Summary
המטרה של פרוטוקול זה נועד להמחיש כיצד להשתמש בעכבר cardiomyocytes neonatal כמערכת מודל לבחון איך גורמים יכול לשנות את צריכת החמצן של הלב.
Abstract
המיטוכונדריה, מטבוליזם חמצוני הם קריטיים לשמירה על תפקוד שריר הלב. מחקרים הראו שכי תפקוד מיטוכונדריאלי הוא גורם חשוב לתפקוד הלב לקוי נמצא באי ספיקת לב. לעומת זאת, שחזור פונקציה מיטוכונדריאלי פגומים ייתכן השפעות מועילות לשיפור תפקוד הלב אצל הלב נכשל. לכן, לומד את מנגנוני הרגולציה וזיהוי הרגולטורים הרומן לתפקוד מיטוכונדריאלי יכול לספק תובנה שניתן להשתמש בהם כדי לפתח מטרות טיפוליות חדשות לטיפול מחלת לב. כאן, myocyte לב נשימה מיטוכונדריאלי ניתוח באמצעות מערכת התרבות תאים ייחודיות. ראשית, פרוטוקול מוטבה כדי לבודד במהירות, תרבות גבוהה הכדאיות העכבר neonatal cardiomyocytes. לאחר מכן, מנתח 96-ובכן עיצוב השטף חוץ-תאית משמש כדי להעריך את קצב צריכת החמצן של אלה cardiomyocytes. עבור פרוטוקול זה, אנו ממוטב זריעה תנאים, הפגינו שקצב צריכת החמצן הזה העכבר neonatal cardiomyocytes יכול להידרש בקלות מנתח השטף חוץ-תאית. ולבסוף, נציין כי הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם לגודל תרבות גדול יותר, מחקרים אחרים, כגון העברת אותות תאיים ו כויץ לתפקד ניתוח.
Introduction
כדי לקיים את הפונקציה כויץ לב רציפה, cardiomyocytes חייב לשמור על אספקה קבועה של האנרגיה התאית בעיקר בצורת ATP1. בלב, כ- 95% של ATP נוצר על ידי המיטוכונדריה, בעיקר באמצעות זרחון חמצוני, מראה כי המיטוכונדריה תפקיד מכריע bioenergetic תפקוד הלב2,3. תמיכה מושג זה זה dysregulation של הפונקציה מיטוכונדריאלי יכול להוביל4,של שריר הלב, אי ספיקת לב-5. לעומת זאת, שחזור פונקציה מיטוכונדריאלי הוכח לשפר את תפקוד הלב של הכשל של הלב6,7. לכן, לומד את המנגנון של ביואנרגיה מיטוכונדריאלי וזיהוי הרגולטורים הרומן של פונקציית מיטוכונדריאלי cardiomyocytes יהיה לא רק לחשוף תובנות מכניסטית הפקת האנרגיה הלב אך גם יכולה לספק תובנות אשר תוביל להתפתחות של מטרות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות לב6,8.
בהשוואה ל לב שלם, אשר מכיל תערובת של השריר ואת הלא נייטרלים9, cardiomyocyte תרבויות הם מאוד טהור, עם זיהום מזערי של הלא-נייטרלים מהלב, כגון fibroblasts, תאי אנדותל10. בנוסף, בידוד cardiomyocytes מן הגורים neonatal מאפשר culturing מספר גדול של תאים בכמות קטנה של זמן, לעומת תאי בידוד מ לבבות למבוגרים10,11. והכי חשוב, cardiomyocytes העכבר למבוגרים בתרבית הראשי יש הישרדות קצר פעמים (למשל 24 שעות), זמן ארוך יותר נקודות de-להבדיל. העכבר neonatal cardiomyocytes יכול לשרוד, להיות מניפולציה על למעלה מ- 7 ימים בתרבות, הופכות אותה לאידיאלית עבור בחינת השפעת סמים תרכובות ומניפולציה הגן על הפונקציה של המיטוכונדריה cardiomyocytes10. כמובן, ישנם הבדלים ביולוגיים משמעותיים בין התאים למבוגרים ו- neonatal, אך משך הזמן הארוך זמינים עבור התרבות של תאים neonatal גורם להם המתאים עבור סוגים שונים של מחקרים, כולל אלה של הפונקציה מיטוכונדריאלי.
עד כה, ראשי בתרבית neonatal עכבר ועכברוש, cardiomyocytes שימשו כמודלים ללימודי ביואנרגיה לב12,13. בשנים האחרונות, מחקרים משמש מנתח השטף חוץ-תאית למדוד את קצב צריכת החמצן (OCR) ולהעריך קיבולת חמצוני עכבר ועכברוש, neonatal cardiomyocytes14,15. בעוד בהשוואה חולדות, הכדאיות תא של העכבר cardiomyocytes neonatal נמוכה ויש לו השתנות גדולה יותר16. היכולת ללמוד תאים מהונדסים גנטית עכבר מודלים מאפשר גם המודל תא העכבר חשוב מאוד. בהתחשב בכך OCR מחקרים הם כל כך רגיש לתא זריעה צפיפות ומספר, נדרש פיתוח פרוטוקול לשחזור אמין, פשוט כדי להשיג תשואה תא עקבי הכדאיות.
כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימיזציה אשר פותחה העושה שימוש בעכבר בתרבית cardiomyocytes neonatal יחד עם מאבחן 96-ובכן-עיצוב חוץ-תאית השטף לניתוח OCR. פרוטוקול זה מגדיל מאוד הפארמצבטית של וזמינותו. בנוסף, הפרוטוקול מספקת הרומן שיטה לשחזור לניתוח OCR אלא גם יכול להיות מותאם תרבות גודל גדול יותר למטרות ניסוי אחרים, כגון זו אשר עשוי להיות נחוץ ללמוד פונקציות myofibrillar, תאיים איתות המסלולים.
