Summary
O objetivo do presente protocolo é ilustrar como usar rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio no coração.
Abstract
Mitocôndrias e metabolismo oxidativo são essenciais para manter a função do músculo cardíaco. A pesquisa mostrou que a disfunção mitocondrial é um importante fator contribuinte para insuficiência cardíaca encontrada na insuficiência cardíaca. Por outro lado, restaurar a função mitocondrial defeituosa pode ter efeitos benéficos para melhorar a função cardíaca no coração falhar. Portanto, estudar os mecanismos de regulação e identificando novos reguladores de função mitocondrial poderiam fornecer uma visão que poderia ser usada para desenvolver novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças cardíacas. Aqui, a respiração mitocondrial miócito cardíaco é analisada usando um sistema de cultura de célula única. Primeiro, um protocolo foi otimizado para isolar rapidamente e cultura alta viabilidade neonatal do mouse cardiomyocytes. Então, um analisador de fluxo extracelular de 96 poços formato é usado para avaliar a taxa de consumo de oxigênio destas cardiomyocytes. Para este protocolo, nós otimizado semeadura condições e demonstrou que essa taxa de consumo de oxigênio de cardiomyocytes rato neonatal pode ser facilmente avaliada em um analisador de fluxo extracelular. Finalmente, notamos que nosso protocolo pode ser aplicado a um tamanho maior de cultura e outros estudos, tais como sinalização intracelular e contrátil função de análise.
Introduction
Para sustentar uma função contrátil cardíaca contínua, cardiomyocytes deve manter um fornecimento constante de energia celular, principalmente na forma de ATP1. No coração, aproximadamente 95% de ATP é gerado pela mitocôndria, principalmente através da fosforilação oxidativa, mostrando que as mitocôndrias desempenham um papel bioenergético crucial na função cardíaca2,3. Esta noção de apoio é que a desregulação da função mitocondrial pode levar a miocardiopatia e insuficiência cardíaca4,5. Por outro lado, restaurar a função mitocondrial foi mostrado para melhorar a função cardíaca de falhar o coração6,7. Portanto, estudar o mecanismo de bioenergética mitocondrial e identificando novos reguladores da função mitocondrial em cardiomyocytes não revelarei apenas insights mecanicistas de produção de energia cardíaca, mas também poderiam fornecer uma visão que vai levar para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para tratar doenças cardíacas6,8.
Em comparação com todo o coração, que contém uma mistura de miócitos e miócitos não9, casos de culturas são extremamente puro, com contaminação mínima de non-miócitos do coração, como fibroblastos e células endoteliais10. Além disso, isolar cardiomyocytes de filhotes neonatais permite cultivo um grande número de células em uma pequena quantidade de tempo, em comparação com células isolantes de corações adultos10,11. Mais importante ainda, principal do rato adulto culto cardiomyocytes têm curta sobrevivência vezes (por exemplo, 24 h) e no tempo mais pontos de diferenciam. Cardiomyocytes rato neonatal pode sobreviver e ser manipulado por mais de 7 dias em cultura, tornando-os ideais para testar os efeitos dos compostos de drogas e manipulação genética sobre a função das mitocôndrias em cardiomyocytes10. Claro, existem significativas diferenças biológicas entre as células de adultas e Neonatais, mas a duração mais longa disponível para cultura de células neonatais fá-los apropriados para diversos tipos de estudos, incluindo os da função mitocondrial.
Até à data, principal culto neonatal camundongo e rato cardiomyocytes têm sido utilizados como modelos para estudar bioenergética cardíaca12,13. Nos últimos anos, estudos utilizados um analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e avaliar a capacidade oxidativa em camundongo e rato neonatal cardiomyocytes14,15. Enquanto comparado com ratos, a viabilidade celular de rato cardiomyocytes neonatal é mais baixa e tem maior variabilidade16. Também, a capacidade de estudar células de modelos do rato geneticamente o modelo de célula de rato faz muito importante. Dado que os estudos de OCR são tão sensíveis ao celular número e densidade de semeadura, desenvolvimento de um protocolo simples, confiável e reprodutível para alcançar a viabilidade e rendimento consistente da célula é necessário.
