Opsporen van de Ligand-bindend domein dimerisatie activiteit van oestrogeen Receptor-Alpha met behulp van de zoogdieren twee-hybride Assay
Summary
Presenteren we een methode voor het analyseren van de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke oestrogeen receptor Alfa ligand-bindend domein dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride assay.
Abstract
Oestrogeen receptor-alpha (ERα) is een oestrogene ligand-afhankelijke transcriptie regulator. De volgorde van ERα eiwit wordt zeer behouden tussen de soorten. Het heeft gedacht dat de functie van de mens en de muis ERαs identiek is. We tonen het effect van de differentiële 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) op de muis en de menselijke ERα ligand-bindend domein (LBD) dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride (M2H) bepaling. De assay M2H kan aantonen dat de efficiëntie van LBD homodimerization activiteit in zoogdiercellen, gebruik makend van de transfectie van twee eiwit expressie plasmiden (GAL4 DNA-bindende domein [DBD] fusie LBD en VP16 transactivation domein [VP16AD]-fusie LBD) en een GAL4-responsief element (GAL4RE) gesmolten luciferase verslaggever plasmide. Wanneer de GAL4DBD fusion LBD en de VP16AD-fusion LBD een dimeer in de cellen, dit complexe eiwit bindt aan de GAL4RE en vervolgens activeert een luciferase genexpressie via de VP16AD afhankelijk transcriptie activiteit. De 4OHT-gemedieerde luciferase activering is hoger in de HepG2 cellen die waren met de muis ERα LBD fusion eiwit expressie plasmiden dan in de menselijke ERα LBD fusion eiwit expressie plasmide transfected cellen transfected. Dit resultaat wijst erop dat de werkzaamheid van de 4OHT-afhankelijke muis ERα LBD homodimerization activiteit hoger dan menselijke ERα LBD. In het algemeen, is het gebruik van de M2H-test niet ideaal voor de evaluatie van nucleaire receptor LBD dimerisatie activiteit, omdat agonistic liganden het basale niveau van de activiteit LBD verbeteren en dat de detectie van LBD dimerisatie activiteit belemmert. We vonden dat 4OHT doet niet verhogen, ERα LBD basale activiteiten. Dat is een belangrijke factor om te kunnen bepalen en op te sporen van de 4OHT-afhankelijke LBD dimerisatie activiteit voor het met succes gebruik van de M2H-bepaling. ERα LBD gebaseerde M2H tests kunnen worden toegepast om te bestuderen van de activiteit van de partiële agonist van selectieve oestrogeen receptor modulatoren (bijvoorbeeld, 4OHT) in verschillende zoogdieren celtypes.
Introduction
Oestrogeen receptor-alpha (ERα) is een oestrogene ligand-afhankelijke transcriptie regulator. Het aminozuur sequenceof ERα is zeer bewaard tussen de soorten. Vanwege de hogere homologie tussen mens en muis ERα, de functie van deze receptoren als identiek is gedacht en de differentiële activiteit van oestrogene stoffen (b.v., tamoxifen) in deze soorten wordt veroorzaakt door de soort verschillen in chemische stofwisseling in plaats van de structurele verschillen van ERα. ERα heeft zeer domeinstructuren die onder de superfamilie van nucleaire receptor (NR gelden), aangewezen van A tot F domeinen behouden. Het E-domein of de ligand-bindend domein (LBD) omvat de ligand-bindende zak en de transcriptionele activering functie 2, AF-2 genoemd. Het domein van F is gelokaliseerd onmiddellijk grenzend aan het domein van E en is het meest variabele domein onder de NRs. Zelfs tussen mens en mouse van ERα, de homologie van het domein van F is aanzienlijk lager dan die van de andere domeinen1. De ligand-gebonden LBD van ERα verbetert de homodimerization van de ERα eiwitten binden van het specifieke element voor het oestrogeen-responsief DNA rechtstreeks voor het reguleren van de ligand-afhankelijke gene transcriptie (klassieke actie van ERα). Kristallografische studies is gebleken de differentiële positionering van helix 12 (AF-2 core domein) met estradiol (E2)- of 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) – gebonden LBD Dimeren2,3. Het domein van de ERα F (45 aminozuren) helix 12 direct verbinden. Er is echter geen informatie over de gevolgen van deze uitbreiding van 45 aminozuren (F domein) uit de helix 12 over de dimerisatie ERα LBD. In deze studie tonen we de bijdrage van het F-domein naar de soortspecifieke 4OHT-afhankelijke ERα LBD homodimerization met behulp van een zoogdieren twee-hybride (M2H) test.