בפרט, פרוטוקול זה מתאר שגרה יום אחד עבור בידוד והתרבות של העכבר neonatal cardiomyocytes בצלחת תרבות תא 96-ובכן. בנוסף, הוא מתאר את ההליך כדי למדוד את צריכת החמצן באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית. כל הפתרונות בשימוש סטרילי או סינון סטרילי. כל הכלים סטריליים על ידי 75% אתנול. אנו מספקים את הטבלה של חומרים עבור חלקים שונים של ההליך. עבור culturing cardiomyocytes, כל ההליכים והשלבים מבוצעים בשכונה תרבות תא סטנדרטי. פרוטוקול זה מפותח עבור בידודו של העכבר neonatal לבבות של המלטה אחת (כ 8-10 הגורים). עם זאת, הפרוטוקול ניתן להתאים גם לבידוד cardiomyocytes של המלטות מרובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לעבודה עם עכברים neonatal, נא להפנות קבע הנחיות האוניברסיטה המקומית/מכון הלאה על-ידי תוכניות טיפול בבעלי חיים, לדבוק מוסדיים ואחרים רגולציות אחד. כל השיטות המתוארות פרוטוקול זה אושרו על ידי UC סן דייגו אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC), לדבוק הפדרלי ואת המדינה.
1. הכנת נוגדנים
- להכין 25 מ של פתרון בעיכול: HBSS (בלי Ca2 + ו Mg2 +) בתוספת טריפסין (0.5 mg/mL). לעקר את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 ולשמור בקירור עד השימוש. להפוך את פתרון בעיכול ביום של הניסוי.
הערה: זה קריטי להשתמש HBSS ללא Ca2 + , מ ג2 +,2 + Ca ו- Mg2 + יגרום להתכווצות myocyte מות תאים עוקבים במהלך בידוד. - הכנת 30 מ של מאגר עיכול collagenase: collagenase (0.8 מ"ג/מ"ל, כ U/mL 350) מומס מאגר HBSS (ללא Ca2 + ו Mg2 +). לעקר את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 ולשמור בקירור עד השימוש. להפוך collagenase עיכול פתרון ביום של הניסוי.
- הכנת 500 מ"ל של cardiomyocyte תרבות התקשורת (מדיה צמיחה): מערבבים 375 מ של DMEM, 125 מ של M-199, 25 מ של הסוס סרום ו מ"ל של FBS. תוספת עם פניצילין 1%, 1% פתרון סטרפטומיצין.
- להכין בדיקה מיטוכונדרית בינוני: להפוך 200 מ ל DMEM המבוסס על בדיקת המאמץ בינונית (DMEM ללא NaHCO3, ראה טבלה של חומרים) בתוספת 1 מ"מ נתרן פירובט, 2 מ מגלוטמין, גלוקוז 10 מ מ, ואת 2 מ מ Hepes.
הערה: להפוך 1 ליטר של מדיום עם DMEM ללא נתרן פירובט, -גלוטמין, גלוקוז, Hepes, במיון סטרילי, ולאחסן ב- 4 מעלות צלזיוס. להכין המדיום בדיקה ביום של וזמינותו על-ידי הוספת אחרים. שימוש DMEM הבינונית ללא NaHCO3 הוא קריטי. - להתאים את ה-pH של מדיה בדיקה מיטוכונדרית 7.4 ביום של שימוש. מדיה חמים עד 37 ° C לפני השימוש.
- הכנת oligomycin: להכין 5 מ של פתרון מניות 5 מ מ בדימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
- הכנת FCCP: להכין 5 מ של פתרון מניות 5 מ מ בדימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
- להכין antimycin A: להכין 5 מ של פתרון מניות 5 מ מ בדימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
- להכין rotenone: להכין 5 מ של פתרון מניות 5 מ מ בדימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
הערה: כל ריאגנטים ופתרונות בשימוש פרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1.
2. האיסוף, בעיכול הלבבות של עכברים Neonatal (יום 1)
- אוטוקלב מספריים, מלקחיים, כפית מוריה לחטא.
- ביצוע כל הצעדים למכסה תרבות תא בשביל בעקרות.
- Aliquot 5 מ"ל של HBSS (ללא Ca2 +, Mg2 +) עד כל טוב של צלחת תרבות תא 6-טוב; מניחים על קרח. Aliquot 10 מ של HBSS לתוך תבשיל תרבות תא 10 ס מ.
- להכין 20 מ של טריפסין בעיכול פתרון צינור חרוטי סטרילי 50 מ. שמור כל הפתרונות על קרח.
- במהירות לטבול היילוד (יום 0) עכברים בפתרון אתנול 70% עבור עיקור.
- לערוף הגורים באמצעות מספריים סטרילי (ישר) ללא הרדמה, ולאחר מכן פתח את החזה לאורך עצם החזה כדי לאפשר גישה בחלל החזה ואת הלב. (איור 1 א')
הערה: 1) זה קריטי להשתמש עכברים neonatal P0 להשגת תא גבוהה הכדאיות. 2) שיטה. זו המתת חסד מותרת עבור neonates על פי הנחיות של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית ו- NIH- 17. - תמצית לבבות מהגוף עם מספריים בסדר, העברה מיידית לתוך המנה תרבות עקרה תא המכיל HBSS (ללא Ca2 +, Mg2 +) (איור 1B).
- להסיר את כל רקמת הריאה שיורית, כלי גדול, וכו ' (ואת אטריה, במידת הצורך). רחץ לבבות בפתרון HBSS תסיסה עדינה.
- חותכים כל לב עם מספריים בסדר 8 חתיכות ולהעביר את רקמת הלב כל עם מלקחיים לבאר אחת של צלחת תרבות תא 6-טוב עם HBSS (איור 1C ו ד 1).