Aqui, nós relatamos um protocolo otimizado que tem sido desenvolvido que usa culta rato neonatal cardiomyocytes juntamente com um analisador de fluxo extracelular 96-bem-formato para análise de OCR. Este protocolo aumenta a reprodutibilidade do ensaio. Além disso, o protocolo não só fornece um método reprodutível para análise de OCR e romance, mas também pode ser adaptado para uma cultura de tamanho maior para outros fins experimentais, como a que pode ser necessária para estudar funções miofibrilar e intracelular vias de sinalização.
Em particular, este protocolo descreve um procedimento de um dia para isolamento e cultura de rato neonatal cardiomyocytes em uma placa de cultura de células 96 poços. Além disso, ele descreve o procedimento para medir o consumo de oxigênio, usando um analisador de fluxo extracelular. Todas as soluções utilizadas são estéreis ou filtrado estéril. Todas as ferramentas são esterilizadas por 75% de etanol. Nós fornecemos uma Tabela de materiais para várias partes do processo. Para cultivo cardiomyocytes, todos os procedimentos e as etapas são executadas em uma capa de cultura de célula padrão. Este protocolo é desenvolvido para o isolamento de corações de rato neonatal de uma ninhada (aproximadamente 8-10 filhotes). No entanto, o protocolo também pode ser adaptado para isolar cardiomyocytes de várias ninhadas.
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Protocol
Para trabalho com ratos neonatais, por favor consulte a universidade local/Instituto conjunto de diretrizes adiante pelos programas de cuidados com animais e aderir a institucionais e outros regulamentos adequados. Todos os métodos descritos no presente protocolo tenham sido aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e UC San Diego institucional Cuidado Animal e aderirem aos regulamentos federais e estaduais.
1. preparação dos reagentes
- Prepare-se 25 mL da solução de pré-digestão: HBSS (sem o Ca2 + e Mg2 +) suplementado com tripsina (0,5 mg/mL). Esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm e manter no gelo até o uso. Fazer pré-digestão solução no dia do experimento.
Nota: É fundamental usar HBSS sem Ca2 + e Mg2 +, como Ca2 + e Mg2 + causará contração miócito e morte celular subsequente durante o isolamento. - Prepare 30 mL de tampão de digestão de colagenase: colagenase (0,8 mg/mL, aproximadamente 350 U/mL) dissolvido em tampão HBSS (sem o Ca2 + e Mg2 +). Esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm e manter no gelo até o uso. Fazer a solução de digestão de colagenase no dia do experimento.
- Preparar 500 mL de casos cultura media (mídia de crescimento): misture 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de soro de cavalo e 12,5 mL de FBS. Suplemento com penicilina 1% e 1% solução de estreptomicina.
- Preparar o meio de teste de estresse mitocondrial: fazer 200 mL de DMEM com base em teste de estresse suplementado (DMEM sem NaHCO3, consulte Tabela de materiais) com piruvato de sódio 1 mM, 2 mM L-glutamina e glicose 10 mM e 2 mM Hepes.
Nota: Faça 1 L de meio com DMEM sem piruvato de sódio, L-glutamina, glicose e Hepes, limador estéril e armazene em 4 ° C. Prepare o suporte de teste de stress no dia do ensaio, adicionando outros reagentes. Usando DMEM meio sem NaHCO3 é crítico. - Ajuste o pH da mídia mitocondrial teste de estresse para 7.4 no dia da utilização. Mídia aquecida a 37 ° C antes do uso.
- Preparar oligomicina: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
- Prepare-se Compararia: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
- Prepare-se antimycin A: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
- Preparar a rotenona: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
Nota: Todos os reagentes e soluções utilizados neste protocolo são listadas na tabela 1.
