Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido
Summary
Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.
Abstract
Alfa do receptor de estrógeno (ERα) é um regulador de estrogênicos transcrição dependente de ligante. A sequência da proteína ERα é altamente conservada entre as espécies. Acredita-se que a função de humanos e mouse ERαs é idêntico. Vamos demonstrar o efeito diferencial 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) no mouse e ERα ligação ligante domínio (LBD) dimerização atividade humana usando o mamíferas dois-híbrido (M2H) ensaio. O ensaio de M2H pode demonstrar a eficiência da atividade homodimerization LBD em células de mamíferos, utilizando o transfection de plasmídeos de expressão duas proteínas (GAL4 DNA-ligando domínio [DBD] fusão LBD e VP16 transactivation domínio [VP16AD] fusão LBD) e um O elemento GAL4-responsivos (GAL4RE) fundido plasmídeo do repórter do luciferase. Quando a fusão GAL4DBD LBD e a fusão de VP16AD LBD fazem um dímero nas células, este complexo proteico vincula o GAL4RE e, em seguida, ativa uma expressão de gene do luciferase através da atividade de transcrição dependente de VP16AD. A ativação do luciferase mediada por 4OHT é maior nas células HepG2 que foram transfectadas com plasmídeos de expressão de proteínas de fusão da LBD ERα o rato do que em ERα LBD fusão proteína expressão plasmídeo transfectada células humanas. Este resultado sugere que a eficácia do mouse 4OHT-dependente da atividade de homodimerization ERα LBD é superior a humana ERα LBD. Em geral, a utilização do ensaio M2H não é ideal para a avaliação da actividade de dimerização do receptor nuclear LBD, porque ligantes agonísticos melhorar o nível basal da atividade LBD e que impede a detecção de atividade de dimerização LBD. Encontramos que essa 4OHT não aumentar a atividade basal ERα LBD. Isso é um fator chave para ser capaz de determinar e detectar a atividade de dimerização LBD 4OHT-dependente para com êxito usando o ensaio de M2H. Ensaios de M2H ERα LBD-based podem ser aplicados para estudar a atividade agonista parcial de moduladores de receptor de estrogênio seletivo (por exemplo, 4OHT) em vários tipos de células de mamíferos.
Introduction
Alfa do receptor de estrógeno (ERα) é um regulador de estrogênicos transcrição dependente de ligante. A sequência de aminoácidos ERα é altamente conservada entre as espécies. Por causa da maior homologia entre humanos e mouse ERα, a função destes receptores é pensada como idêntico, e a atividade diferencial de substâncias estrogênicas (por exemplo, tamoxifeno) dessas espécies é causada por diferenças da espécie em metabolismos químicos em vez das diferenças estruturais de ERα. ERα tem altamente conservadas estruturas de domínio que são comuns entre a superfamília do receptor nuclear (NR), designada aos domínios de F. E domínio ou domínio ligand-ligando (LBD) inclui o bolso de vinculação de ligante e a função de ativação transcricional 2, chamado de AF-2. O domínio de F é localizado imediatamente adjacente ao domínio E e é o domínio mais variável entre as NRs. Mesmo entre humanos e mouse ERα, a homologia do domínio de F é significativamente menor do que a outros domínios1. O limite a ligante LBD de ERα aumenta a homodimerization da proteína ERα para vincular o elemento específico de DNA hormona-responsivo diretamente para regular a transcrição do gene do ligante-dependentes (ação clássica de ERα). Cristalográficos estudos revelaram o diferencial de posicionamento da hélice 12 (domínio do núcleo do AF-2) com estradiol (E2) – ou 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) – limite LBD dímeros2,3. O domínio ERα F (45 aminoácidos) conectar diretamente a hélice 12. No entanto, não há nenhuma informação sobre o efeito desta extensão de 45 aminoácidos (domínio de F) da hélice 12 sobre a dimerização ERα LBD. Neste estudo, demonstramos a contribuição do domínio de F para a espécie 4OHT-dependente ERα LBD homodimerization usando um mamífero dois-híbrido (M2H) ensaio.
O ensaio de M2H é um método para demonstrar as interações da proteína-proteína em células de mamíferos introduzindo os DNAs plasmideo diferentes três: dois plasmídeos de expressão de proteínas, que expressam a fusão de domínio (DBD) GAL4 DNA-ligando ERα LBD e VP16AD fusão ERα LBD, e um Plasmídeo do repórter do luciferase fundido GAL4RE expressão. Quando a fusão GAL4DBD ERα LBD e a fusão de VP16AD ERα LBD interagem (fazer um dímero) nas células, este complexo proteico vincula o GAL4RE e, em seguida, ativa a expressão do gene do luciferase através da função de transactivation VP16AD-dependente. O nível de homodimerization LBD pode ser avaliado pela atividade do luciferase.
O ensaio da dois-híbrido de levedura (Y2H) é um método alternativo baseado no mesmo princípio que usa fermento como o ambiente de host. Usando o sistema de Y2H de relatórios anteriores demonstraram que F-domínio-truncada humana ERα LBD aumenta o recrutamento de coactivator E2-dependente, concluindo que o domínio de F impede a transcrição mediada por E24. Esse resultado é incompatível com outros relatórios que demonstraram a atividade transcricional atenuada do F-domínio-truncada ERα humana no pilhas mamíferas5,6. Recentemente, nosso estudo, utilizando o sistema M2H, demonstrou que a atividade de recrutamento coactivator E2 dependentes de humanos ERα LBD é diminuída por truncamento de domínio F em células de mamíferos e é consistente com a atividade de transcrição1. Estas observações sugerem que o papel fisiológico da interação da proteína-proteína difere em uma maneira de tipo específico de célula e contexto. O ensaio M2H pode demonstrar a atividade de interação da proteína-proteína no mesmo contexto celular que é usado para determinar a atividade transcricional. Isso fornece uma vantagem do ensaio M2H comparado com o Y2H ou outras análises de interação em vitro da proteína-proteína.
Continua a haver perguntas sobre os mecanismos moleculares da atividade agonista parcial de moduladores de receptor seletivo de estrogênio (SERMs) (por exemplo, 4OHT) para regular a transcrição mediada por ERα. Ensaios de M2H ERα LBD-based podem ser aplicados para estudar o mecanismo da atividade agonista parcial de SERMs em vários tipos de células de mamíferos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos o protocolo para o ensaio de M2H, incidindo sobre as condições de ensaio para a detecção da atividade de homodimerization de ERα LBD como um exemplo. Em geral, o ensaio M2H não é popular para a avaliação da atividade de dimerização ERα LBD ligand-dependente. Isto é devido a ERα LBD possuindo uma função de ativação transcricional; perturba a atividade dos quais, em alguns casos, os resultados do ensaio M2H. No entanto, como demonstramos aqui, o ensaio M2H pode ser usado para analisar a …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Sueyoshi DRS e Wang no nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) por sua leitura crítica do manuscrito e Tanner Jefferson para realizar procedimentos no vídeo. Este trabalho foi apoiado pela 1ZIAES070065 de institutos nacionais de saúde Grant (para K.S.K) da divisão de pesquisa Intramural do NIEHS.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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