利用哺乳动物双杂交法检测雌激素受体α的配联域二维化活性
Summary
我们提出了一种方法来分析 4-羟基他莫西芬依赖雌激素受体α配体结合域二聚化活性的哺乳动物双杂交法。
Abstract
雌激素受体α (erα) 是一种雌激素配体依赖性转录调节剂。在物种中, erα蛋白的序列高度保守。人们认为人和小鼠的 erα功能是相同的。我们证明了差异 4-羟基他莫西芬 (4oht) 对小鼠和人 erα配体结合域 (lbd) 二聚化活性的影响, 使用哺乳动物双杂交 (m2h) 法。m2h 分析可以利用两个蛋白质表达质粒 (gal4 dna 结合域 [dbd] 融合 lbd 和 vp16 转活化域 [vp16ad] 融合 lbd) 的转染, 证明 lbd 在哺乳动物细胞中的共读活性的有效性。gal4 反应元件 (gal4re) 熔融荧光素酶报告质粒。当 gal4dbd 融合 lbd 和 vp16ad 融合 lbd 在细胞中产生二聚体时, 这种蛋白质复合体与 gal4re 结合, 然后通过 vp16ad 依赖转录活性激活荧光酶基因表达。用小鼠 erαlbd 融合蛋白表达质粒转染的 hepg2 细胞的 4 oh 介导的荧光素酶激活率高于人 erαlbd 融合蛋白表达质粒转染细胞。结果表明, 4oht 依赖性小鼠 erαlbd 共读活性高于人 erαlbd。一般来说, m2h 分析的使用并不理想于评估核受体 lbd 二聚化活性, 因为抗性配体增强了 lbd 活性的基础水平, 并阻碍了 lbd 二聚体活性的检测。我们发现4oht 不能增强 erα lbd 的基础活性。这是能够确定和检测与4oht 相关的 lbd 二聚化活性的关键因素, 以便成功地使用 m2h 检测。基于 erα lbd 的 m2h 检测可用于研究选择性雌激素受体调节剂 (如4oht) 在不同哺乳动物细胞类型中的部分激动剂活性。
Introduction
雌激素受体α (erα) 是一种雌激素配体依赖性转录调节剂。erα的氨基酸序列在物种中高度保守。由于人类和小鼠 erα的同源性较高, 这些受体的功能被认为是相同的, 而这些物种中雌激素物质 (如他莫西芬) 的差异活性是由该物种在化学代谢, 而不是由 erα的结构差异。erα具有高度保守的域结构, 这些结构在核受体 (nr) 超家族中很常见, 被指定为 a 到 f 域。e 域或配体结合域 (lbd) 包括配体结合口袋和转录激活功能 2, 名为 af-2。f 域紧邻 e 域进行本地化, 是 nr 中变化最大的域。即使在人和小鼠 erα之间, f 域的同源性也明显低于其他域1。erα的配体 lbd 增强了 erα蛋白的同质化, 直接结合特定的雌激素反应 dna 元素, 以调节木质依赖性基因转录 (erα的经典作用)。晶体学研究揭示了螺旋 12 (af-2 核域) 与雌二醇 (e2) 或 4-羟基-他莫西芬 (4oht) 结合 lbd 二聚体2,3的差异定位。erαf 域 (45个氨基酸) 直接连接螺旋12。然而, 没有关于这种扩展45氨基酸 (f 域) 从螺旋12对 erα lbd 二聚化的影响的信息。在这项研究中, 我们证明了 f 域的贡献, 特定于物种依赖的 eα lbd 同质化使用哺乳动物双杂交 (m2h) 的分析。
m2h 检测是一种证明哺乳动物细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的方法, 它引入了三种不同的质粒 dna: 两种蛋白表达质粒, 表达了 gal4 dna 结合域 (dbd) 融合 erαlld 和 vp16ad 融合 erαldd, 和gal4re 熔融荧光素酶表达报告质粒。当 gal4dbd 融合 erαlbd 和 vp16ad 融合 erα lbd 在细胞中相互作用 (使二聚体) 时, 这种蛋白质复合体与 gal4re 结合, 然后通过 vp16ad 相关的转活化功能激活荧光酶基因表达。lbd 共氧化水平可以通过荧光素酶活性来评价。
酵母双杂交 (y2h) 检测是一种基于与宿主环境相同的原理的替代方法。以前使用 y2h 系统的报告表明, f-域截断人 erα lbd 增加了 e2 依赖协同剂的招募, 结论是 f 域阻止 e2 介导的转录4。这一结果与其他报告不一致, 这些报告表明 f-域截断人 erα在哺乳动物细胞5,6中的衰减转录活性。最近, 我们的研究表明, 利用 m2h 系统, 人类 erαlbd 的 e2 依赖共激活剂的招募活性在哺乳动物细胞中的 f 域截断降低, 并与转录活性1一致。这些观察表明, 蛋白质-蛋白质相互作用的生理作用在细胞类型特定的方式和背景不同。m2h 检测可以在用于确定转录活性的同一细胞环境中显示蛋白质-蛋白质相互作用。与 M2H 或其他体外蛋白质-蛋白质相互作用分析相比, 这提供了 m2h 分析的优势。
关于选择性雌激素受体调节剂 (serm) (例如, 4oht) 调节 erα介导的转录的部分激动剂活性的分子机制仍存在疑问。基于 erα lbd 的 m2h 检测可用于研究各种哺乳动物细胞类型中 serm 的部分激动剂活性的机制。
Protocol
Representative Results
Discussion
在此, 我们描述了 m2h 检测的方案, 重点介绍了检测 erα lbd 共读活性的检测条件。一般来说, m2h 检测是不受欢迎的评估配体依赖 erα lbd 二聚化活性。这是由于 erα lbd 具有转录激活功能;在某些情况下, 其活性会干扰 m2h 测定的结果。然而, 正如我们在这里所证明的, m2h 分析可用于分析某些不激活 lbd af-2 转化功能的物质 (例如, 4oht, serm) 的 lbd 二聚体活性。为了减少 lbd (背景活动) 的内在活性, 我?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢国家环境卫生科学研究所 (niehs) 的 sueyoshi 博士和 wang 博士对手稿的批判性解读, 并感谢坦纳·杰斐逊在视频中执行的程序。这项工作得到了 niehs 内部研究司的国家卫生研究所 1zaaes070065 (至 k. s. k.) 的支持。
Materials
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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