哺乳類 2 ハイブリッド法によるエストロゲン受容体 α リガンド結合ドメインの二量体化活性の検出
Summary
4-ヒドロキシ タモキシフェン-依存性エストロゲン受容体 α リガンド結合ドメイン二量体化アクティビティ哺乳類の 2 つのハイブリッド試金を使用しての解析法を提案します。
Abstract
エストロゲンの受容器のアルファ (ERα) は、エストロゲンのリガンド依存性転写レギュレータです。ERα タンパク質のシーケンスは、種間保存性が高い。それは人間の機能およびマウス ERαs が同じであると考えられています。マウスと人間の ERα リガンド結合ドメイン (LBD) 二量体化活動哺乳類 2 ハイブリッド (M2H) アッセイを用いた差動 4-ヒドロキシ-タモキシフェン (4OHT) の効果を実証します。M2H アッセイは 2 つ蛋白質発現プラスミド (GAL4 DNA 結合ドメイン [DBD] 融合 LBD と VP16 転写活性化ドメイン [VP16AD] フュージョン LBD) のトランスフェクションを利用した哺乳類セルの LBD ダイマー化活動の効率性を示すことができるとGAL4 応答性エレメント (GAL4RE) は、ルシフェラーゼ レポーター プラスミドを融合しました。GAL4DBD 融合 LBD と LBD VP16AD 融合細胞の二量体を作る、この蛋白質の複合体は、GAL4RE に結合し、その後、VP16AD 依存性転写活動を通じてルシフェラーゼ遺伝子の発現を活性化します。4OHT を介したルシフェラーゼ活性は、マウス ERα LBD 融合タンパク質発現プラスミドよりひと ERα LBD 融合タンパク質発現 transfected プラスミッド細胞を導入させた HepG2 細胞で高い。4OHT 依存マウス ERα LBD ダイマー化活動の有効性は人間の ERα LBD よりも高いと考えられる。一般に、M2H アッセイの使用率は核内受容体 LBD 二量体化活動の評価にとって理想的 LBD 活動の基底のレベルを高め、LBD 二量体化活性の検出を妨げ敵対配位子。その 4OHT に ERα LBD 基底活性強化ないとわかりました。決定および M2H アッセイを正しく使用するための 4OHT 依存 LBD 二量体化活動を検出することの重要な要因であります。ERα LBD M2H アッセイは、様々 な哺乳類の細胞選択的エストロゲン受容体モジュレーター (例えば4OHT) の部分アゴニスト活性を研究する適用できます。
Introduction
エストロゲンの受容器のアルファ (ERα) は、エストロゲンのリガンド依存性転写レギュレータです。アミノ酸順序 ERα 種間保存性が高い。人間で高い相同性のため ERα をマウス、これらの受容体の機能は、同じものとして考えられてし、の種の違いによって引き起こされるそれらの種のエストロゲン様物質 (例えばタモキシフェン) 差分の活動化学代謝 ERα の構造的な違いではなく。ERα は高度 A を F ドメインに指定 (NR) 核内受容体スーパーファミリーの間で共通のドメイン構造に保存します。E ドメインまたはリガンド結合ドメイン (LBD) は、リガンド結合ポケットと転写活性化機能 2、AF 2 という名前です。F ドメインは、E ドメインに隣接はローカライズされ、NRs の間でほとんどの変数のドメインです。人間の間でもマウスの ERα、F ドメインの相同性は、他のドメイン1のそれよりも有意に低かった。リガンド ERα LBD は、リガンド依存性遺伝子の転写 (ERα の古典的なアクション) を規制するために直接特定のエストロゲン応答性 DNA 要素をバインドする ERα 蛋白質のダイマー化を向上させます。結晶構造解析は、LBD ダイマー2,3をバインド配置ヘリックス 12 (AF 2 コア ドメイン) または 4-ヒドロキシ-タモキシフェン (4OHT)、エストラジ オール (E2) との差異を明らかにしました。ERα F ドメイン (45 アミノ酸) ヘリックス 12 に直接接続します。ただし、ERα LBD ートコフェロール ヘリックス 12 から 45 アミノ酸 (F ドメイン) のこの拡張機能の影響に関する情報はありません。本研究では、哺乳類 2 ハイブリッド (M2H) アッセイを用いた特異的 4OHT 依存 ERα LBD ダイマー化を F ドメインの寄与を示しています。
M2H アッセイは哺乳類細胞の 3 つの異なるプラスミド Dna を導入することでタンパク質間相互作用を実証する方法: 2 つのタンパク質発現プラスミド、GAL4 DNA 結合ドメイン (DBD) 融合 ERα LBD と VP16AD の融合 ERα LBD を表現してGAL4RE 融合ルシフェラーゼ発現レポーター プラスミド。GAL4DBD 融合 ERα LBD と VP16AD 融合 ERα LBD が対話する (二量体を作る)、セルのこの蛋白質の複合体、GAL4RE にバインドし、その後、アクティブにルシフェラーゼ遺伝子発現 VP16AD 依存型転写活性化関数を。LBD ダイマー化のレベルは、ルシフェラーゼ活性によって評価できます。
酵母 2 ハイブリッド (Y2H) アッセイは、酵母を使用して、ホスト環境と同じ原理に基づく代替方法です。Y2H システムを使用して以前のレポートは、人間 ERα LBD の F ドメイン切り捨て増加 E2 依存コアクチベーター募集 F ドメインが E2 を介した転写4を防止することを締結することを示した。この結果、哺乳類細胞5,6F ドメイン切り捨て人間 ERα の減衰転写活性を示している他のレポートと一致。最近、M2H システムを使用して、我々 の研究は、人間 ERα LBD の E2 依存コアクチベーター採用活動が哺乳動物細胞での F ドメイン切り捨てによる減少は、転写アクティビティ1と一致を示した。タンパク質間相互作用の生理的役割細胞型固有の方法でコンテキストとは異なることが示唆されました。M2H アッセイは、転写活性を決定するために使用される同じ細胞コンテキストのタンパク質-タンパク質相互作用アクティビティをデモンストレーションできます。これは、Y2H や他の in vitroタンパク質-タンパク質相互作用解析に比べて M2H アッセイの利点を提供します。
選択的エストロゲン受容体モジュレーター (Serm) (例えば4OHT) ERα を介した転写を調節する部分アゴニスト活性の分子メカニズムに関する質問が残っています。ERα LBD M2H アッセイは、様々 な哺乳類の細胞タイプの Serm の部分アゴニスト活性のメカニズムを研究に適用あります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、我々 は例として ERα LBD のダイマー化アクティビティを検出するアッセイ条件に焦点を当て M2H 試金のためのプロトコルを説明します。一般に、M2H アッセイは、リガンド依存性 ERα LBD 二量体化活動の評価のため人気がないです。これは転写活性化機能を有する ERα LBD 原因です。活動はいくつかのケースで、M2H アッセイの結果を妨げます。しかし、我々 がここに示すよう M2H アッセ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、原稿とタナー ジェファーソンの彼らの重要な読書のためのビデオの手順を実行するため夫妻末吉と王で、国立環境衛生研究所 (NIEHS) をありがとうございます。この作品は、(K.S.K.) に、NIEHS の学内研究部門からの国内機関の健康の付与 1ZIAES070065 によって支えられました。
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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