2. colheita e pré-digestão de corações de ratos Neonatal (dia 1)
- Autoclave tesouras, pinças e uma colher de Moria para esterilizar.
- Execute todas as etapas do capuz de cultura celular para esterilidade.
- Alíquota 5 mL de HBSS (sem o Ca2 +, Mg2 +) em cada poço de uma placa de cultura de células de 6-poços; Coloque no gelo. Alíquota 10 mL de HBSS em um prato de cultura de célula de 10 cm.
- Prepare-se 20 mL da solução de tripsina pré-digestão em um tubo cônico estéril de 50 mL. Mantenha todas as soluções no gelo.
- Mergulhe rapidamente os ratos recém-nascido (dia 0) em solução de etanol 70% para a esterilização.
- Decapitar filhotes usando uma tesoura esterilizada (direto) sem anestesia e então abra o baú ao longo do esterno para permitir o acesso à cavidade torácica e o coração. (Figura 1A)
Nota: 1) é fundamental usar ratos neonatais P0 para alcançar a viabilidade celular alta. 2) este método de eutanásia é permitido para recém-nascidos em conformidade com diretrizes de NIH e Associação Médica Veterinária americana 17. - Extrair o coração de um corpo com uma tesoura bem e transferir imediatamente para o prato de cultura de células estéreis contendo HBSS (sem o Ca2 +, Mg2 +) (figura 1B).
- Remover qualquer tecido pulmonar residual, vasos maiores, etc. (e átrios, se desejado). Lave os corações na solução HBSS usando agitação suave.
- Corte cada coração com uma tesoura bem em 8 pedaços e transferir o todo o tecido cardíaco com pinças em um poço de uma placa de cultura de células de 6-poços com HBSS (Figura 1 e 1 D).
- Lave os corações, transferindo os corações de bem para bem na placa 6-bem preenchida com HBSS, usando uma colher de Moria (Figura 1).
Nota: Transferir os corações de poço para poço é suficiente para lavar o sangue. Desde que o sangue interfere com a digestão enzimática é importante lavar os corações com HBSS e remover o sangue. - Transferir os corações com uma colher de Moria em um tubo cônico contendo 20 mL de tripsina (0,5 mg/mL) e incubar com agitação suave a 4° C por 4 h (Figura 1E).
3. prepare uma placa de cultura de 96 poços (dia 1)
- Prepare-se 5 mL da solução de revestimento: PBS contendo 0,5% de gelatina (autoclave antes do uso) e 1% solução de fibronectina. (por exemplo, 5 mL de solução de gelatina mais 50 µ l de solução de fibronectina)
- Alíquota 50 µ l de solução de revestimento em cada poço da placa de cultura de células 96 poços (ver Tabela de materiais). Se as bolhas estiverem presentes, removê-los usando uma pipeta de 20 µ l de chupar as bolhas para fora.
Nota: É importante cobrir toda a área da superfície de cada poço com solução de revestimento. - Incube a placa numa incubadora de cultura de célula de 37 ° C por 1h ou mais para permitir a secagem do revestimento matriz.
- Aspire qualquer solução de revestimento residual antes da semeadura cardiomyocytes.
4. enzimática digestão e chapeamento de células (dia 1)
- Pré-aquecer a solução de digestão de colagenase em banho maria a 37 ° C.
Nota: Este passo é importante para alcançar eficiente digestão enzimática. - Mova o tubo cônico contendo solução de pré-digestão de 4 ° C para uma capa de cultura celular e corações. (Figura 1F)
- Deixe o coração afunda até o fundo do tubo e remove a solução de pré-digestão usando uma pipeta sorológica 10ml (1 a 2 mL do meio de isolamento podem permanecer no tubo).
- Adicione 10 mL de HBSS dentro do tubo. Re-suspender os corações com HBSS 2 - 3 vezes a desbotar tripsina utilizando uma pipeta sorológica 10ml. Aspire HBSS (1 a 2 mL podem permanecer no tubo).