- לשטוף את ליבם על ידי העברת את הלבבות טוב טוב בצלחת 6-ובכן מלא HBSS, באמצעות כפית מוריה (איור 1D).
הערה: העברת את הלב טוב טוב הוא מספיק כדי לשטוף את הדם. מאז דם מפריע עיכול אנזימטי חשוב לשטוף את הלבבות עם HBSS ולהסיר את הדם. - להעביר את הלבבות עם כפית מוריה לתוך צינור חרוטי המכיל 20 מ של טריפסין (0.5 mg/mL), דגירה עם עצבנות עדין ב 4 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות (איור 1E).
3. מכינים צלחת 96-ובכן תרבות (יום 1)
- להכין 5 מ של ציפוי פתרון: PBS המכילה ג'לטין 0.5% (אוטוקלב לפני השימוש) והפתרון fibronectin 1%. (למשל פתרון ג'לטין מ ל בתוספת 50 µL של פתרון fibronectin)
- Aliquot 50 µL של ציפוי פתרון לבאר כל צלחת תרבות 96-ובכן תא (ראה טבלה של חומרים). אם בועות קיימות, להסיר אותם באמצעות פיפטה 20 µL למצוץ בועות החוצה.
הערה: חשוב לכסות את כל שטח הפנים של כל טוב עם ציפוי פתרון. - דגירה את הצלחת ב חממה התרבות התא 37 ° C 1 h או יותר כדי לאפשר ייבוש של ציפוי מטריקס.
- תשאף כל פתרון ציפוי שיורית לפני זריעה cardiomyocytes.
4. אנזימטי לעיכול, ציפוי של תאים (יום 1)
- לחמם collagenase פתרון עיכול באמבט מים 37 º C.
הערה: זה צעד חשוב להשיג יעילות עיכול אנזימטי. - להזיז את הצינור חרוט המכיל לבבות והפתרון בעיכול של 4 ° C כדי ברדס תרבות תא. (איור 1F)
- תן הלבבות לשקוע לתחתית הצינור ולהסיר את הפתרון בעיכול באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל (1-2 מ"ל של המדיום בידוד עשויה להישאר בצינור).
- להוסיף 10 מ של HBSS לתוך הצינור. להשעות מחדש את הלבבות עם HBSS 2 - 3 פעמים כדי לשטוף טריפסין באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל. האחות HBSS (1-2 מ ל עשויים להישאר בצינור).
- להוסיף 10 מ של פתרון מערכת העיכול collagenase ומחוממת מראש לתוך הצינור עם לבבות. (איור 1 ג'י)
- דגירה ברכבת התחתית עם לבבות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בלי עצבנות (1 עיכול).
- לאחר עיכול 1, להעביר את הצינור למכסה התרבות תאים. Triturate לבבות בעדינות על ידי השעיית מחדש את הלבבות בתוך הצינור בעדינות 10 פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ. זה יאפשר לבבות לפיזור ותאים להשתחרר מרקמות ללב. (איור 1 H)
הערה: מאז cardiomyocytes שברירי, עדין trituration חשוב להשיג את הכדאיות גבוהה. - תן את הרקמה מעוכל כיור, העברת פתרון מתעכל המועשר cardiomyocytes (כ 9-10 מ"ל) אל צינור חרוטי, ולהוסיף מיד כמות שווה של התא תרבות המדיה כדי לעצור את העיכול collagenase.
- להוסיף 10 מ של פתרון מערכת העיכול collagenase לתוך הצינור המכיל את רקמת הלב מעוכל הנותרים.
- דגירה ברכבת התחתית עם רקמת הלב באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (2nd עיכול).
- חזור על הליך 4.7 ו- 4.8.
הערה: אם יש עדיין הרבה מעוכל רקמות, חזור על עיכול עוד פעם אחת. עם זאת, ברוב המקרים, שני digestions הם מספיק כדי לפזר את רוב התאים של רקמת הלב. - מקום סטרילי תא-מסננת (100 מיקרומטר רשת ניילון) צינור חרוטי סטרילי 50 מ. טרום רטוב מסננת את התא עם 2-3 מ"ל של התא תרבות מדיה ולהעביר תאים דרך התא-מסננת. יש לשטוף את התא-מסננת עם 2-3 מ"ל של התא תרבות המדיה. (איור 1I)
- צנטריפוגה חרוט שפופרת המכילה cardiomyocytes למשך 5 דקות ב x 180 גרם (איור 1J). וארוקן את תגובת שיקוע (איור 1 K), אשר מכילים שאריות רקמת תאים, מחדש להשעות בגדר תא ב- 10 מ"ל של התא תרבות המדיה (איור 1 L).
- בעדינות resuspend תאים ותאים צלחת על גבי צלחת תרבות תא 10 ס מ (פלסטיק ללא כל סוג של ציפוי), תקופת דגירה של 1 h בחממה תרבות התא (ציפוי מראש-1) (איור 1 מ'). שלב טרום ציפוי זה מאפשר הלא-cardiomyocytes, כגון fibroblasts ותאי אנדותל, לדבוק המנה תרבית תאים ללא ציפוי.
הערה: בשלב זה, cardiomyocytes הם בדרך כלל עגול, יופיעו נוצץ מתחת למיקרוסקופ. (איור 1N). - לאחר הדגירה 1 h, בעדינות להתסיס את הצלחת תאים שאינם מחסידי (מועשר cardiomyocytes) מתוך קערה תרבות 10 ס מ, וקונטה מחדש להשעות תאים על-ידי שוב ושוב pipetting המדיום התרבות התא מעל המנה באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ. לאחר מכן, להעביר תאים שאינם מחסידי (מועשר cardiomyocytes) לתוך 10 ס מ תא תרבות תבשיל חדש (פלסטיק ללא ציפוי כלשהו), תקופת דגירה של h 1 נוספים בחממה תרבות התא (ציפוי טרום 2).
