Detectar la actividad de dimerización de dominio Ligand-obligatorio del Receptor de estrógenos alfa usando el análisis de dos híbridos mamífero
Summary
Se presenta un método para el análisis de la 4-hidroxi-tamoxifeno-dependiente de estrógeno actividad del receptor alfa-ligando dominio dimerización usando el ensayo de híbridos de dos mamífero.
Abstract
Receptor de estrógenos alfa (ERα) es un regulador de transcripción ligando-dependiente estrogénica. La secuencia de la proteína ERα es altamente conservada entre especies. Se ha pensado que la función del ser humano y el ratón ERαs es idéntico. Demostramos el efecto diferencial 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) en ratón y ERα ligand-atar dominio (LBD) dimerización actividad humana usando el análisis de (M2H) híbrido de dos mamífero. El ensayo de M2H puede demostrar la eficacia de la actividad de T329N LBD en células de mamíferos, mediante la transfección de plásmidos de expresión de dos proteínas (ADN GAL4 dominio [DBD] fusión LBD y VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusión LBD) y un Elemento GAL4-sensible (GAL4RE) fusionados con el plásmido reportero de luciferasa. Cuando la fusión de GAL4DBD LBD y la fusión de VP16AD DLB un dimer en las células, este complejo de la proteína se une a la GAL4RE y, luego, activa una expresión de gen de luciferasa a través de la actividad de transcripción dependiente de VP16AD. La activación mediada por 4OHT luciferase es mayor en las células HepG2 fueron transfectadas con el ratón ERα LBD fusión proteína expresión plásmidos que el ERα LBD fusión proteína expresión plásmido transfectada las células humanas. Este resultado sugiere que la eficacia del ratón 4OHT-dependiente de la actividad de T329N ERα LBD es superior a la humana ERα LBD. En general, la utilización del ensayo M2H no es ideal para la evaluación de la actividad de dimerización de receptores nucleares LBD, porque ligandos agonistas realzar el nivel basal de la actividad LBD e impide la detección de actividad de dimerización de LBD. Se encontró que 4OHT no mejorar la actividad basal de ERα LBD. Es un factor clave para poder determinar y detectar la actividad de dimerización de LBD dependiente de la 4OHT para usar con éxito el ensayo de M2H. M2H ensayos de ERα LBD pueden aplicarse para estudiar la actividad de agonista parcial de moduladores selectivos de estrógeno receptor (e.g., 4OHT) en varios tipos de células de mamífero.
Introduction
Receptor de estrógenos alfa (ERα) es un regulador de transcripción ligando-dependiente estrogénica. El aminoácido sequenceof ERα es altamente conservada entre especies. Debido a la mayor homología entre humanos y ratón ERα, la función de estos receptores es considerada como idéntico, y la actividad diferencial de sustancias estrogénicas (p. ej., tamoxifeno) en las especies es causada por las diferencias de las especies de metabolismos químicos en lugar de por las diferencias estructurales de ERα. ERα altamente ha conservado las estructuras de dominio que son comunes entre la superfamilia de receptores nucleares (NR), señalada A que dominios de F. El dominio E o dominio de unión a ligando (LBD) incluye el bolsillo del atascamiento del ligand y la función de activación transcripcional 2, llamado AF-2. El dominio de F se localiza inmediatamente adyacente al dominio E y es el dominio más variable entre lo NRs. Incluso entre humanos y ratón ERα, la homología del dominio de F es menor que el de los otros dominios1. El LBD ligando enlazado de ERα mejora T329N de la proteína ERα para enlazar el elemento específico de la DNA estrógeno-sensibles directamente para la regulación de la transcripción de genes dependientes de ligando (acción clásica de ERα). Estudios Cristalográficos han revelado el posicionamiento diferencial de la hélice 12 (dominio de base de AF-2) con estradiol (E2) o 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) – límite LBD dímeros2,3. El dominio de F ERα (45 aminoácidos) Conecte hélice 12 directamente. Sin embargo, no hay información sobre el efecto de esta extensión de 45 aminoácidos (dominio de F) de la hélice 12 en la dimerización de ERα LBD. En este estudio, se demuestra la contribución del dominio de F para lo específicos dependientes de la 4OHT LBD ERα T329N usando un mamífero dos hybrid (M2H) análisis.
El ensayo de M2H es un método para demostrar las interacciones de la proteína-proteína en células de mamíferos introducción los DNAs de distintos plásmidos tres: dos plásmidos de expresión de la proteína, que expresan la fusión de dominio (DBD) de ADN de GAL4 LBD de ERα y VP16AD fusión ERα LBD, y un Plásmido de reportero de luciferasa fusionados con GAL4RE expresión. Cuando la fusión de GAL4DBD LBD ERα y la fusión de VP16AD LBD ERα interactuan (hacer un dimer) en las células, este complejo de la proteína se une a la GAL4RE y, luego, activa la expresión de genes de la luciferasa a través de la función de transactivación dependiente de la VP16AD. El nivel de LBD T329N puede evaluarse por la actividad de luciferasa.
La levadura dos híbridos (Y2H) es un método alternativo basado en el mismo principio que utiliza la levadura como el entorno de host. Informes anteriores mediante el sistema de Y2H demostraron que F-dominio-truncado humano ERα LBD aumenta reclutamiento de E2 dependiente del coactivator, concluyendo que el dominio de F previene la transcripción mediada por E24. Este resultado es coherente con otros informes que han demostrado la actividad transcripcional atenuada de ERα humano F-dominio-truncado en células de mamíferos5,6. Recientemente, nuestro estudio, utilizando el sistema M2H, demostró que la actividad de contratación del coactivator de E2 dependiente de humano ERα LBD disminuye por truncamiento del dominio de F en células de mamífero y es consistente con transcripción actividad1. Estas observaciones sugieren que el papel fisiológico de la interacción proteína-proteína es diferente en un contexto y forma de tipo específico de célula. El ensayo de M2H puede demostrar actividad de interacción de proteínas en el mismo contexto celular que se utiliza para la determinación de la actividad transcripcional. Esto proporciona una ventaja del ensayo M2H comparado con el Y2H u otros análisis de interacción en vitro proteínas.
Quedan preguntas con respecto a los mecanismos moleculares de la actividad de agonista parcial de moduladores de receptores de estrógeno selectivo (SERM) (e.g., 4OHT) para regular la transcripción mediada por el ERα. M2H ensayos de ERα LBD pueden ser aplicados para estudiar el mecanismo de la actividad de agonista parcial de los SERM en varios tipos de células de mamífero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adjunto, describimos el protocolo para el ensayo de M2H, centrándose en las condiciones de ensayo para la detección de la actividad de T329N de ERα LBD como ejemplo. En general, el ensayo M2H no es popular para la evaluación de la actividad de dimerización ligand-dependiente ERα LBD. Esto es debido a la LBD ERα poseen una función de activación transcripcional; la actividad que molesta, en algunos casos, los resultados del ensayo M2H. Sin embargo, como se demuestra aquí, el ensayo M2H puede ser usado para el an?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los Drs. Sueyoshi y Wang en el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) para su lectura crítica del manuscrito y Jefferson de Tanner para realizar procedimientos en el video. Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud beca 1ZIAES070065 (a K.S.K.) de la división de investigación intramuros de la NIEHS.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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