करने के लिए, हम वीनस प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ rhodopsin जुड़े । विभिन्न प्रतिदीप्ति चैनलों में प्रतिदीप्ति तीव्रता के ठहराव के द्वारा, हम एक एकल प्रयोग से एकाधिक पैरामीटर प्राप्त करने में सक्षम हैं पूरे सेल में कुल rhodopsin गहनता सहित, सेल की सतह पर, और के अनुपात rhodopsin प्रतिदीप्ति सेल सतह पर है कि पूरे सेल में । स्थिर कोशिकाओं छह rhodopsin म्यूटेंट की कुल व्यक्त करने के लिए इस पद्धति को लागू करने, हम इन म्यूटेंट के प्रति कई छोटे अणु chaperones की एक औषधीय प्रोफ़ाइल उत्पन्न कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, सभी कोशिकाओं को एक ३८४-अच्छी तरह से थाली में immunostained है और एक उच्च अनुरूप इमेजिंग हालत के तहत एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर imaged । एक छवि विश्लेषण एक अच्छी तरह से किया जाता है, अधिक से अधिक ६०० कोशिकाओं की छवियों युक्त कोशिका आकार और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर बदलती के साथ कोशिकाओं के विविधता के कारण भिन्नता को कम करने के लिए. इस प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चित्र 1में सारांशित है । इस विधि का लाभ यह है कि हम उच्च संकल्प छवियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहु-पैरामीटर quantifications छवि आधारित विश्लेषण से प्राप्त करते हैं । सामांय में, इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है और ब्याज की किसी भी प्रगट झिल्ली प्रोटीन के परिवहन यों तो लागू होता है ।

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Protocol

नोट: rhodopsin परिवहन परख।

1. तैयारी और कोशिकाओं की संस्कृति

  1. जंगली प्रकार (WT) या उत्परिवर्ती माउस rhodopsin-वीनस फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त क्रायो संरक्षित U2OS स्थिर कोशिकाओं को पुनर्जीवित । ३७ ° c पर कोशिकाओं गल जब तक केवल छोटे बर्फ क्रिस्टल शीशी में छोड़ दिया जाता है ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में U2OS कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है क्योंकि इन विट्रो अध्ययनों में के लिए कोई photoreceptor सेल लाइन उपलब्ध है और rhodopsin के पूर्व सिलिअरी-संश्लेषण स्तनधारी कोशिकाओं में समान आणविक तंत्र द्वारा विनियमित है । इसके अतिरिक्त, U2OS कोशिकाओं प्लेट के नीचे करने के लिए कसकर देते हैं और बड़े सेल निकायों है, तो वे rhodopsin परिवहन परख के लिए आदर्श होते हैं । सात U2OS स्थिर कोशिकाओं WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N और P267L rhodopsin म्यूटेंट व्यक्त की गुणवत्ता और परख की विश्वसनीयता दिखाने के लिए एक उदाहरण के रूप में यहां इस्तेमाल कर रहे हैं । स्थिर अंय rhodopsin म्यूटेंट या अंय झिल्ली प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है, परख के लक्ष्य पर निर्भर करता है । स्थिर कोशिकाओं मानव rhodopsin व्यक्त अगर उपलब्ध इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है । माउस rhodopsin यहां इस्तेमाल किया गया था, क्योंकि माउस और मानव rhodopsin प्रोटीन शेयर ९५% समरूपता, और इस परख द्वारा पहचान यौगिकों vivo में परीक्षण किया जाएगा एक माउस adRP rhodopsin P23H उत्परिवर्तन8ले मॉडल का उपयोग कर । पहले19वर्णित के रूप में स्थिर कक्षों को जनरेट किया गया । WT और उत्परिवर्ती rhodopsin टेप क्यू-पीसीआर द्वारा quantified थे, और स्थिर WT और उत्परिवर्ती rhodopsin टेप के समान स्तर व्यक्त कोशिकाओं के क्लोनों इस परख के लिए चयनित किया गया । immunoblot और immunostaining द्वारा rhodopsin प्रोटीन्स की अभिव्यक्ति की पुष्टि की गई । इस परख में इस्तेमाल किया कोशिकाओं के बीतने से कम होना चाहिए 20 ।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कोशिकाओं की प्रत्येक पंक्ति स्थानांतरण वृद्धि मध्यम के 10 मिलीलीटर (उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 5 µ g/एमएल Plasmocin) के साथ ।
  3. 5 मिनट के लिए २०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक supernatant त्यागें और सेल गोली प्रत्येक सेल लाइन के लिए सेल विकास माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ resuspend । एक ६० मिमी ऊतक संस्कृति पकवान और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन में सेल निलंबन की प्रत्येक पंक्ति स्थानांतरण ।
  4. उपसंस्कृति कोशिकाओं जब ऊतक संस्कृति डिश ९०% संगम संदर्भ12में वर्णित के रूप में पहुंचता है ।