הערה: תאי לצרף לצלחת מצופה שאינם נמצאים דומיננטית שאינם cardiomyocytes: fibroblasts ותאי אנדותל, זה להיות visualized תחת מיקרוסקופ (איור 1O). - לאחר ציפוי טרום 2, בעדינות להתסיס את הצלחת, לשטוף. תאים שאינם מחסידי (cardiomyocytes) המנה תרבות 10 ס מ ולאחר מכן להעביר את cardiomyocytes לתוך צינור חרוטי 50 מ.
5. ספירת תאים ותאי ציפוי לצלחת תרבות 96-ובכן תא (יום 1)
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- צלחת התאים לתוך צלחת תרבות 96-ובכן תא מטריצה חוץ-תאית מצופה ב צפיפות בין 10 – 30 x 103 תאים/היטב באמצעות פיפטה רב ערוצית בנפח סופי של 200 µL (איור 1 P). השתמש בארות A1, A12, H1 ו H12 על רקע: הוסף µL 200 בינוני תרבות אחרים בארות בארות אלה (ללא תאים). דגירה את הצלחת ב חממה התרבות התא 37 ° C.
הערה: במחקר זה, צריכת חמצן נבחנה על-ידי שימוש צפיפויות תא שונים כגון310 x 10, 20 x 103או 30 x 103 תאים/טוב. (איור 2 א). כמו כן, כאמור לעיל, cardiomyocytes מיד לאחר בידוד הם בדרך כלל עגול ומופיעות נוצץ מתחת למיקרוסקופ. התאים קיימא מתיישר בתוך 16-24 h של תרבות.
6. חמצן צריכת Assay באמצעות 96-ובכן-עיצוב חוץ-תאית השטף מנתח (יום 2)
הערה: Assay צריכת חמצן יכול להתבצע יום לאחר ציפוי התאים או מאוחר יותר. Cardiomyocytes neonatal תרבותי באמצעות פרוטוקול זה יכול לשרוד עד 7 ימים פוסט בידוד.
- מימה מחסנית חיישן מנתח השטף (ראה טבלה של חומרים) לפחות 3 שעות, אבל באופן אידיאלי ליום מלא, לפני וזמינותו. להוסיף 200 µL של פתרון Calibrant (ראה טבלה של חומרים) לתוך הבאר כל צלחת השירות, להחזיר את מחסנית חיישן לצלחת השירות, דגירה ב חממה 37 ° C ללא CO2 או תוספת של2 O.
- לשנות תא תרבות המדיה המיטוכונדריה בדיקת המאמץ בינונית שעה אחת לפני וזמינותו. Cardiomyocytes הם שבירים. לכן, בעדינות להסיר התקשורת התרבות התא באמצעות פיפטה של רב ערוצית, לשטוף את התאים עם µL 200 אמצעי בדיקה מיטוכונדרית מראש ומחוממת פעמיים. לאחר השטיפה השנייה להוסיף µL 175 של המיטוכונדריה מראש ומחוממת בדיקת המאמץ מדיה, התרבות התאים חממה 37 ° C ללא CO2 או תוספת של2 O.
- הכנת תרכובות מבחן מרוכז. לבדיקה מתח המיטוכונדריה, להכין 3.0 מ ל כל אחד של oligomycin מיקרומטר 16, 9 מיקרומטר FCCP תערובת של 20 מיקרומטר rotenone 20 antimycin מיקרומטר A, כל בדיקה מיטוכונדרית בינוני.
הערה: כל המתחם-ריכוז תיאר נבדקו. אולם, titrating את הריכוז של כל המתחם במעבדה של כל אחד הוא הכרחי. - לטעון µL 25 של כל המתחם לתוך מזרק היציאות של מיכל הדיו חיישן באמצעות פיפטה רב-ערוצי (איור 1Q). בטבלה 2מתוארים את העוצמה ואת הריכוז הסופי.
- להגדיר את פרוטוקול assay השטף חוץ-תאית. התוכנית זו מתוארת טבלה 3-
- הפעלת התוכנית. ראשית, לשים את מחסנית חיישן לתוך המכונה לצורך כיול (איור 1R). להחליף את calibrant על הלוח assay ברגע נעשה הצעד כיול.
הערה: שימוש בתוכנה שסיפק יצרן, מצביעים על קבוצות של וולס, כל המתחם והנמל. - אם רצונך בכך, לאחר וזמינותו, בזהירות למחוק כל מדיום assay באמצעות פיפטה רב ערוצית ולאחסן את microplate התרבות התא ב-20 ° C עבור נרמול תא בעתיד באמצעות שיטת.
- למדוד את תכולת החלבון. להוסיף µL 50 בפתרון פירוק התא ריפה רגיל (ראה טבלה של חומרים). דגירה על הלוחית קרח למשך 30 דקות מלא lyse תאים. העברת כל החומר צלחת חדשה בתחתית שטוח ברור 96 assay היטב.
- למדוד ריכוז החלבון על ידי BCA assay לפי הפרוטוקול של היצרן.
