الكشف عن نشاط ثنائي ملزم يجند المجال الإستروجين مستقبلات ألفا باستخدام مقايسة الهجين اثنين الثدييات
Summary
نحن نقدم طريقة لتحليل 4-هيدروكسي-تاموكسيفين-المعتمدة على الإستروجين مستقبلات ألفا ملزم يجند المجال ثنائي النشاط باستخدام مقايسة الهجين اثنين الثدييات.
Abstract
الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) منظم إستروجين يجند تعتمد على نسخ. هو يحافظ تسلسل البروتين ERα عالية بين الأنواع. وقد كان يعتقد أن وظيفة الإنسان والفأر ERαs مطابق. علينا أن نظهر تأثير التفاضلية 4-هيدروكسي-تاموكسيفين (4OHT) على الماوس والبشرية ERα ملزم يجند المجال (الإعلان) ثنائي النشاط باستخدام المقايسة (M2H) اثنين-الهجين الثدييات. والرزن M2H يمكن إثبات كفاءة الإعلان هوموديميريزيشن النشاط في خلايا الثدييات، الاستفادة من تعداء من اثنين والبلازميدات التعبير البروتين (GAL4 الحمض النووي ملزم المجال [دبد] الانصهار الإعلان و VP16 transactivation المجال [VP16AD] الانصهار الإعلان) عنصر المراعية GAL4 (GAL4RE) تنصهر بلازميد مراسل لوسيفراس. عند الانصهار GAL4DBD الإعلان والانصهار VP16AD قام وجعل من ديمر في الخلايا، هذا البروتين المعقدة يربط GAL4RE، وثم، ينشط تعبير جينات لوسيفراس من خلال نشاط النسخ تعتمد VP16AD. التنشيط بوساطة 4OHT لوسيفراس أعلى في الخلايا HepG2 التي تم transfected مع الماوس قام ERα الانصهار البروتين التعبير والبلازميدات مما في الإعلان ERα البشرية الانصهار البروتين التعبير بلازميد transfected الخلايا. هذه النتيجة تشير إلى أن فعالية الماوس 4OHT-تعتمد على نشاط هوموديميريزيشن قام ERα أعلى من البشر ERα الإعلان. بشكل عام، استخدام الإنزيم M2H أنه ليس مثاليا لتقييم نشاط ثنائي قام مستقبلات النووية، يغاندس ناهضة تعزيز مستوى النشاط قام القاعدية والذي يعوق الكشف عن نشاط ثنائي قام. ووجدنا أن 4OHT لا يعزز النشاط القاعدي قام ERα. وهذا عامل أساسي لكونه قادراً على تحديد وكشف بنشاط ثنائي الإعلان تعتمد على 4OHT بنجاح باستخدام مقايسة M2H. قد يتم تطبيق فحوصات M2H المستندة إلى قام ERα بدراسة نشاط مؤثر جزئي المغيرون مستقبل الإستروجين الانتقائي (مثلاً، 4OHT) في مختلف أنواع الخلايا الثديية.
Introduction
الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) منظم إستروجين يجند تعتمد على نسخ. الغاية هو المحافظة سيكوينسيوف الأحماض الأمينية ERα فيما بين الأنواع. بسبب التماثل أعلى بين الإنسان والفأر ERα، وهو فكر وظيفة هذه المستقبلات متطابقة كما والتفاضلية النشاط الاستروجيني المواد (مثلاً، تاموكسيفين) في هذه الأنواع هو الناجم عن اختلاف الأنواع الأيض الكيميائية بدلاً من الاختلافات الهيكلية من ERα. وقد حفظت ERα عالية مجال الهياكل المشتركة بين فوق عائلة مستقبلات النووية (NR)، عين أ لمجالات و. ه المجال أو المجال ملزم يجند (الإعلان) وتشمل جيب ملزم يجند ووظيفة التنشيط النسخي 2، المسماة بالعربية-2. المجال و هو مترجم متاخم للمجال الإلكتروني وهو المجال الأكثر متغير بين شمالي البحر الأحمر. وحتى بين الإنسان والفأر ERα، والتماثل في المجال و أقل بكثير من أن المجالات الأخرى1. ويعزز قام يجند متجهة من ERα هوموديميريزيشن البروتين ERα لربط عنصر الحمض النووي الإستروجين استجابة محددة مباشرة لتنظيم النسخ الجيني يجند تعتمد على (العمل الكلاسيكي من ERα). وقد كشفت الدراسات بلورية التفاضلية وضع اللولب 12 (AF-2 المجال الأساسية) مع استراديول (E2)-أو 4-هيدروكسي-تاموكسيفين (4OHT)-منضمة قام dimers2،3. المجال و ERα (الأحماض الأمينية 45) الاتصال اللولب 12 مباشرة. ومع ذلك، لا توجد معلومات فيما يتعلق بالأثر هذا التمديد من الأحماض الأمينية 45 (و المجال) من اللولب 12 على ثنائي قام ERα. في هذه الدراسة، ونظهر المساهمة في المجال و إلى إبلاغها هوموديميريزيشن قام ERα 4OHT-تعتمد على استخدام مقايسة (M2H) اثنين-هجين الثدييات.