2. प्रति अच्छी तरह से ५,००० कोशिकाओं पर सीडिंग कोशिकाओं

नोट: एक ऊतक संस्कृति हूड में निंनलिखित प्रक्रियाओं प्रदर्शन ।

  1. पाली-lysine के साथ थाली समझो ।
    1. कोशिकाओं को बोने से पहले एक दिन, 30 मिनट के लिए पाली-lysine समाधान के 20 µ एल के साथ एक काले दीवार और स्पष्ट नीचे ३८४-अच्छी तरह से थाली का इलाज ।
    2. महाप्राण तरल और सभी कुओं 1 ज. वापस प्लेट ढक्कन डाल के लिए सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं और सेल बोने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली की दुकान ।
  2. सेल सस्पेंशन तैयार करें ।
    1. संस्कृति एक १०० मिमी ऊतक संस्कृति डिश में विकास मध्यम में प्रत्येक कोशिका लाइन ९०% संगम तक ।
    2. फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ प्रत्येक डिश धो और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.०५% Trypsin की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को अलग ।
    3. परख मध्यम (उच्च ग्लूकोज DMEM 10% FBS, १०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन और १०० μg/एमएल streptomycin) के साथ 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं की प्रत्येक पंक्ति resuspend ।
    4. कोशिकाओं की गणना और परख मध्यम के साथ १.२५ x 105 कोशिकाओं/एमएल के लिए कोशिकाओं की प्रत्येक पंक्ति को पतला ।
  3. कोशिकाओं को बीज ।
    1. एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट या एक स्वचालित एजेंट मशीन का उपयोग करने के लिए ४० µ का वितरण करने के लिए सेल निलंबन के एल/अच्छी तरह से तीन कॉलम प्रति सेल लाइन और भरने के कॉलम 1-21 ३८४-अच्छी तरह से प्लेट (चित्रा 2) ।
    2. Add ४० µ l/U2OS (P23H-Rhodopsin-वीनस) के कॉलम 22-23 और ४० µ के एल/U2OS (Rhodopsin-वीनस) के स्तंभ 24, के रूप में नियंत्रण के रूप में ठीक है ।
    3. 30 एस के लिए ३०० x जी में प्लेट केंद्रापसारक ३८४-अच्छी तरह से थाली के नीचे करने के लिए सभी कोशिकाओं को नीचे लाने के लिए ।
      नोट: कोशिका बोने के बाद प्लेट के लिए शारीरिक सदमे से बचें । अंयथा, कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से एक कोने को कुचल दिया जाएगा, और प्लेट उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं होगा ।
    4. 5% सह2 के साथ ३७ ° c पर ३८४-अच्छी तरह से थाली मशीन कोशिकाओं के लिए 3 ज के लिए प्लेट के नीचे करने के लिए संलग्न करने के लिए ।

3. यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज

  1. चित्रा 2में दिखाया गया के रूप में उपचार की स्थिति के साथ एक प्लेट नक्शा उत्पन्न.
  2. 5x एक ९६-well थाली में अप करने के लिए 15 यौगिकों के काम समाधान के ३०० µ एल तैयार करें ।
    1. पतला सीपीएस 1 करने के लिए 15 कुओं में अपने अंतिम सांद्रता के पांच बार करने के लिए परख मध्यम ९६ के G2-वेल प्लेट (चित्रा 2a) के लिए । अच्छी तरह से H2 में परख मध्यम के ३०० µ एल जोड़ें ।
      नोट: प्रत्येक यौगिक के अंतिम एकाग्रता HTS12,13द्वारा P23H rhodopsin के परिवहन के बचाव के लिए सबसे प्रभावी एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है ।
    2. 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) और 25 µ m 9-सीआईएस-रेटिना कि परख मध्यम कॉलम 11 और 12, क्रमशः में पतला कर रहे है के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल जोड़ें । मंद प्रकाश में 9-सीआईएस-रेटिना जोड़ें ।
  3. ३८४-खैर प्लेट कोशिकाओं (चित्रा बी8) के साथ प्रसंस्कृत 5x के लिए कार्य समाधान के प्रति अच्छी तरह से 10 µ एल जोड़ना ।
    1. एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टी चैनल पिपेट यौगिकों 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, और 15 पंक्तियों के लिए एक, सी, ई, जी, मैं, कश्मीर, एम, और हे कॉलम 1 से 21 (चित्रा 2) को जोड़ने के लिए उपयोग करें । पंक्तियां B, D, F, H, J, L, N, और P स्तंभ 1 से 21 तक के लिए यौगिकों 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 और M जोड़ें ।
    2. कॉलम 22 और 24 के लिए 2% DMSO के प्रति अच्छी तरह से 10 µ एल जोड़ें । 25 µ एम 9 के प्रति अच्छी तरह से 10 µ एल जोड़ें-सीआईएस-रेटिना 23 कॉलम करने के लिए ।
      नोट: DMSO एक वाहन नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है क्योंकि सभी यौगिकों शुरू में DMSO में स्टॉक के रूप में भंग कर रहे हैं । स्तंभ 22 DMSO इलाज कोशिकाओं P23H rhodopsin व्यक्त करने वाले 0% नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है । 9-सीआईएस-रेटिना इलाज P23H rhodopsin व्यक्त कोशिकाओं १००% नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
  4. कवर ३८४-अच्छी तरह से प्लेट एल्यूमीनियम पंनी के साथ और ३७ ° c पर थाली गर्मी 24 ज के लिए ।