הערה: ציפוי הבאר עם מטריצה חוץ-תאית גורמת ריכוז חלבון גבוה בכל טוב. לכן, הפחת את כמות well(s) רקע (ללא תאים) כדי לקבל ריכוז חלבון התא בפועל. ריכוז חלבונים שמקורם תאים הוא נמוך בצלחת 96-ובכן תרבות. בנוסף, ריכוז חלבון יכול להשתנות לובכן בשל ציפוי מטריצה חוץ-תאית. לכן, באמצעות מספר הטלפון הנייד כדי לנרמל OCR הוא הציע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול המתואר, לבבות הם בודדו אותנו מהמתרחש הגורים neonatal יום 0. 5 x 105 תאים/גור התקבלו, cardiomyocytes היו נזרע על צפיפות של 10 x 103, 20 x 103או 30 x 103 תאים/טוב, ב- 96 טוב צלחות (איור 2 א). לאחר לילה תרבות, נמצאו cardiomyocytes מחובר היטב אל פני השטח פלסטיק מצופה והיו מעט מאוד תאים כעיגולים בצבע (התאים כעיגולים בצבע עדיין מופיע כמו עגולות ונוצצות, לעומת התאים בריאים, מצורף אשר נתפזר) ( איור 2A ו- B). בשלב זה, cardiomyocytes באופן ספונטני קבלנות היו גלויים בקלות. צפיפות זריעה של 30 x 103 תאים/טוב הראתה זרימה יום לאחר זריעה כפי להפיץ התאים. כמו מספר עגול תאים (מתים) היו נמוכות מאוד, אלה תוצאות המחקר הראו כי הפרוטוקול נותן תא גבוהה הכדאיות של cardiomyocytes. Cardiomyocytes היו immunostained עם נוגדן נגד sarcomeric α-actinin, סמן ספציפי cardiomyocyte18 כהוכחה הצהרה זו. כפי שמוצג באיור 2C, רוב התאים הראה צביעה חיובית של α-actinin מציג את טוהר גבוהה בידוד cardiomyocyte.
ערכה של מבחן אחד מתח טיפוסי מיטוכונדריאלי מוצג באיור3. במבחן הלחץ מיטוכונדריאלי מתחיל עם מידה בסיסית של קצב צריכת החמצן (OCR). זה מלווה ההזרקה של oligomycin, אשר מעכב ATPase. ההבדל לפני ואחרי הזרקת oligomycin מראה OCR קשורה לייצור ATP. . אז, הסוכן uncoupling FCCP שהוזרק כדי למדוד את קצב צריכת החמצן המרבית. יכולת הנשימה חילוף יחושב כהפרש בין הבזליים, OCR מקסימלי. לבסוף, עם ההזרקה של שני אלקטרונים תחבורה מורכבים מעכבי (antimycin A ו rotenone), נשימה מיטוכונדריאלי מפסיק לגמרי, OCR יורדת לרמה הנמוכה שלו. על ידי חסימת פעילות מיטוכונדריאלי, ברמה הזאת, צריכת חמצן הוא שאינו מיטוכונדריאלי. נשימה הבזליים פרוטון הדליפה, נשימה מקסימלי יכול להיות מחושב כהפרש בין נשימה מיטוכונדריאלי (OCR בנוכחות antimycin A rotenone), מידה בסיסית, OCR בנוכחות oligomycin OCR ב הנוכחות של FCCP, בהתאמה.
במחקר זה, OCR ניתוח בוצע באמצעות מערכת מנתח 96-ובכן עיצוב השטף חוץ-תאית יום לאחר בידוד תא. בנוסף, כדי לבחון את ההשפעה של סרום רעב ב- OCR, שלוש שעות לפני וזמינותו, התקשורת התרבות התא שונו תא רגיל מדיה של צמיחת תרבות עם סרום או ללא הסרום. לאחר ההפעלה, נתוני המדידה OCR 1 עד 12 עבור כל אחד, יוצאו גיליון הרשימות, ניתוח נוסף. מאפייני מטבולית היו נחושים כדלקמן:
Non-מיטוכונדריאלי נשימה = ממוצע OCR (10, 11, 12)
נשימה הבזליים = average OCR (1, 2, 3)-ממוצע OCR (10, 11, 12)
ייצור ATP = average OCR (1, 2, 3)-ממוצע OCR (4, 5, 6)
פרוטון דליפה = average OCR (4, 5, 6) - ממוצע OCR (10, 11, 12)
נשימה מקסימלי = average OCR (7, 8, 9) - ממוצע OCR (10, 11, 12)
כפי שמוצג באיור 4A, OCR ערכים נותחו בקלות, ההשפעות של תרכובות מוזרק היו גם ברור. חשוב מכך, את הווריאציה טוב טוב היה קטן כפי שמוצג על ידי השגיאה הסטנדרטית. לודיג תא מספר הביא למדידה בסיסית מוגברת, Oligomycin, נשימה שטופלו FCCP. בהשוואה לתאי נסיוב מורעבים, OCR היה גבוה יותר בתאים ניתח היה כבר מתפשט עם צמיחה מדיה. כפי שמוצג באיור 4B, OCR הוא כמוצג נשימה הבזליים, דליפת פרוטון (Oligo), נשימה מקסימלי (FCCP) לכל עונה 1 פרק 104 תאים. OCR לכל תאים 10x103 היה גבוה ב צפיפות זריעה של 20 K ו- 30 K תאים/טוב יותר מזה של 10 K תאים/טוב. כפי שמוצג באיור 4C, על ידי הבעת OCR ביחס נשימה הבזליים, הדליפה OCR של פרוטון (Oligo) היחסי ואת מקסימלי (FCCP) מציגים ערכים דומים בין צמיחה מדיה סרום מורעבים קבוצות. תוצאות אלו מראים כי זריעה צפיפות לא משפיעה על פרוטון היחסי הדליפה מקסימלי חמצוני וקיבולת.
בסך הכל, באמצעות פרוטוקול זה, תשואות מצוינות של העכבר cardiomyocytes neonatal היו בהצלחה מבודד ותרבותית. OCR יכול להיות מוערך על ידי שימוש אלה נייטרלים מנתח השטף חוץ-תאית. התוצאות גם מראים כי זריעה צפיפות לא להשפיע באופן משמעותי על OCR מחושב על ידי מספר הטלפון הנייד. עם זאת, לטווח קצר (3h) בסרום הרעבה מקטין OCR. המידע שימושי לבדיקת העכבר neonatal cardiomyocytes OCR במגוון מצבים ניסיוני.
