Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama
Summary
Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.
Abstract
Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. ERα protein dizi türleri arasında son derece korunmuş. İnsan işlevinin ve fare ERαs aynı olduğunu düşündüm. Fare ve insan ERα ligand bağlayıcı etki (yakın) dimerization etkinliği memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak fark 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) etkisi göstermektedir. M2H tahlil kullanan iki protein ifade plazmid (GAL4 DNA’ya bağlanıcı etki alanı [DBD] füzyon yakın ve VP16 transactivation etki alanı [VP16AD] füzyon yakın) transfection yakın homodimerization aktivite memeli hücrelerinde verimliliğini kanıtlamanın ve bir GAL4 duyarlı öğesi (GAL4RE) luciferase muhabir plazmid erimiş. GAL4DBD fusion yakın ve VP16AD füzyon yakın bir dimer hücrelerde yaptığınızda, bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve sonra bir luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağımlı transkripsiyonu faaliyetleri ile hiçbir devreye giriyor. 4OHT-aracılı luciferase harekete geçirmek fare ERα yakın füzyon protein ifade plazmid insan hücrelerinde ERα yakın füzyon protein ifade transfected plazmid ile transfected HepG2 hücreleri yüksektir. Bu sonuç 4OHT bağımlı fare ERα yakın homodimerization faaliyet etkinliği insan ERα yakın yüksek olduğunu göstermektedir. Genel olarak, M2H tahlil kullanımı agonistik ligandlar yakın etkinlik bazal düzeyini arttırmak ve bu yakın dimerization aktivite tespiti engellemektedir Çünkü nükleer reseptör yakın dimerization etkinlik, değerlendirme için ideal değildir. Bulduğumuz o 4OHT ERα yakın bazal etkinlik geliştirmez. Bu belirlemek ve M2H tahlil başarıyla kullanmak için 4OHT bağlı yakın dimerization aktivite tespit edememek için önemli bir faktördür. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist etkinliği seçici östrojen reseptör modülatörleri (Örneğin, 4OHT) ile çalışmaya çeşitli memeli hücre tiplerinde uygulanabilir.
Introduction
Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. Amino asit sequenceof ERα türler arasında son derece korunmuş. İnsan arasında daha yüksek Homoloji nedeniyle ve ERα fare, bu reseptörleri işlevini, aynı düşünce ve östrojenik maddeler (Örneğin, Tamoksifen) bu türlerin farklı etkinlik türün farklılıkları nedeniyle oluşur kimyasal metabolizmaları ERα yapısal farklılıklar tarafından değil. ERα son derece A F etki alanlarına belirlenmiş nükleer reseptör (NR) üst aile arasında yaygın etki alanı yapılarına korunmuş. E veya ligand bağlayıcı etki alanı (yakın)-ligand taşıması cep ve transkripsiyon aktivasyon fonksiyonu 2, içerir AF-2 adlı. F etki alanı hemen E etki alanına bitişik yerelleştirilmiştir ve NRs arasında en değişken etki alanıdır. Hatta insan arasında ve ERα fare, Homoloji F etki alanının önemli ölçüde diğer etki alanları1daha düşüktür. ERα ligand bağlı yakın (ERα klasik eylem) ligand-bağımlı Gen transkripsiyonu düzenleyen için doğrudan belirli östrojen duyarlı DNA öğeyi bağlamak için ERα protein homodimerization artırır. Helix 12 (AF-2 çekirdek etki alanı) ile estradiol (E2) – ya da 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) – Diferansiyel konumlandırma bağlı yakın dimer2,3Crystallographic çalışmalar ortaya koymuştur. ERα F etki alanı (45 amino asitler) helix 12 doğrudan bağlayın. Ancak, ERα yakın dimerization bu eklentinin helix 12 üzerinden 45 amino asitlerin (F etki alanı) etkisi ile ilgili hiçbir bilgi yoktur. Bu çalışmada, bir memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak species-specific 4OHT bağlı ERα yakın homodimerization F etki alanına katkısını göstermek.
M2H tahlil üç farklı plazmid DNA’lar tanıtımı memeli hücrelerinde protein-protein etkileşimlerini göstermek için bir yöntemdir: GAL4 DNA’ya bağlanıcı etki alanı (DBD) füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın hızlı, iki protein ifade plazmid ve bir GAL4RE erimiş luciferase ifade muhabir plazmid. Ne zaman GAL4DBD füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın etkileşim (yapmak bir dimer) hücrelerde bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve, sonra luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağlı transactivation işlevi aracılığıyla etkinleştirir. YAKIN homodimerization düzeyini luciferase aktivite değerlendirilebilir.
Maya iki-hibrid (Y2H) tahlil Maya ana bilgisayar ortamı olarak kullanır aynı ilkeye göre alternatif bir yöntemdir. Y2H sistemi kullanarak önceki raporları F-etki alanı-kesme insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım, F etki alanı E2-aracılı transkripsiyon4engeller sonuç artar gösterdi. Bu sonuç hangi insan ERα memeli hücreleri5,6F-etki alanı-kesme zayıflatılmış transkripsiyon faaliyet gösterdiği diğer Özet Tablo raporları ile tutarsız. Son zamanlarda, bizim çalışma M2H sistemiyle, insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım etkinliği tarafından F etki alanı kesme memeli hücrelerinde azalma ve transkripsiyon etkinlik1ile tutarlıdır gösterdi. Bu gözlemler protein-protein etkileşim fizyolojik rolü bir hücre türüne özgü şekilde ve içeriği farklıdır öneririm. M2H tahlil protein-protein etkileşim Etkinlik transkripsiyon etkinliğini belirlemek için kullanılan aynı hücresel bağlamında kanıtlamanın. Bu Y2H ya da diğer vitro protein-protein etkileşim analizleri ile karşılaştırıldığında M2H testin bir avantaj sağlar.
Seçici östrojen reseptör modülatörleri (SERMs) (Örneğin, 4OHT) ERα-aracılı transkripsiyonu düzenleyen kısmi agonist etkinliğinin moleküler mekanizmaları ile ilgili sorular kalır. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist aktivitesinde SERMs çeşitli memeli hücre türleri mekanizması çalışmaya uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, ERα yakın homodimerization aktivite örnek olarak algılamak için tahlil koşullar odaklanan M2H tahlil için protokol açıkladığımız. Genel olarak, M2H tahlil ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinlik değerlendirmesi için popüler değil. Bu ERα bir transkripsiyon etkinleştirme işlev sahip yakın nedeniyle. Hangi etkinlik rahatsız ediyor, bazı durumlarda, M2H tahlil sonuçları. Biz burada göstermek gibi ancak, M2H tahlil yakın (Örneğin, 4OHT, SERMs) AF-2 transactivation iş…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Drs. Sueyoshi ve Wang, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) için el yazması ve Tanner Jefferson okuma kritik videoda yordamları gerçekleştirmek için teşekkür ederiz. Bu eser (adı için) Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1ZIAES070065 NIEHS, Intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
- Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
- Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
- Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
- Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
- Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
- Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
- Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
- Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
- Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
- Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
- Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).