- Adicione 10 mL de solução de digestão de colagenase previamente aquecido dentro do tubo com corações. (Figura 1)
- Incubar o tubo com corações em banho-maria 37 ° C por 10 min sem agitação (1º digestão).
- Após a digestão 1º, mova o tubo ao capô de cultura de células. Delicadamente, Triture corações, re-suspendendo os corações no interior do tubo suavemente 10 vezes utilizando uma pipeta sorológica 10ml. Isto permitirá que corações para dispersar e células ser liberado do tecido cardíaco. (Figura 1 H)
Nota: Desde que cardiomyocytes são frágeis, trituração suave é importante para alcançar alta viabilidade. - Deixe o tecido não digerido afundar, transferir a solução digerida enriquecida em cardiomyocytes (aproximadamente 9-10 mL) para um novo tubo cónico e imediatamente adicionar uma quantidade igual de meios de cultura celular para parar a digestão de colagenase.
- Adicione 10 mL de solução de digestão de colagenase no tubo contendo o tecido restante do coração não digerido.
- Incubar o tubo com o tecido do coração em um banho de água de 37 ° C por 10 min (2º digestão).
- Repita o procedimento 4.7 e 4.8.
Nota: Se há tecido muito ainda não digerido, repita a digestão mais uma vez. No entanto, na maioria dos casos, duas digestões são suficientes para dispersar a maioria das células do tecido do coração. - Coloque um celular-filtro estéril (100 µm de malha de nylon) em um novo tubo cônico estéril 50 mL. Pre-molhado o filtro célula com 2-3 mL de meio de cultura celular e passar as células até a célula-filtro. Lave o filtro-célula com 2-3 mL de meio de cultura celular. (Figura 1I)
- Centrifugar o tubo cônico contendo cardiomyocytes por 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspire o sobrenadante (Figura 1 K), que irá conter os restos de tecido celular e ressuspender o sedimento celular em 10 mL de meio de cultura celular (Figura 1 L).
- Delicadamente Ressuspender as células e as células da placa numa placa de cultura de células de 10 cm (sem qualquer tipo de revestimento de plástico) e incube por 1h em uma incubadora de cultura celular (1º pré-plating) (Figura 1 M). Esta etapa pré-chapeamento permite que não-cardiomyocytes, como fibroblastos e células endoteliais, para aderir ao prato sem revestimento de cultura de células.
Nota: Neste ponto, cardiomyocytes são normalmente uma forma redonda e aspecto brilhante ao microscópio. (Figura 1N). - Após a incubação de 1 h, suavemente agitar a placa, lavar as células não-aderente (enriquecidas em cardiomyocytes) da placa de cultura de 10 cm e ressuspender as células pipetando repetidamente o meio de cultura celular sobre o prato com uma pipeta sorológica 10ml. Em seguida, transferir as células não-aderente (enriquecidas em cardiomyocytes) para uma nova placa de cultura de células de 10 cm (sem qualquer revestimento de plástico) e incubar durante uma 1h adicional em uma incubadora de cultura celular (2ª pré-plating).
Nota: As células que prendem a placa não revestidos são predominantemente não-cardiomyocytes: fibroblastos e células endoteliais, que podem ser visualizadas sob um microscópio (Figura 1O). - 2º Pré-chapeamento, suavemente agitar a placa, lavar as células não-aderente (cardiomyocytes) do prato 10cm cultura depois de transferir o cardiomyocytes para um novo tubo cónico de 50 mL.
5. contagem de células e chapeamento de células em uma placa de cultura de células 96 poços (dia 1)
- Conte as células usando um hemocytometer.
- As células da placa em uma placa de cultura de células 96 poços revestida da matriz extracelular em uma densidade entre 10 a 30 x 103 células/poço usando uma pipeta multicanal em um volume final de 200 µ l (Figura 1 P). Use poços A1, A12, H1 e H12 para plano de fundo: Adicionar 200 µ l de meio de cultura como outros poços nesses poços (sem pilhas). Incube a placa numa incubadora de cultura de células de 37 ° C.