איור 1: בידוד והתרבות של cardiomyocytes neonatal של עכברים היילוד יום 0- (א) Neonates מורדמים, הלב הוא גזור מבית החזה. (B) לבבות נשטפים בתוך HBSS (ללא Ca2 +, Mg2 +). (ג) כל לב נחתך לחתיכות 8. לבבות (D) מועברים אל צלחת 6-ובכן מלא HBSS. לבבות נשטפים באמצעות כפית מוריה כדי להעביר אותם טוב טוב. לבבות (E) הם מתעכל מראש בטריפסין-HBSS ב 4 ° C עם עצבנות עדין. Predigested (F) רקמת לב לאחר אינקובציה 4 h-4 מעלות צלזיוס. (G) לב רקמות לאחר 10 דקות collagenase עיכול. (H) Collagenase מתעכל לב רקמות הם triturated. (אני) מבודד cardiomyocytes היו לסנן דרך מסננת התא. Cardiomyocytes (J) הם מגורען על ידי צנטריפוגה. (K) Collagenase ומדיה תרבות יוסרו על ידי השאיפה. Cardiomyocytes (L) הם מחדש על תנאי במדיום תרבות טריים. (ז) Cardiomyocytes מתורבתים בצלחת פלסטיק 10 ס מ עבור ציפוי מראש. (N) א תמונה ייצוגית של cardiomyocytes (תאים עגולים ומבריק) לאחר h 1 של ציפוי מראש. (O) לאחר ציפוי טרום ולאחר מכן הסרת cardiomyocytes שאינו חסיד, נותרו תאים שנמצאים בדרך כלל fibroblasts ותאי אנדותל גלויים. (P) יופיצ cardiomyocytes לתוך צלחת 96-ובכן. (Q) טוען ריאגנטים ליציאות הזרקה חיישן מחסנית. (R) לשים טונר חיישן לתוך מכונת מנתח השטף חוץ-תאית. סרגל קנה מידה = 0.1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תרבות של cardiomyocytes בצלחת 96-ובכן מנתח השטף חוץ-תאית. (א) להחליפן בתמונות של cardiomyocytes ב 96-ובכן צלחות עם צפיפויות התא שצוין, מיד לאחר זריעה (בשורה העליונה) או 18 h פוסט זריעה (השורה התחתונה). (B) A גבוהה יותר תמונה ההגדלה של פוסט 18שע cardiomyocytes זריעה-צפיפות התאים של 10 x 103 תאים/טוב.... (ג) Cardiomyocytes היו מוכתמים נוגדן אנטי sarcomeric α-actinin (ירוק) ודאפי (כמו כתם גרעינית) (כחול). סרגל קנה מידה = 0.1 מ מ. השיטות המשמשות immunostaining ניתן למצוא בפרסום הקודם שלנו18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. ייצוג סכמטי של בדיקה מיטוכונדרית. Bioenergetic פרמטרים, כולל התאים הבזליים, מקושרים-ATP מקסימלי, Non-מיטוכונדריאלי נשימה וכן יכולת הנשימה חילוף, פרוטון הנזילה, מתוארים על הסימן. עם effectors מיטוכונדריאלי תואם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מתח מיטוכונדריאלי assay. (א) נציג העקיבה של שיעורי צריכת חמצן (OCR, ב- pMoles/min) של העכבר neonatal cardiomyocytes. הצביעו פעמים, oligomycin (Oligo, 1 מיקרומטר), FCCP (800 nM), אטול ראה (rotenone ו- antimycin A, 1 מיקרומטר) היו מוזרק. עבור כל אחת מהמידות, מוצג ממוצע של שגיאת התקן של הממוצע (SEM) של 10 בארות בודדים. OCR (B) מחושבת הבזליים נשימה, Oligo (דליפה פרוטון), FCCP (נשימה מקסימלי) לכל 10 x 103 תאים. OCR (C) מתבטא ביחס נשימה הבזליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| השם של ריאגנט פתרון | הכנה | הערות |
| פתרון בעיכול טריפסין | להמיס טריפסין ב- HBSS (ללא Ca2 + ו Mg2 +). הריכוז הסופי הוא 0.5 מ"ג/מ"ל. לעקר את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 ולשמור בקירור עד השימוש. | להפוך את פתרון בעיכול ביום של הניסוי. |
| פתרון מערכת העיכול collagenase | להמיס טריפסין ב- HBSS (ללא Ca2 + ו Mg2 +). הריכוז הסופי הוא 0.5 מ"ג/מ"ל. לעקר את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 ולשמור בקירור עד השימוש. | להפוך collagenase עיכול פתרון ביום של הניסוי. |
| Cardiomyocyte תרבות המדיה | מערבבים 375 מ של DMEM, 125 מ של M-199, 25 מ של הסוס סרום ו מ"ל של FBS. תוספת עם פניצילין 1%, 1% פתרון סטרפטומיצין. | Cardiomyocyte תרבות המדיה יכול להתבצע לפני הניסוי ויש לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש. |
| בדיקה מיטוכונדרית בינוני | ראשית, להפוך 1 L בינוני עם DMEM ללא כל פירובט נתרן, -גלוטמין, גלוקוז, Hepes, לסנן לחטא, ולאחסן ב 4 º C. ביום של assay, להוסיף נתרן פירובט, -גלוטמין, גלוקוז, Hepes. להתאים את ה-pH ל 7.4 לפני השימוש (עיקור זה לא נדרש). | הריכוז הסופי של תוספי תזונה הם הבאים: נתרן פירובט (1 מ מ), -גלוטמין (2 מ מ), גלוקוז (10 מ מ), Hepes (2 מ מ) |
| Oligomycin מניות | להמיס oligomycin ב דימתיל סולפוקסיד. ראשית, הכינו 5 מ של פתרון מניות. ברגע oligomycin הוא לחלוטין מומס דימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots, לאחסן ב-20 ° C. | ביום של assay, לקחת אחד aliquot לשימוש. הימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה רבים. |
| FCCP מניות | להמיס FCCP ב דימתיל סולפוקסיד. ראשית, הכינו 5 מ של פתרון מניות. הריכוז הסופי הוא 5 מ מ. ברגע FCCP הוא לחלוטין מומס דימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots, לאחסן ב-20 ° C. | ביום של assay, לקחת אחד aliquot לשימוש. הימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה רבים. |
| מניות Antimycin A | להמיס antimycin A דימתיל סולפוקסיד. ראשית, הכינו 5 מ של פתרון מניות. הריכוז הסופי הוא 5 מ מ. לאחר antimycin A הוא לחלוטין מומס דימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots, אחסן ב-20 ° C. | ביום של assay, לקחת אחד aliquot לשימוש. הימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה רבים. |
| Rotenone מניות | להמיס rotenone ב דימתיל סולפוקסיד. ראשית, הכינו 5 מ של פתרון מניות. הריכוז הסופי הוא 5 מ מ. ברגע rotenone הוא לחלוטין מומס דימתיל סולפוקסיד, להפוך 250 µL aliquots, לאחסן ב-20 ° C. | ביום של assay, לקחת אחד aliquot לשימוש. הימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה רבים. |
| תא תרבות צלחת ציפוי פתרון | ראשית, להפוך 200 מ של 0.5% ג'לטין פתרון. להמיס ג'לטין PBS ו אוטוקלב. ביום של הניסוי, להוסיף 50 µL של פתרון fibronectin מ ל תמיסת ג'לטין לעשות ציפוי פתרון. | 0.5% ג'לטין הפתרון ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד 2 חודשים. |
טבלה 1: ריאגנטים ופתרונות.
