Определение активности димеризации лиганд привязки домена Альфа рецептор эстрогена, используя Assay млекопитающих 2 гибрида
Summary
Мы представляем метод для анализа 4-гидрокси тамоксифен зависимой эстроген рецептор альфа-лиганд привязки димеризации доменами с помощью млекопитающих assay 2 гибрида.
Abstract
Эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) является регулятором эстрогенных лиганд зависимых транскрипции. Среди видов высоко сохраняется последовательность ERα белка. Считалось, что функция человека и мыши ERαs идентичны. Мы продемонстрировать эффект дифференциальной 4-гидрокси тамоксифен (4OHT) на мышь и человека ERα лиганд привязки (ОДД) димеризации доменами с помощью млекопитающих assay (м2ч) 2 гибрида. М2ч assay может продемонстрировать эффективность деятельности LBD homodimerization в клетках млекопитающих, используя трансфекции двух плазмид выражение протеина (GAL4 ДНК-связывающих домена [DBD] Сплавливание LBD и VP16 transactivation домена [VP16AD] Сплавливание LBD) и GAL4-отзывчивым элемент (GAL4RE) снаряжен Люцифераза репортер плазмиды. Когда GAL4DBD fusion LBD и VP16AD фьюжн LBD димер в клетках, этот комплекс белков связывается с GAL4RE и, затем, активирует экспрессии генов Люцифераза через деятельность зависимых транскрипции VP16AD. Активация 4OHT-опосредованной Люцифераза выше в HepG2 клетки, которые были transfected с мыши ERα LBD синтеза белка выражение плазмид чем ERα LBD синтеза белка выражение плазмида transfected клеток человека. Этот результат свидетельствует о том, что эффективность 4OHT-зависимых мыши ERα LBD homodimerization активность выше, чем человеческий ERα LBD. В общем использование м2ч assay не подходит для оценки деятельности димеризации LBD ядерных рецепторов, потому что агонистических лигандов повысить базальный уровень активности LBD и что затрудняет обнаружение LBD димеризации активности. Мы обнаружили, что 4OHT не повысить ERα LBD базальную активность. Что является ключевым фактором для того определить и обнаружить 4OHT-зависимых LBD димеризации деятельность для успешно используя assay м2ч. На основе ERα LBD м2ч анализов могут применяться для изучения деятельности частичный агонист селективного эстроген модуляторов рецепторов (например, 4OHT) в различных типах клеток млекопитающих.
Introduction
Эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) является регулятором эстрогенных лиганд зависимых транскрипции. Амино кислоты sequenceof ERα высоко сохраняется среди видов. Из-за более высоких гомологии между человека и мыши ERα, функция этих рецепторов мыслится как идентичные и дифференциального активность эстрогенных веществ (например, тамоксифен) в этих видов вызвана Межвидовые различия в химические метаболизмом, а не структурных различий ERα. ERα хорошо сохранились доменных структур, которые являются общими среди ядерных рецепторов (NR) надсемейства, поручено A F доменов. E домена или лиганд связывающий домен (ОДД) включает в себя лиганд привязки карман и transcriptional активации функции 2, названный AF-2. F домен локализован непосредственно примыкает к области E и является наиболее переменной домен среди НСП. Даже между человека и мыши ERα, гомологии F домена значительно ниже, чем у других доменов1. Лиганд прыгните LBD ERα повышает homodimerization белка ERα, чтобы связать определенный элемент эстроген отзывчивым ДНК непосредственно для регулирования транскрипции гена лиганд зависимые (классическое действие ERα). Кристаллографическая исследования показали дифференциального позиционирования спираль 12 (AF-2 основной домен) с эстрадиола (Е2) – или 4-гидрокси тамоксифен (4OHT) – привязанное LBD димеров2,3. Домен ERα F (45 аминокислоты) Подключите спираль 12 непосредственно. Однако нет никакой информации относительно последствий этого расширения 45 аминокислот (F домен) от спирали 12 на ERα LBD димеризации. В этом исследовании мы продемонстрировать вклад F домена для вегетационных ERα LBD homodimerization 4OHT-зависимых, используя млекопитающих пробирного (м2ч) 2 гибрида.
Assay м2ч способ продемонстрировать белок белковых взаимодействий в mammalian клетках, представляя три различных плазмида ДНК: два белка выражение плазмиды, которые выражают GAL4 ДНК-связывающих доменов (DBD) фьюжн ERα LBD и VP16AD fusion ERα LBD, и GAL4RE-кварцевое Люцифераза выражение репортер плазмиды. Когда GAL4DBD fusion ERα LBD и VP16AD синтеза ERα LBD взаимодействуют (сделать димер) в клетках, этот комплекс белков привязывается к GAL4RE и, затем, активирует Люцифераза экспрессии генов через функцию transactivation VP16AD-зависимых. Уровень LBD homodimerization могут быть оценены Люцифераза деятельности.
Assay (Y2H) 2 гибрида дрождей-альтернативный метод, основанный на тот же принцип, который использует дрожжей в качестве хост-среды. Предыдущие доклады, с использованием системы Y2H продемонстрировал, что F-домен усечение человека ERα LBD увеличивает E2-зависимой coactivator набора, заключение, что домен F предотвращает E2-опосредованной транскрипции4. Этот результат является несовместимым с другими докладами, которые продемонстрировали аттенуированные транскрипционный анализ деятельности F-домен усечение человека ERα в mammalian клеток5,6. Недавно наше исследование, с использованием системы M2H, показали, что активность набора E2-зависимой coactivator человека ERα LBD уменьшается на F домена усечения в mammalian клетках и согласуется с транскрипции деятельность1. Эти наблюдения предполагают, что Физиологическая роль взаимодействия протеин протеина отличается в манере определенного типа клеток и контекст. М2ч assay может продемонстрировать деятельность взаимодействия протеин протеина в том же контексте сотовой, который используется для определения транскрипционный анализ активности. Это обеспечивает преимущество пробирного M2H, по сравнению с Y2H или других в vitro анализ взаимодействия протеин протеина.
Остаются вопросы относительно молекулярные механизмы активность частичный агонист модуляторы рецептора селективного эстрогена (SERM) (например, 4OHT) для регулирования ERα-опосредованной транскрипции. На основе ERα LBD м2ч анализов могут быть применены для изучения механизм частичного агониста деятельности SERM в различных типах клеток млекопитающих.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол M2H assay, сосредоточив внимание на условиях анализа для обнаружения homodimerization деятельность ERα LBD качестве примера. В общем м2ч пробирного не популярен для оценки лиганд зависимой ERα LBD димеризации активности. Это объясняется ERα LBD, обладающие transcriptional активации фун?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Drs. отдела и Ван на Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS) за их критического чтения рукописи и Таннер Джефферсон для выполнения процедуры на видео. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения грант 1ZIAES070065 (для K.S.K.) из отдела интрамуральных исследования NIEHS.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