4. Immunostaining के बिना झिल्ली Permeabilization कोशिका सतह पर Rhodopsin प्रोटीन दाग ।

नोट: कोशिका झिल्ली बरकरार रखने के लिए पूरे immunostaining प्रक्रिया में किसी भी डिटर्जेंट से बचें ।

  1. एक रासायनिक धुएं के हुड में 1:4 मात्रा के अनुपात में पंजाबियों के साथ 16% पीएफए कमजोर करके 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करें । एक रिएजेंट जलाशय में 4% पीएफए स्थानांतरण ।
  2. मंद लाल बत्ती के साथ एक अंधेरे कमरे में ३८४ अच्छी तरह से थाली बाहर ले लो । एक 8 चैनल aspirator एक वैक्यूम संग्रह बोतल से जुड़ा का उपयोग करने के लिए धीरे माध्यम महाप्राण । एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए नए सिरे से तैयार 4% पीएफए के प्रति अच्छी तरह से 20 µ एल जोड़ने के लिए पूरी ३८४-अच्छी तरह से थाली और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए गर्मी । कोशिका टुकड़ी से बचने के लिए हमेशा आकांक्षाओं के दौरान प्रत्येक कुआं के एक ही पक्ष को aspirator के सुझावों को इंगित करें । प्रत्येक कुआं के मध्य निचला क्षेत्र स्पर्श न करें । जब छवियां ले, aspirator द्वारा छुआ क्षेत्र से बचने के लिए खेतों का चयन करें । 10 मिनट से अधिक की मशीन के लिए, वाष्पीकरण से बचने के लिए इसके ढक्कन के साथ ३८४-अच्छी तरह से थाली को कवर करें ।
    नोट: कोशिकाओं को पुनर्जीवित isorhodopsin कि १००% नियंत्रण के परिणाम को प्रभावित करेगा के photobleaching से बचने के लिए एक अंधेरे कमरे में तय कर रहे हैं । निर्धारण के बाद ३८४-खैर प्लेट सामान्य प्रकाश के तहत बाहर लिया जा सकता है ।
  3. पीएफए को महाप्राण करने के लिए एक 8-चैनल aspirator का उपयोग करें और एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके पंजाब के प्रति चहेतों को ५० μL जोड़ें । पंजाबियों के साथ तीन बहाकर प्रदर्शन करने के लिए दो बार दोहराएं ।
    चेतावनी: अपशिष्ट पीएफए युक्त तरल एक छाया बोतल में एकत्र कर रहे है और प्रयोग के बाद एक खतरनाक रासायनिक अपशिष्ट के रूप में का निपटारा किया जाना है ।
  4. 5% बकरी सीरम के पूरे ३८४ के लिए अच्छी तरह से प्लेट और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी के लिए 20 µ एल जोड़कर कोशिकाओं को ब्लॉक ।
  5. महाप्राण 5% बकरी सीरम और जोड़ें 15 µ एल के प्रति अच्छी तरह से 20 µ जी एमएल-1 बी-30 एंटी-rhodopsin एंटीबॉडी में 1% बकरी सीरम करने के लिए पंक्तियों ए करने के लिए ओ. 1% बकरी सीरम के प्रति अच्छी तरह से द्वितीयक एंटीबॉडी नियंत्रण समूह के लिए पंक्ति P 15 µ l जोड़ें ।
  6. ९० मिनट या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए कमरे के तापमान पर ३८४-अच्छी तरह से थाली मशीन । कवर ३८४-एल्यूमीनियम पंनी के साथ अच्छी तरह से थाली fluorophores के photobleaching से बचने के लिए ।
  7. पंजाबियों की अच्छी तरह से प्रति ५० µ एल के साथ थाली धो 3 बार ।
  8. महाप्राण और 15 µ l को 5 µ जी एमएल-1 Cy3-संयुग्मित गोट एंटी-माउस आईजीजी एंटीबॉडी के प्रति कुआं जोड़ें । कवर ३८४-अच्छी तरह से प्लेट एल्यूमीनियम पंनी के साथ और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी ।
  9. पंजाबियों की अच्छी तरह से प्रति ५० µ एल के साथ थाली धो 3 बार । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नाभिक दाग करने के लिए 1 µ जी एमएल-1 Hoechst ३३३४२ युक्त पंजाब के प्रति अच्छी तरह से ५० µ एल जोड़ें ।
  10. इमेजिंग से पहले एक पारदर्शी फिल्म के साथ ३८४-अच्छी प्लेट सील । कवर ३८४-अच्छी तरह से प्लेट एल्यूमीनियम पंनी के साथ और एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर अगर छवियों को तुरंत लिया जाता है ।