Nota: Neste estudo, o consumo de oxigênio foi testado usando densidades de célula diferente como 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 células/poço. (Figura 2A). Também, como acima, cardiomyocytes imediatamente depois de isolamento são geralmente uma forma redonda e aspecto brilhantes ao microscópio. Células viáveis vão achatar dentro 16-24h de cultura.
6. oxigênio consumo ensaio utilizando um analisador de fluxo extracelular 96-bem-formato (dia 2)
Nota: Ensaio de consumo de oxigênio pode ser realizado um dia depois do chapeamento as células ou mais tarde. Cardiomyocytes neonatal cultivadas usando este protocolo pode sobreviver até 7 dias pós o isolamento.
- Hidratar um cartucho de sensor de analisador de fluxo (ver Tabela de materiais) para pelo menos 3 horas, mas idealmente para um dia inteiro, antes do ensaio. Adicionar 200 µ l de solução de Calibrant (ver Tabela de materiais) em cada poço da placa de utilitário, volte a colocar o cartucho do sensor na placa de utilitário e incubar em uma incubadora de 37 ° C sem CO2 ou suplementação de2 O.
- Mudar de meios de cultura celular para meio de teste de estresse de mitocôndrias uma hora antes do ensaio. Cardiomyocytes são frágeis. Portanto, suavemente remover os meios de cultura de células usando uma pipeta multicanal e lavar as células com 200 µ l de mídia mitocondrial pré-aquecido estresse teste duas vezes. Depois da segunda lavagem, adicione 175 µ l de mídia de teste de estresse de mitocôndrias pré-aquecido e cultura de células em uma incubadora de 37 ° C sem CO2 ou suplementação de2 O.
- Prepare teste concentrada compostos. Teste de estresse de mitocôndrias, prepare 3,0 mL de 16 µM oligomicina, 9 µM Compararia e uma mistura de 20 rotenona µM e 20 µM antimycin A, tudo no meio de teste de estresse mitocondrial.
Nota: Cada composto na concentração descrito foi testado. No entanto, titulada a concentração de cada composto no próprio laboratório é necessária. - Carrega 25 µ l de cada composto para os portos de injector do cartucho sensor usando uma pipeta multicanal (Figura 1T). O volume e a concentração final são descritos na tabela 2.
- Configure o protocolo de ensaio de fluxo extracelular. O programa está descrito no tabela 3.
- Inicie o programa. Primeiro, coloque o cartucho de sensor na máquina para calibração (Figura 1R). Substitua o calibrant para a placa de ensaio, uma vez que a etapa de calibração é feita.
Nota: Usando o software fornecido pelo fabricante, indicam que grupos de poços e cada composto e Porto. - Se desejado, após o ensaio, cuidadosamente descartar todos doseamento usando uma pipeta multicanal e armazenar a microplaca de cultura de célula a-20 ° C para normalização futura célula usando o ensaio da proteína.
- Medir o teor de proteína. Adicionar 50 µ l de solução de lise celular RIPA padrão (veja a Tabela de materiais). Incube a placa no gelo por 30 min para totalmente lyse pilhas. Transferi todo o material para uma nova placa de ensaio bem fundo claro plano 96.
- Medir a concentração de proteína por ensaio BCA de acordo com o protocolo do fabricante.
Nota: Revestimento do poço com matriz extracelular resulta em uma concentração de proteína em cada poço. Portanto, subtrai a quantidade de well(s) o plano de fundo (sem pilhas) para obter a concentração de proteína de célula real. A concentração de proteínas derivada de células é baixa em uma placa de cultura de 96 poços. Além disso, a concentração de proteína pode variar de para-bem graças ao revestimento de matriz extracelular. Portanto, usar o número do celular para normalizar o OCR é sugerido.