De assay M2H is een methode om aan te tonen van eiwit-eiwitinteractie in zoogdiercellen invoering van de drie verschillende plasmide Ani: twee eiwit expressie plasmiden, die GAL4 DNA-bindende domein (DBD) fusion ERα LBD en VP16AD fusion ERα LBD uitdrukken, en een GAL4RE-gesmolten luciferase expressie verslaggever plasmide. Wanneer de GAL4DBD fusion ERα LBD en de fusie van de VP16AD ERα LBD interactie (Maak een dimeer) in de cellen, dit complexe eiwit bindt aan de GAL4RE en, vervolgens, activeert luciferase genexpressie via de VP16AD-afhankelijke transactivation functie. Het niveau van LBD homodimerization kan worden geëvalueerd door de luciferase activiteit.
De bepaling van gist twee-hybride (Y2H) is een alternatieve methode gebaseerd op hetzelfde principe dat gist als de hostomgeving gebruikt. Eerdere rapporten met behulp van het Y2H-systeem aangetoond dat F-domein-afgekapt menselijke ERα LBD E2-afhankelijke coactivator werving verhoogt, sluiting van dat het domein van F E2-gemedieerde transcriptie4voorkomt. Dit resultaat is inconsistent met andere verslagen die hebben aangetoond de verzwakte transcriptionele activiteit van menselijke ERα in de cellen van zoogdieren5,6F-domein-afgekapt. Onlangs, onze studie, via het systeem M2H aangetoond dat de E2-afhankelijke coactivator recruitment activiteiten van menselijke ERα LBD is daalde met F domein truncatie in zoogdiercellen en met de transcriptie activiteit1 strookt. Deze opmerkingen suggereren dat de fysiologische rol van eiwit-eiwit interactie in een cel type-specifieke wijze en context verschilt. De assay M2H kan aantonen eiwit-eiwit interactie activiteit in dezelfde cellulaire context die wordt gebruikt voor het bepalen van de transcriptionele activiteit. Dit biedt een voordeel van de bepaling van de M2H in vergelijking met de Y2H of andere in vitro eiwit-eiwit interactie analyses.
Er blijven vragen over de moleculaire mechanismen van de activiteit van de partiële agonist van selectieve oestrogeen receptor modulatoren (SERMs) (bijvoorbeeld, 4OHT) voor het regelen van ERα-gemedieerde transcriptie. ERα LBD gebaseerde M2H tests kunnen worden toegepast om te bestuderen van het mechanisme van de gedeeltelijke agonist activiteit van SERMs in verschillende zoogdieren celtypes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin, beschreven we het protocol voor de M2H assay, zich te concentreren op de voorwaarden van de assay voor het opsporen van de activiteit van de homodimerization van ERα LBD als voorbeeld. In het algemeen, is de M2H-test niet populair voor de beoordeling van de ligand-afhankelijke ERα LBD dimerisatie activiteit. Dit is te wijten aan de ERα LBD bezitten een transcriptionele activering functie; waarvan de activiteit stoort, in sommige gevallen, de resultaten van de M2H-bepaling. Zoals we hier laten zien, kan de M2H …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript en Tanner Jefferson Drs. Sueyoshi en Wang op het National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) voor het uitvoeren van de procedures op de video. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid Grant 1ZIAES070065 (naar KSK) vanuit de divisie van intramurale onderzoek naar de NIEHS.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