5. इमेजिंग।

नोट: यह उच्च सामग्री इमेजिंग प्रक्रिया सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध इमेजिंग सिस्टम के लिए अनुकूलित है । अन्य उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करते हुए प्रक्रियाएँ भिन्न हो सकते हैं ।

  1. ढक्कन निकालें और प्लेट के शीर्ष बाएं कोने पर तैनात A1 के साथ उच्च सामग्री imager में ३८४-well थाली डाल दिया ।
  2. छवि प्राप्ति के लिए पैरामीटर्स सेट करने के लिए छवि प्राप्ति सॉफ़्टवेयर खोलें.
    1. प्लेट प्राप्ति सेटअप विंडो खोलें और नई सेटिंग बनाएँ या किसी मौजूदा सेटअप फ़ाइल लोड करें ।
    2. 20x उद्देश्य का चयन करें और पिक्सेल को 2 के रूप में सेट अप करने के लिए तुले हुए पिक्सेल आकार ०.८० x ०.८० µm है । स्कैन पंक्तियाँ २,००० के रूप में सेट करें और छवि आकार (W x H) प्रति साइट १,००० x १,००० पिक्सेल (८००.०० x ८००.०० µm) के रूप में.
    3. प्लेट प्रकार छवि के लिए चयन करें । प्लेट आयामों को भरने के लिए ३८४-well प्लेट के निर्माता द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी का उपयोग करें ।
    4. कुओं का चयन करने के लिए ३८४-अच्छी तरह से थाली के लिए छवि हो ।
    5. चार साइटों का चयन करें प्रति अच्छी तरह से imaged हो । आकांक्षा युक्तियों से अच्छी तरह से छुआ की ओर से बचें ।
    6. ४०५, ४८८ और ५६१ एनएम के रूप में उत्तेजना पराबैंगनीकिरण का चयन करें । DAPI, FITC और टेक्सास लाल चैनलों के लिए उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें । लेजर शक्ति और सकारात्मक नियंत्रण कुओं से लिया छवियों की चमक सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चैनल के लाभ का अनुकूलन संतृप्ति दहलीज से कम कर रहे हैं.
    7. फ़ोकस के लिए अच्छी तरह से-से-अच्छी फ़ोकस का चयन करें. पहले अच्छी तरह से नमूनों को खोजने के लिए प्रारंभिक रूप में अधिग्रहीत का चयन करें । सभी साइट्स पर साइट का फ़ोकस सेट करें ।
    8. प्रत्येक चैनल के लिए प्रति पंक्ति चार औसत का चयन करें । प्रत्येक चैनल के लिए Z-ऑफ़सेट मान ऑप्टिमाइज़ करें ।
    9. ३८४ अच्छी तरह से प्लेट के विकर्ण कोनों पर 2-3 कुओं का परीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि छवियों सभी परीक्षण कुओं के लिए ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, अच्छी तरह से प्रति सभी साइटों से छवियों से अधिक ४०% संगम के साथ कोशिकाओं है, और सभी चैनलों की प्रतिदीप्ति तीव्रता के बारे में आधा है १००% में संतृप्त कुओं पर नियंत्रण ।
    10. छवि प्राप्ति विधि सहेजें ।
  3. पूरी प्लेट चलाते हैं । देखो imager जब तक यह प्लेट के पहले कॉलम से छवियों पर कब्जा करने के लिए डबल imager जाने से पहले छवि गुणवत्ता की जांच खत्म । ३८४-अच्छी तरह से प्लेट बाहर ले जाओ और भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    नोट: अच्छी तरह से और चैनल लिया प्रति चयनित साइटों की संख्या पर निर्भर करता है, यह इमेजिंग १ ३८४-वेल प्लेट खत्म करने के लिए 3 घंटे के लिए ४० मिनट लेता है.

