Erkennung der Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Aktivitäten von Östrogen-Rezeptor Alpha mit den Säugetieren Zweimischling Assay
Summary
Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse der 4-hydroxy-Tamoxifen-abhängigen Rezeptor alpha Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Östrogenaktivität mit Säugetieren Zweimischling Assays.
Abstract
Östrogen-Rezeptor Alpha (ERα) ist eine Östrogene Liganden-abhängige Transkription-Regler. Die Reihenfolge der ERα Protein ist stark zwischen den Arten erhalten. Es ist gedacht worden, dass die Funktion von Mensch und Maus ERαs ist identisch. Wir zeigen die differenzielle 4-hydroxy-Tamoxifen (4OHT) Wirkung auf Maus und menschliche ERα Liganden-bindende Domäne (LBD) Dimerisierung Tätigkeit mit den Säugetieren Zweimischling (M2H) Assay. M2H Assay kann die Effizienz der LBD Homodimerization Aktivität in Säugerzellen, unter Verwendung der Transfektion von zwei Protein Ausdruck Plasmide (GAL4 DNA-bindende Domäne [DBD] Fusion LBD und VP16 werden Domain [VP16AD] Fusion LBD) nachweisen und eine Gal4-responsive Element (GAL4RE) verschmolzen Luciferase Reporter Plasmid. Wenn die GAL4DBD Fusion LBD und die VP16AD Fusion LBD ein Dimer in den Zellen vornehmen, dieses Protein-Komplex bindet an die GAL4RE und dann aktiviert eine Luciferase-gen-Expression durch die VP16AD-abhängige Transkription-Aktivität. Die 4OHT-vermittelten Luciferase-Aktivierung ist in den HepG2-Zellen, die mit der Maus ERα LBD Fusion Protein Ausdruck Plasmide als in den menschlichen ERα LBD Fusion Protein Ausdruck Plasmid transfizierten Zellen transfiziert wurden höher. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Wirksamkeit der 4OHT-abhängige Maus ERα LBD Homodimerization Tätigkeit höher als menschliche ERα LBD. Die Nutzung des Assays M2H eignet sich im Allgemeinen nicht für die Bewertung der nuklearen Rezeptoren LBD Dimerisierung Aktivität, da agonistische Liganden der basalen Ebene der LBD Aktivität Verbesserung und das erschwert die Erkennung des LBD Dimerisierung Aktivität. Wir fanden, dass 4OHT nicht ERα LBD basale Aktivität verbessert. Das ist ein entscheidender Faktor für die Möglichkeit, zu bestimmen und erkennen der 4OHT-abhängige LBD Dimerisierung Aktivität für M2H Assay erfolgreich im Einsatz. ERα LBD-basierte M2H Assays können angewendet werden, um die teilweisen Agonist Tätigkeit der selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (z.B. 4OHT) zu studieren, in verschiedenen Säugetier-Zelle.
Introduction
Östrogen-Rezeptor Alpha (ERα) ist eine Östrogene Liganden-abhängige Transkription-Regler. Die Aminosäure Sequenceof ERα ist stark zwischen den Arten erhalten. Wegen der höheren Homologie zwischen Mensch und Maus ERα, die Funktion dieser Rezeptoren ist gedacht als identisch und die differenzielle Aktivität der östrogene Substanzen (z.B. Tamoxifen) in jenen Sorten entsteht durch die Arten Unterschiede in chemischen Stoffwechsel und nicht durch die strukturellen Unterschiede der ERα. ERα hat sehr Domänenstrukturen konserviert, die häufig bei der nuklearen Rezeptoren (NR)-Superfamilie, Bezeichnung A bis F Domänen sind. Der E-Domäne oder Liganden-bindende Domäne (LBD) beinhaltet die Liganden-Bindungstasche und die transkriptionelle Aktivierungsfunktion 2, AF-2 genannt. Die F-Domäne ist unmittelbar neben der E-Domäne lokalisiert und ist die variabelste Domäne unter der NRs. Auch zwischen Mensch und Maus ERα, die Homologie des Geschäftsfeldes F ist deutlich geringer als die der anderen Domänen1. Die Liganden gebundenes LBD ERα erhöht die Homodimerization des ERα-Proteins, das jeweilige Östrogen reagierende DNA-Element direkt für die Regulierung der Liganden-abhängige Gentranskription (klassische Aktion des ERα) zu binden. Kristallographische Untersuchungen haben ergeben, dass die differentielle Positionierung der Helix 12 (AF-2 zentrale Domäne) mit Estradiol (E2)- oder 4-hydroxy-Tamoxifen (4OHT) – LBD Dimere2,3gebunden. Die ERα F-Domäne (45 Aminosäuren) Helix 12 direkt verbinden. Allerdings gibt es keine Informationen über die Wirkung dieser Erweiterung von 45 Aminosäuren (F Domäne) aus der Helix 12 auf ERα LBD Dimerisierung. In der vorliegenden Studie zeigen wir den Beitrag der F-Domäne, die artspezifische 4OHT-abhängige ERα LBD-Homodimerization mit einem Säugetier Zweimischling (M2H) Assay.