| הזרקת יציאה | תרכובות וריכוז | נפח מוזרק במהלך הריצה (µl) | ריכוז סופי ב וזמינותו |
| A | מיקרומטר 16 oligomycin | 25 | 2 מיקרומטר |
| B | מיקרומטר 9 FCCP | 25 | 1 מיקרומטר |
| C | 20 מיקרומטר rotenone (רוט) ו 20 מיקרומטר antimycin A (AA) |
25 | 2 מיקרומטר של כל אחד |
טבלה 2: הזרקת תערובות.
| שלבים ופרוצדורות | מדידות ולולאות |
| כיול | - |
| Equilibration | - |
| מידה בסיסית | 3 פעמים: לערבב 3 דקות, להמתין 2 דקות, למדוד 3 דקות |
| להזריק פורט (Oligomycin) | - |
| מדידות | 3 פעמים: לערבב 3 דקות, להמתין 2 דקות, למדוד 3 דקות |
| להזריק יציאה B (FCCP) | - |
| מדידות | 3 פעמים: לערבב 3 דקות, להמתין 2 דקות, למדוד 3 דקות |
| להזריק יציאה C (ראה) | - |
| מדידות | 3 פעמים: לערבב 3 דקות, להמתין 2 דקות, למדוד 3 דקות |
טבלה 3: השטף חוץ-תאית מנתח התוכנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, הקמנו פרוטוקול פשוט עבור בידוד ו culturing cardiomyocytes neonatal העכבר. באמצעות cardiomyocytes האלה, אנחנו גם אופטימיזציה התנאים כדי למדוד את קצב צריכת החמצן באמצעות מערכת מנתח השטף חוץ-תאית. הפרוטוקול מאפשר להשתמש בעכבר cardiomyocytes neonatal כמערכת מודל לבחון איך גורמים יכול לשנות את צריכת החמצן בתאים העבודה העיקרי של הלב, דומה מה ניתן למדוד באיבר שלם. פרוטוקול שלנו שונה פרוטוקולים שפורסמו בעבר16,18. ראשית, כדי להשיג גבוהה הכדאיות, הגורים היחידה מיד עם לידתו נמצאים בשימוש (קרי P0), במקום אלה מימים אפס שלושה ימים של גיל (P0 ל P3 כלבלבים), אשר משמשים בדרך כלל פרוטוקולים אחרים,16,19. שנית, כדי למזער את הזמן של הניסוי, לבבות היו רק מראש מתעכל עם טריפסין במשך 4 שעות. בנוסף, כדי להפוך את ההליך פשוט להשיג תוצאות לשחזור, אנחנו מועסקים מספר מינימלי של צעדים, כמתואר. לדוגמה, פרוטוקול שלנו משתמשת רק שני סוגים של מאגרים, PBS, HBSS, רק סוג אחד של תא תרבות המדיה, אינה מעסיקה עצבנות במהלך העיכול collagenase.
כדי להשיג את הכדאיות גבוהה של העכבר neonatal cardiomyocytes, אשר חשוב עבור הפארמצבטית של וזמינותו OCR, ישנן מספר נקודות קריטיות. ראשית, באמצעות הגורים היילוד P0 וביצוע טריפסין בעיכול ועיכול collagenase באותו יום הוא קריטי כדי להשיג את הכדאיות גבוהה. שנית, במהלך העיכול collagenase, לא מומלץ כדי להתסיס את רקמת הלב באמבט מים 37 º C. למרות עצבנות מוצעת בפרוטוקולים רבים, מצאנו שזה לא הכרחי כמו לבבות P0 קלים להתעכל על-ידי collagenase. לבסוף, בעדינות triturating רקמות הלב חיוני לנתק את cardiomyocytes לאחר עיכול collagenase.