6. छवि विश्लेषण ।

  1. एक उच्च सामग्री छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि डेटा बाहर खींचो । १००% नियंत्रण कुओं (कॉलम 23) में से एक का चयन करने के लिए निर्धारित मापदंडों ।
  2. विश्लेषण विधि के रूप में बहु-तरंग दैर्ध्य कक्ष स्कोरिंग का चयन करें और सेटिंग्स कॉंफ़िगर करना प्रारंभ ।
    1. DAPI चैनल से छवियों का उपयोग कर नाभिक परिभाषित करें । पूर्वावलोकन के लिए सुनिश्चित करें कि चयनित में परिभाषित नाभिक आकार अच्छी तरह से नाभिक छवियों के साथ अच्छी तरह से फिट बैठता है ।
    2. FITC चैनल में कक्ष के आकार को परिभाषित करें जहां rhodopsin-वीनस की छवि है ।
    3. टेक्सास लाल चैनल में rhodopsin सेल सतह दाग क्षेत्रों को परिभाषित करें ।
    4. अगर सेटिंग्स अनुकूलित कर रहे हैं यह निर्धारित करने के लिए 5 कुओं में वर्तमान एल्गोरिथ्म का परीक्षण करें । सेटिंग्स सहेजें और कॉंफ़िगरेशन विंडो को बंद करें ।
  3. अनुकूलित विश्लेषण विधि के साथ सभी कुओं भागो ।
  4. ऑब्जेक्ट संख्या को बरकरार कक्ष संख्या के रूप में निर्यात करें । Rhodopsin-वीनस तीव्रता (Rhodopsin-वीनस INT) के रूप में FITC चैनल की औसत तीव्रता निर्यात करें । सेल सतह पर rhodopsin तीव्रता के रूप में टेक्सास लाल चैनल की औसत तीव्रता निर्यात (rhodopsin INT सेल सतह पर) ।
  5. निर्यात किए गए डेटा को किसी स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में खोलें । rhodopsin-वीनस INT मेम-से-कुल अनुपात के रूप में सेल सतह पर rhodopsin तीव्रता विभाजित करें । गणना Z'-प्रत्येक पैरामीटर के लिए कारकों परख गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए । Z ′ = 1 − 3x (एसटीडी१००% नियंत्रण+एसटीडी0% नियंत्रण)/| meaning१००% control− मतलब0% control|.
    नोट: एक Z'-उच्च कारक 0 से अधिक एक उच्च सामग्री स्क्रीन के लिए पर्याप्त एक उदारवादी परख इंगित करता है, और ०.५ और 1 के बीच एक Z कारक एक उच्च प्रवाह स्क्रीन20,21के लिए आवश्यक एक उत्कृष्ट परख पता चलता है ।
  6. प्रत्येक पैरामीटर के लिए एक दो-रंग हीट मैप जनरेट करने के लिए स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । X-अक्ष पर कक्ष रेखाओं के नाम और Y-अक्ष पर यौगिकों को व्यवस्थित करें ।