Die M2H-Assay ist eine Methode, um Protein-Protein-Interaktionen in Säugerzellen, die Einführung der drei verschiedenen Plasmid-DNA nachweisen: zwei Protein Ausdruck Plasmide, die GAL4 DNA-bindende Domäne (DBD) Fusion Fusion ERα LBD und VP16AD ERα LBD zum Ausdruck bringen, und ein GAL4RE verschmolzen Luciferase Reporter Expressionsplasmid. Wenn die GAL4DBD Fusion ERα LBD und die VP16AD Fusion ERα LBD interagieren (stellen ein Dimer) in den Zellen dieser Protein-Komplex bindet an die GAL4RE und dann aktiviert Luciferase-gen-Expression durch die Funktion VP16AD-abhängigen werden. Die LBD Homodimerization können durch die Luciferase-Aktivität bewertet werden.
Die Hefe Zweimischling (Y2H) Test ist eine alternative Methode, basierend auf dem gleichen Prinzip, das Hefe als der Host-Umgebung verwendet. Frühere Berichte über das Y2H-System gezeigt, dass F-Domäne-abgeschnitten menschlichen ERα LBD E2-abhängige Coactivator Einstellung erhöht, zum Schluss, dass die Domain F E2-vermittelten Transkription4verhindert. Dieses Ergebnis widerspricht andere Berichte, die die abgeschwächte transkriptionelle Aktivität der F-Domäne-abgeschnitten menschlichen ERα in Säugerzellen5,6unter Beweis gestellt haben. Vor kurzem, nachweislich unsere Studie mit dem M2H System, die E2-abhängige Coactivator Rekrutierung Aktivität des menschlichen ERα LBD verringerte sich um F Domäne abschneiden in Säugetierzellen und steht im Einklang mit Transkription Aktivität1. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die physiologische Rolle von Protein-Protein Interaktion in einer Zelle Art-spezifisch und Kontext unterscheidet. M2H Assay kann Proteinprotein Interaktion Aktivität im gleichen Zusammenhang mit zellulären zeigen, die für die Bestimmung der transkriptionellen Aktivität verwendet wird. Dies bietet einen Vorteil im Vergleich zu den Y2H oder andere in-vitro- Protein-Protein Interaktion Analysen M2H-Assay.
Es bleiben Fragen über die molekularen Mechanismen der teilweisen Agonist Tätigkeit der selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (SERMs) (z.B. 4OHT) zu ERα-vermittelten Transkription regulieren. ERα LBD-basierte M2H Assays können angewendet werden, um den Mechanismus der teilweisen Agonist Tätigkeit der SERMs in verschiedenen Säugetier-Zelle Arten zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben wir das Protokoll für die M2H Assay mit Schwerpunkt auf der Assay-Bedingungen für die Homodimerization Aktivität von ERα LBD als Vorbild. Im Allgemeinen ist die M2H Assay nicht beliebt für die Beurteilung der Liganden-abhängige ERα LBD Dimerisierung Aktivität. Dies ist aufgrund der ERα LBD besitzen eine transkriptionelle Aktivierungsfunktion; deren Tätigkeit stört, in einigen Fällen die Ergebnisse des M2H Assays. Wie wir hier zeigen, kann jedoch M2H Assay verwendet werden, für die Analyse de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken DRS. Sueyoshi und Wang an das National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts und Tanner Jefferson für die Durchführung von Verfahren auf dem Video. Diese Arbeit wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit Grant 1ZIAES070065 (zu K.S.K.) aus der Division des intramuralen Forschung von den NIEHS unterstützt.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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