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Representative Results
Usando o protocolo descrito, corações foram isoladas de filhotes neonatal dia 0. 5 x 105 células/filhote foram obtidos, e cardiomyocytes foram semeadas em densidades de 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 células/poço, em 96 placas bem (Figura 2A). Depois da cultura durante a noite, foram encontrados cardiomyocytes bem anexado à superfície revestida de plástico e havia muito poucas células solteira (as células não anexadas ainda aparecerá tão redonda e brilhante, em comparação com as células saudáveis, anexadas que procurem) ( Figura 2A e B). Neste ponto, cardiomyocytes espontaneamente contratantes eram facilmente visíveis. Uma densidade de semeadura de 30 x 103 células/poço mostrou confluência, um dia após a semeadura, como as células se espalhou. Como o número de células (mortas) redondos eram muito baixo, esses resultados mostraram que o protocolo dá viabilidade celular alta de cardiomyocytes. Cardiomyocytes foram immunostained com um anticorpo contra sarcomero α-actinin, um marcador específico de casos18 como prova desta afirmação. Como mostrado na Figura 2, a maioria das células mostrou coloração positiva de α-actinin mostrando a alta pureza do isolamento de casos.
Um esquema de um teste de stress mitocondrial típico é mostrado na Figura 3. O teste de estresse mitocondrial começa com uma medida de referência da taxa de consumo de oxigênio (OCR). Isto é seguido pela injeção de oligomicina, que inibe a ATPase. A diferença antes e depois da injeção de oligomicina mostra o OCR ligados à produção de ATP. Em seguida, o agente de desacoplamento Compararia foi injetado para medir a taxa de consumo máximo de oxigênio. Capacidade respiratória pode ser calculada como a diferença entre o basal e o OCR máximo. Finalmente, com a injeção de dois inibidores de complexo de transporte de elétrons (antimycin A e a rotenona), respiração mitocondrial para completamente e OCR diminui seu nível mais baixo. Ao bloquear a atividade mitocondrial, a este nível, consumo de oxigênio é não-mitocondrial. Respiração basal, vazamento de próton e respiração máxima podem ser calculadas como a diferença entre respiração não-mitocondrial (OCR na presença de antimycin A e a rotenona) e medição de referência, OCR na presença de oligomicina e OCR na presença de FCCP, respectivamente.
Neste estudo, realizou-se análise de OCR usando um sistema de analisador de fluxo extracelular de 96 poços formato um dia após o isolamento da célula. Além disso, para testar o efeito de fome de soro no OCR, três horas antes do ensaio, os meios de cultura de células foram alteradas para meios de crescimento de cultura de célula normal com soro, ou sem o soro. Após a execução, dados de medição de OCR 1 até 12 para cada bem, foram exportados para uma planilha para manutenção de registros e uma análise mais aprofundada. Características metabólicas foram determinadas como segue:
Respiração mitocondrial non = média OCR (10, 11, 12)
Respiração basal = média OCR (1, 2, 3)-média OCR (10, 11, 12)
Produção de ATP = média OCR (1, 2, 3)-média OCR (4, 5, 6)
Vazamento de próton = média OCR (4, 5, 6) - média OCR (10, 11, 12)
Respiração máxima = média OCR (7, 8, 9) - média OCR (10, 11, 12)
Como indicado na Figura 4A, valores de OCR analisaram-se facilmente, e os efeitos dos compostos injetados também eram óbvios. Importante, a variação de poço para poço era pequeno, como mostrado pelo erro-padrão. Aumentar na cela número resultou em aumento de base de medição, oligomicina e respiração Compararia-tratados. Em comparação com células de soro faminto, OCR foi maior em células analisadas que tinham sido incubadas com mídia de crescimento. Como mostrado na Figura 4B, OCR é mostrado como respiração basal, vazamento de próton (Oligo) e a respiração máxima (FCCP) por 1 x 104 células. OCR por 10 x 103 células foi superior à densidade de semeadura de 20k e 30K células/poço de 10k células/poço. Como mostrado na Figura 4, expressando OCR em relação à respiração basal, o relativo vazamento de OCR de próton (Oligo) e máxima (FCCP) mostram valores semelhantes entre meios de crescimento e soro fome grupos. Estes resultados sugerem que o densidade de semeadura não afeta a capacidade oxidativa prótons relativo vazamento e máximo.