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Representative Results

हम तीन मापदंडों के साथ rhodopsin परिवहन की विशेषता: पूरे सेल में rhodopsin-वीनस तीव्रता (rhodopsin-वीनस int), प्लाज्मा झिल्ली पर rhodopsin के immunostaining तीव्रता (सेल सतह पर rhodopsin int), और के अनुपात rhodopsin पूरे सेल में rhodopsin-वीनस तीव्रता के लिए कोशिका की सतह पर दाग (मेम-कुल अनुपात) । rhodopsin परिवहन परख का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 और चित्रा 4में दिखाया गया है । DMSO और 9 का उपयोग-सीआईएस-रेटिना का इलाज कोशिकाओं P23H-rhodopsin-वीनस के रूप में व्यक्त 0 और १००% नियंत्रण, क्रमशः, Z'-इन तीन मापदंडों के लिए कारकों 0 से ०.५ के बीच की सीमा में हैं, सुझाव है कि परख मध्यम गुणवत्ता है, उच्च सामग्री इमेजिंग21के लिए पर्याप्त है । हालांकि अनुकूलित Z'-कारकों को एक HTS परख की तुलना में अपेक्षाकृत जटिल प्रक्रियाओं के कारण ०.५ से कम कर रहे हैं, इस परख अभी भी मजबूत है और एक छवि आधारित विश्लेषण के लिए विश्वसनीय है । एक सक्रिय यौगिक जो एक rerhodopsined बचाता है rhodopsin INT के उच्च मान पर कक्ष सतह और मेम-कुल अनुपात से DMSO, P मान ०.०५ से कम के साथ दिखाना चाहिए । तीन 2-डी हीट मैप्स औसत rhodopsin राशि और सेल प्रति स्थानीयकरण (चित्रा 4) की तुलना करने के लिए इन तीन मापदंडों से उत्पन्न किया गया । triplicates में दोहराया, WT और छह rhodopsin म्यूटेंट क्षैतिज सूचीबद्ध हैं, और यौगिक उपचार के प्रभाव खड़ी तुलना कर रहे हैं । पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में, सेल सतह और मेम-कुल अनुपात पर rhodopsin INT DMSO (चित्रा 4c)5,22,23के साथ इलाज WT rhodopsin की तुलना में छह म्यूटेंट के लिए कम कर रहे हैं । सेल सतह और उसके मेम पर rhodopsin INT-to-कुल अनुपात 9 द्वारा वृद्धि हुई है-सीआईएसरेटिना उपचार T4R, P23H, D190N और P267L के लिए, लेकिन नहीं P53R या C110Y म्यूटेंट, सुझाव है कि 9-सीआईएस-रेटिना T4R के परिवहन को बचाता है, P23H, D190N व P267L rhodopsin म्यूटेंट. सभी सीपीएस T4R, P23H और D190N के लिए सेल सतह पर Rhodopsin INT में वृद्धि का स्तर अलग दिखाया । सीपीएस 3, 4, 5, 7, 8 और 11 rhodopsin-वीनस INT लेकिन नहीं मेम-करने के लिए कुल अनुपात इन rhodopsin म्यूटेंट, सुझाव है कि इन यौगिकों केवल rhodopsin राशि में वृद्धि हुई । सीपीएस 1, २ ६ और 9 काफी वृद्धि हुई मेम-कुल अनुपात T4R, P23H, D190N और P267L rhodopsin म्यूटेंट, का सुझाव है कि इन यौगिकों प्लाज्मा झिल्ली के लिए इन rhodopsin म्यूटेंट के परिवहन बचाव. 2-डी प्रोफाइल अलग औषधीय उपचार द्वारा कम कर रहे हैं कि इन adRP जुड़े उत्परिवर्तनों से प्रभावित rhodopsin परिवहन की एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: rhodopsin परिवहन परख के कार्यप्रवाह । कोशिका rhodopsin परिवहन परख के लिए झिल्ली permeabilization बिना rhodopsin के धुंधला की सतह के लिए प्रक्रियाओं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2:5x काम समाधान की तैयारी के लिए चित्र और ९६-अच्छी तरह से थाली से तरल हस्तांतरण ३८४-well प्लेट करने के लिए । (क) ९६-अच्छी तरह से 5x काम समाधान के प्लेट लेआउट । वेल्स A1 G2 करने के लिए 15 5x काम समाधान और परख मध्यम (एम) के रूप में 1 और 2 कॉलम में सचित्र के रूप में अच्छी तरह से प्रति ३०० µ एल है । यौगिकों 14 और 15 2% DMSO और 25 µ एम 9-सीआईएस-रेटिना, क्रमशः, WT और उत्परिवर्ती rhodopsin व्यक्त सात सेल लाइनों को उपचार के लिए कर रहे हैं । साथ ही, स्तंभ 11 और 12 है १०० µ l के प्रति अच्छी तरह से 2% DMSO और 25 µ m 9-सीआईएसरेटिना नियंत्रण, क्रमशः, rhodopsin कारकों की गणना के लिए P23H Z' व्यक्त कोशिकाओं को इलाज. (ख) सेल प्रकार और उपचार की स्थिति के लिए ३८४-well प्लेट लेआउट । WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N और P267L rhodopsin-वीनस को व्यक्त U2OS कोशिकाओं को सचित्र रूप में वरीयता प्राप्त है । उपचार की स्थिति नीले रंग में लेबल कर रहे हैं । गुलाबी और नीले रंग की युक्तियां अच्छी तरह से करने वाली अच्छी तरह से तरल हस्तांतरण ९६-३८४ प्लेट एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से स्थानांतरण प्रदर्शित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: rhodopsin परिवहन परख के नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि छवियों और quantifications । (क) वीनस प्रतिदीप्ति (हरी) और कोशिका सतह immunostaining (लाल) U2OS कोशिकाओं WT या P23H rhodopsin-वीनस DMSO या 5 µ एम 9-सीआईएस-रेटिना के साथ इलाज व्यक्त की । स्केल बार = २०० µm. (B) पूरे कक्ष में rhodopsin राशि का प्रतिनिधित्व करने वाला माध्य वीनस तीव्रता का एक स्तंभ प्लॉट (rhodopsin-वीनस INT). पी< 0.0001 । Z'-फैक्टर को ब्लैक लाइन के नीचे दिखाया गया है । स्तंभ मान और त्रुटि पट्टी है औसत और मानक विचलन (S.D.) की 16 प्रतिकृति, क्रमशः । (ग) कोशिका सतह पर सना हुआ rhodopsin का प्रतिनिधित्व करने वाली कोशिका के प्रति निकृष्ट Cy3 तीव्रता का एक कॉलम प्लॉट (कोशिका की सतह पर rhodopsin INT). (घ) कोशिका की सतह पर rhodopsin स्तर के अनुपात का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रति कोशिका को उसके पूरे कोशिका स्तर (मेम-से-कुल अनुपात) तक मतलब cy3 तीव्रता के अनुपात का एक कॉलम भूखंड. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक प्रतिनिधि उच्च rhodopsin परिवहन परख के 2-रंग गर्मी नक्शे के रूप में दिखाया सामग्री विश्लेषण । (क) पूरे कोशिका rhodopsin स्तर (rhodopsin-वीनस INT) का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रति कोशिका का निकृष्ट शुक्र तीव्रता का ताप नक्शा. प्रत्येक खंड एक डेटा बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है और प्रत्येक शर्त तपसिल में परीक्षण किया गया था । रंग लीजेंड बाईं ओर दिखाया गया है । सीपी, कंपाउंड । (ख) सेल सतह पर सना हुआ rhodopsin का प्रतिनिधित्व सेल प्रति मतलब Cy3 तीव्रता का गर्मी नक्शा (सेल सतह पर rhodopsin INT) । (ग) कोशिका की सतह पर rhodopsin स्तर के अनुपात का प्रतिनिधित्व करने वाले अपने पूरे-सेल स्तर (मेम-से-कुल अनुपात) के प्रति कोशिका का माध्य वीनस तीव्रता के अनुसार प्रति कोशिका का अर्थ Cy3 तीव्रता का ताप नक्शा. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां, हम एक उच्च सामग्री इमेजिंग निस्र्पक एक HTS से पहचान की हिट के लिए इस्तेमाल किया परख दिखाया । केवल स्वचालन इन प्रोटोकॉल में शामिल उच्च सामग्री imager है । rhodopsin के immunostaining और प्रतिदीप्ति इमेजिंग सामांयतः rhodopsin5,14,15,16के स्थानीयकरण की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, पारंपरिक इमेजिंग विधियों द्वारा ली गई छवियों की ठहराव, प्रति प्रयोग छवियों की कम क्षमता, और गुणवत्ता नियंत्रण पैरामीटर की कमी के कारण पर्याप्त सेल इमेज की कमी तक सीमित है । हम ३८४-अच्छी तरह से प्रारूप करने के लिए पारंपरिक immunostaining प्रोटोकॉल अनुकूलित और उच्च सामग्री इमेजिंग के साथ पारंपरिक इमेजिंग की जगह । इस उच्च सामग्री इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम सफलतापूर्वक चयनित और एक HTS11,13,17द्वारा की पहचान की हिट की गतिविधियों की विशेषता । पारंपरिक immunostaining और इमेजिंग तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल काफी इमेजिंग शर्तों, इमेजिंग क्षमता, और छवि विश्लेषण शक्ति है, जो हमें मात्रात्मक औषधीय प्रभावों की तुलना करने के लिए सक्षम की जिद बढ़ छह adRP जुड़े rhodopsin म्यूटेंट के परिवहन की ओर 11 यौगिकों की ।