والرزن M2H طريقة لإظهار تفاعلات البروتين البروتين في خلايا الثدييات إدخال المعينة بلازميد مختلفة ثلاث: البروتين هما التعبير والبلازميدات، التي تعبر عن GAL4 الحمض النووي ملزم المجال (DBD) الانصهار الانصهار قام ERα و VP16AD قام ERα، تنصهر GAL4RE لوسيفراس التعبير بلازميد مراسل. عندما تتفاعل الانصهار GAL4DBD قام ERα والانصهار VP16AD قام ERα (جعل ديمر) في الخلايا، هذا البروتين المعقدة يربط GAL4RE و، ثم، ينشط لوسيفراس التعبير الجيني من خلال وظيفة transactivation تعتمد على VP16AD. ويمكن تقييم مستوى هوموديميريزيشن قام بنشاط لوسيفراس.
الإنزيم (Y2H) اثنين-الهجين الخميرة هو أسلوب بديل يستند إلى المبدأ نفسه الذي يستخدم الخميرة كبيئة المضيف. أظهرت تقارير سابقة باستخدام نظام Y2H أن يزيد قام ERα البشرية والمجال اقتطاع E2-تعتمد على كواكتيفاتور التوظيف والختامية أن المجال و يمنع النسخ E2 بوساطة4. هذه النتيجة لا يتسق مع التقارير الأخرى التي أظهرت نشاط النسخي الموهنة ERα البشرية والمجال اقتطاع في خلايا الثدييات5،6. مؤخرا، أظهرت دراستنا، استخدام نظام M2H، أن كواكتيفاتور E2-تعتمد على نشاط التوظيف البشرية ERα قام يتناقص باقتطاع المجال و في خلايا الثدييات، ويتسق مع النسخ النشاط1. هذه الملاحظات تشير إلى أن دور التفاعل البروتين-بروتين الفسيولوجية تختلف بطريقة خاصة بنوع الخلية والسياق. يمكن أن تثبت مقايسة M2H البروتين-بروتين تفاعل النشاط في نفس السياق الخلوية التي تستخدم لتحديد النشاط الترانسكربتي. وهذا يوفر ميزة للمقايسة M2H مقارنة في Y2H أو في المختبر البروتين-بروتين التفاعل تحليلات أخرى.
لا تزال هناك أسئلة تتعلق بالآليات الجزيئية لنشاط مؤثر جزئي المغيرون مستقبل الإستروجين الانتقائي (SERMs) (مثلاً، 4OHT) لتنظيم النسخ ERα بوساطة. يمكن تطبيق فحوصات M2H المستندة إلى قام ERα بدراسة إليه نشاط مؤثر جزئي سيرمس في مختلف أنواع الخلايا الثديية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن وصف البروتوكول للمقايسة M2H، مع التركيز على شروط الفحص للكشف عن نشاط هوموديميريزاتيون قام ERα كمثال. وبصفة عامة، الإنزيم M2H ليست شعبية للتقييم ليجند-تعتمد على نشاط ثنائي قام ERα. هذا سبب الإعلان ERα حيازة دالة تنشيط النسخي؛ النشاط الذي يزعج، في بعض الحالات، نتائج التحليل M2H. ومع ذلك، ك?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون وانغ على “الوطني معهد لعلوم الصحة البيئية” (نيس) والدكتور سوييوشي لعلى قراءة نقدية للمخطوطات، و “جيفرسون تانر” لتنفيذ إجراءات على شريط الفيديو. وأيد 1ZIAES070065 “المعاهد الوطنية للصحة منحة” (إلى K.S.K.) من “شعبة البحوث الداخلية” من نيس هذا العمل.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