גם בדקנו נייטרלים מרקמות P1 ו- P2 pup הלב, תוך שימוש באותו הפרוטוקול. עם זאת, עבור אלה דוגמאות לב מבוגר, מצאנו שיש צורך לבצע טריפסין בעיכול בן לילה כדי להשיג את התשואות תא מספיקות (נתונים לא מוצג). בנוסף, הכדאיות תא עבור cardiomyocytes P1 ו- P2 היה בסביבות 60%, דומה כי אחרים פרסם מחקרים16. תוצאות אלו מראים כי שריר הלב P0 יש כמויות נמוכות יחסית של מטריצה חוץ-תאית יותר לבבות בוגרים, אשר מאפשר זמנים קצרים יותר לעיכול קדם טריפסין, והתוצאה היא גבוהה יותר הכדאיות תא ותשואות של אלה לבבות צעירים.
ניתוח חוץ-תאית השטף (XF) הפכה להיות שיטה הגדולים והפופולריים כדי למדוד את הפונקציה bioenergetic תאים, המיטוכונדריה מבודד20,21. עד כה, מספר מחקרים השתמשו cardiomyocytes neonatal עכברוש ומדדתי את צריכת החמצן, שימוש של Agilent XF24 המערכת22,23,24 . מחקרים אלה באמצעות תאי עכברים לעומת עכבר-derived תאים, בוצעו ככל הנראה כמו עכברוש התאים יש בדרך כלל גבוה יותר הכדאיות תא ו הפארמצבטית assay, לעומת נייטרלים הלב העכבר למד פה. בהתחשב בכך מהונדסים בעלי החיים נוצרו בעיקר בקווים העכבר, פרוטוקול לשחזור ופשוט ניתוח פונקציית bioenergetic העכבר cardiomyocytes neonatal, כפי שנדון בו כתב יד זה, מספק הזדמנויות ללמוד פונקציית מיטוכונדריאלי של תאי שריר הלב. בעכבר. בשיטה זו יכול להיות מתורגם ביתר קלות אל נתונים יוביל להבנת מנגנון חדש על תקנה bioenergetic בלב, באמצעות מניפולציה גנטית עכבר חדש או קיים שורות25,26.
במחקר זה, בדקנו את ההשפעה של מספר הטלפון הנייד וצפיפות על OCR. כפי שמוצג באיור 4B, OCR נמדד וולס עם310 x 10, 20 x 103ו 30 x 103 תאים/טוב, היה דומה. בהתחשב בכך יופיצ 30 x 103 תאים/טוב המיוצר באר confluent תוך יום אחד לאחר זריעה, אנו ממליצים על פיצול תאים בין 10 x 103 30 x 103 תאים/היטב לתוך צלחת 96-ובכן, עבור OCR וזמינותו. מעניין לציין מצאנו 3 h מרעב סרום ירד OCR. גורמי גדילה ידועים כדי להפעיל גליקוליזה להגביר את צריכת החמצן27. כמו כן דווח כי גורמי גדילה לשפר באופן כללי פעילות תאית והתכווצות של cardiomyocytes3,28. ההתכווצות Cardiomyocyte דורשת ATP דור2, אשר תלויה צריכת החמצן. לכן, נתונים אלה מראים כי סרום הרעבה מקטין צריכת חמצן דרך איון של cardiomyocytes. אנו ממליצים בוחן את השפעת סרום רעב על OCR באווירה ניסיונית של כל אחד.
כאמור, המיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרכזיים בתפקוד הלב. לכן, זיהוי הרגולטורים הרומן משעולים בוויסות מטבוליזם חמצוני יכול לספק אמצעי לזיהוי מטרות טיפולית חדשנית לטיפול בבעיות של אי ספיקת לב. מאז 96 תבנית טוב מספק היכולת לבחון מספר גדול יותר של בדיקות תנאי לעומת פורמט טוב 24, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם בקלות מסך תפוקה גבוהה לזיהוי הרומן הרגולטורים bioenergetic ב cardiomyocytes29 . לפיכך, על-ידי שילוב פרוטוקול שלנו עם גנטית מניפולציות cardiomyocytes neonatal, כגון אלו אשר יש מוטציות מיטוכונדריאלי30, יכול לספק מחקרים מעניינים למסך את ההשפעות של תרכובות כימיות או ספריות cDNA, על זיהוי תווים אופטי ב- cardiomyocytes סמויה תקינה לעומת פראי-סוג. .
אנו מודעים שיש cardiomyocytes neonatal ומבוגרים רבים מאפיינים שונים של פונקציות מטבוליות31, כולל רמות הביטוי של אנזימים מטבוליים של גלוקוז, חומצות שומן-32. לכן, באופן אידיאלי לשימוש במבחנה cardiomyocytes בתרבית כמערכת מודל בלב שלם, זה יהיה חשוב להמשיך ולפתחו פרוטוקול לנתח ביעילות OCR ב cardiomyocytes למבוגרים, כך אחד יכול להשוות את יכולת חמצון שלהם, המאפיינים עם neonatal cardiomyocytes. מחקרים עתידיים תצטרך להיות נרדף להסתגל מתודולוגיה זו למערכת לשחזור באמצעות למבוגרים של תאי שריר הלב.
לסיכום, אנו מראים פרוטוקול לשחזור ופשוט לניתוח צריכת החמצן באמצעות cardiomyocytes neonatal העכבר העכבר בתרבית הראשי. באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו יכולים בהצלחה לבודד, תרבות cardiomyocytes neonatal העכבר ולבצע הזה assay OCR באמצעות מערכת מנתח 96-ובכן עיצוב השטף חוץ-תאית. פרוטוקול שלנו נותן הכדאיות גבוהה חשוב, תוצאות לשחזור באופן עקבי. למרות המחקר הנוכחי מתמקדת בעיקר צריכת החמצן ואת בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי, הפרוטוקול יכול ניתן להתאים בקלות כדי לנתח חמצון חומצות שומן ואת גליקוליזה ב cardiomyocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות כל מעבדה רוס ואנשי המעבדה מרפי. עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקאי (14SDG17790005) NIH ווי. סי (HL115933, HL127806), VA ערך (BX003260) R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L.
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T.
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S.
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