rhodopsin immunostaining और इमेजिंग के लिए पहले से प्रयुक्त प्रोटोकॉल की तुलना में इस प्रोटोकॉल का प्रमुख परिवर्तन कर रहे हैं: (1) बढ़ रही है और immunostaining कोशिकाओं में एक स्पष्ट नीचे ३८४-अच्छी तरह से थाली; (2) एक उच्च सामग्री imager का उपयोग इमेजिंग कोशिकाओं; और (3) एक उच्च सामग्री छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण । इन परिवर्तनों के कारण, एक प्रारंभिक अनुकूलन सबसे अच्छा सेल बोने की संख्या, एंटीबॉडी सांद्रता, इमेजिंग शर्तों, और छवि विश्लेषण एल्गोरिदम को खोजने के लिए आवश्यक है ।

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में शामिल हैं: (1) सीडिंग कक्ष जो निर्धारण से पहले 50-70% संगम की अनुमति देते हैं; (2) सावधान आकांक्षाओं सेल टुकड़ी से बचने के लिए; (2) इमेजिंग पूरी थाली भर में कई कुओं यकीन है कि छवियों पर ध्यान केंद्रित कर रहे है और सभी चैनलों के fluoresce पर सकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए imager की दहलीज के आधे से अधिक नहीं पूरी थाली इमेजिंग से पहले; और (3) 0 से अधिक Z'-कारक रखने के लिए परख की विश्वसनीयता सुनिश्चित करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल के लिए सामना किया जा सकता है कि सबसे आम समस्याओं कोशिका टुकड़ी और कम Z'-कारक हैं । पहले अंक से बचने के लिए, पाली-L-lysine के साथ ३८४-अच्छी प्लेट का इलाज करने के लिए सेल लगाव की सुविधा और सेल लाइनों है कि इस तरह के Hek293 कोशिकाओं के रूप में आसानी से अलग उपयोग से बचें । इसके अतिरिक्त, आकांक्षा टिप की सीमा के लिए एक अच्छी तरह से एक ही पक्ष को छूने के लिए और इमेजिंग के लिए एक अच्छी तरह से दूसरी तरफ का चयन करें । Z'-फैक्टर और परख गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, सेल आकार या सॉफ्टवेयर द्वारा परिभाषित नाभिक आकार सुनिश्चित करने के लिए कक्ष सीडिंग संख्या और छवि विश्लेषण मापदंडों का अनुकूलन प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में प्रत्येक वस्तु के साथ अच्छी तरह से फिट बैठता है.

इस तरह के एक सेल सतह एलिसा, या एक β-galactosidase टुकड़ा पूरक परख है, जो सभी कोशिकाओं में सेल की सतह पर लक्ष्य प्रोटीन स्तर की गणना के रूप में rhodopsin परिवहन, यों तो इस उच्च सामग्री इमेजिंग विधि, के रूप में अंय तरीकों की तुलना में quantifies प्रति सेल औसत प्रोटीन स्तर; और, इस अनूठी विशेषता एक महत्वपूर्ण भिन्नता कारक, अन्य विधियों में अंतिम readouts को प्रभावित करता है जो कक्ष संख्या से बचा जाता है । इसके अतिरिक्त, की वजह से कोशिकाओं की बड़ी संख्या में छवि और quantified उच्च सामग्री इमेजिंग विधि द्वारा, सभी कोशिकाओं से औसत मापदंडों के बीच कम भिन्नता दिखाई देता है प्रतिकृति, इस प्रकार परख की विश्वसनीयता को जोड़ने.

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि वे HTS के लिए सबसे अच्छा परख नहीं कर रहे हैं, इसकी अपेक्षाकृत जटिल प्रक्रिया के कारण और प्लेट इमेजिंग समय के अनुसार 2 ज । इस प्रकार, हम अधिक से अधिक ५,००० यौगिकों के साथ बड़े छोटे अणु पुस्तकालयों स्क्रीनिंग के लिए वैकल्पिक रिपोर्टर परख की सिफारिश, और इस उच्च सामग्री इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए केंद्रित लक्षण वर्णन परख से कम १०० यौगिकों तक सीमित है । इस प्रोटोकॉल की दूसरी सीमा मानकों की कमी को दिखाने के लिए कि क्या वीनस प्रतिदीप्ति या immunostaining प्रतिदीप्ति तीव्रता सेल प्रति rhodopsin प्रोटीन राशि की मात्रा के साथ एक रैखिक संबंध में है । immunostaining द्वारा संतृप्ति से बचने के लिए, हम परीक्षण और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता के साथ मशीन की कोशिकाओं की immunostaining तीव्रता की साजिश रचने की सिफारिश. florescence परिवर्तन के रेखीय रेंज के भीतर एंटीबॉडी सांद्रता का चयन करें ।

वर्तमान आवेदन से विस्तार, हम कोशिकाओं की छवियों से rhodopsin परिवहन क्षणिक transfected के साथ 28 अलग rhodopsin म्यूटेंट उपचार के तहत 10 यौगिकों के साथ इन यौगिकों के एक औषधीय डेटाबेस उत्पंन करने के लिए होगा इन rhodopsin उत्परिवर्तनों को लेकर adRP रोगियों को संभावित उपचार के मार्गदर्शन के लिए गतिविधि । इस प्रोटोकॉल को भी आसानी से ब्याज की किसी भी झिल्ली प्रोटीन के translocation परख के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि अंय प्रोटीन का खुलासा रोगों की दवा खोजों के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उच्च सामग्री imager और प्रारंभिक प्रशिक्षण प्रदान करने के लिए डॉ मार्क ई. Schurdak और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के ड्रग डिस्कवरी संस्थान का धंयवाद । Dr. Krzysztof Palczewski (मामले पश्चिमी रिजर्व विश्वविद्यालय) उदारता 1D4 और B630 विरोधी rhodopsin एंटीबॉडी साझा की है । माउस rhodopsin के सीडीएनए युक्त प्लाज्मिड-वीनस का निर्माण डॉ. Nevin Lambert (Augusta University) द्वारा साझा किया गया था. इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान EY024992 के संस्थान से YC एंड P30EY008098 पिट्सबर्ग विजन रिसर्च कोर ग्रांट के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U2OS (rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
DMEM high glucose Genesee Scientific 25-500 With L-Glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16140071 Heat inactivated
Plasmocin InvivoGen ant-mpt Mycoplasma elimination reagent
Penicillin-Streptomycin (100X) Gibco 15140122 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures
Trypsin-EDTA Genesee Scientific 25-510 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium
Poly-L-lysine solution Sigma-Aldrich P4707-50ML Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
CellCarrier-384 Ultra Microplates PerkinElmer 6057300 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis
Sterile 96-well plate Eppendorf 30730119 Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic
Phosphate Buffered Sailine (PBS) Invitrogen AM9625 10 x PBS Buffer, pH 7.4
DMSO Sigma-Aldrich D4540 >99.5%, cell culture tested
9-cis-retinal Sigma-Aldrich R5754
Compounds tested Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized NA Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized
B6-30 anti-rhodopsin antibody Novus NBP2-25160 Gift from Dr. Krzysztof Palczewski
Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 115-165-146
16% paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Methanol-free
10% Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 50062Z Blocking buffer
Hoechst 33342, Trihydroch Invitrogen H3570 Nuclear staining solution
High-content imager Molecular Devices ImageXpress ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System
MetaXpress high-content image acquisition and analysis software Molecular Devices MetaXpress High-content image acquisition and analysis software
Multichannel pipette (0.5-10 µL) Rainin 17013802 Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL
Multichannel pipette (0.5-10c Rainin 17013805 Manual 8-channel pipette, 20-200 µL
Electronic multichannel pipette (10-200 μL) Thermo Scientific 14-3879-56BT Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks
50ml Reagent Reservoir Genesee Scientific 28-125 Reagent reservior for multichannel pippte dispensing
8-Channel aspirator ABC Scientific EV503 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates
Excel spreadsheet software Microsoft Excel2016 The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation
Origin2018 scientific data analysis and graphing software OriginLab Origin2018 The data analysis software for generating the dose response curves

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References

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उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण द्वारा एक Rhodopsin परिवहन परख
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Feng, B., Liu, X., Chen, Y. A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58703, doi:10.3791/58703 (2019).

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