Em geral, usando este protocolo, excelente rendimento de rato neonatal cardiomyocytes foram com sucesso isolado e culta. OCR pode ser avaliada usando estes miócitos em um analisador de fluxo extracelular. Os resultados mostram também que a propagação de densidade não afeta significativamente OCR calculada pelo número de celular. No entanto, a fome de soro de curto prazo (3 h) diminui OCR. A informação é útil para testar o rato neonatal cardiomyocytes OCR com diferentes condições experimentais.
Figura 1: isolamento e cultura de cardiomyocytes neonatal de ratos recém-nascidos dia 0. (A) recém-nascidos são sacrificados, e o coração é dissecado do tórax. (B) corações são lavadas em HBSS (sem o Ca2 +, Mg2 +). (C) cada coração é cortada em 8 pedaços. (D) corações são movidas para uma placa de 6 preenchida com HBSS. Corações são lavadas, usando uma colher de Moria para transferi-los de um bem para o bem. (E) corações são pré-digerida em tripsina-HBSS a 4 ° C, com agitação suave. (F) Predigested coração tecido após incubação de 4 h a 4 ° C. (G) coração tecidos após a digestão de colagenase de 10 min. (H) colagenase digerido coração tecidos são triturados. (eu) Isolated cardiomyocytes foi filtrados através de um filtro de célula. (J) Cardiomyocytes são peletizados por centrifugação. Colagenase (K) e meios de cultura são removidos por aspiração. (L) Cardiomyocytes são re-suspensas em meio de cultura fresco. Cardiomyocytes (M) são cultivadas em um prato de plástico de 10 cm para o pré-chapeamento. (N), A imagem representativa dos cardiomyocytes (células redondas e brilhantes) após 1 h de pre-chapeamento. (O) depois de pre-chapeamento e, em seguida, a remoção de não-aderente cardiomyocytes, permanecendo as células que são tipicamente fibroblastos e células endoteliais são visíveis. (P) chapeamento cardiomyocytes em uma placa de 96 poços. (Q) carregando os reagentes em portos de injeção do cartucho do sensor. (R) cartucho de sensor Putting em uma máquina de analisador de fluxo extracelular. Barra de escala = 0,1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: cultura de cardiomyocytes na placa de 96 poços de analisador de fluxo extracelular. (A) imagens representativas dos cardiomyocytes em placas de 96 poços, com densidades de célula indicado, imediatamente após a semeadura (linha superior) ou 18 h pós semeadura (linha inferior). (B) A imagem de ampliação mais elevada do cardiomyocytes 18 h pós semeadura em uma densidade de células de 10 x 103 células/poço. (C) Cardiomyocytes estavam manchadas com anticorpo antisarcomero α-actinin (verde) e DAPI (como um corante nuclear) (azuis). Barra de escala = 0,1 mm. Os métodos usados para immunostaining podem ser encontrados em nossa anterior publicação18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Representação esquemática do teste de estresse mitocondrial. Parâmetros bioenergético, incluindo Basal, relacionadas com a ATP, máxima e Non-mitocondrial de respiração, bem como capacidade respiratória e vazamento de próton, alinham-se sobre o rastreamento com efetores mitocondriais correspondentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ensaio de stress mitocondrial. (A) rastreamento representativa das taxas de consumo de oxigênio (OCR, em pMoles/min) de rato neonatal cardiomyocytes. No indicado vezes, oligomicina (Oligo, 1 µM), FCCP (800 nM), e foram injetadas RAA (rotenona e antimycin A, 1 µM cada). Para cada medição, é apresentada a média e o erro padrão da média (SEM) de 10 poços individuais. OCR (B) é calculado como respiração Basal, Oligo (vazamento de próton) e FCCP (respiração máxima) por células de 10 x 103 . (C) OCR é expresso em relação à respiração basal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do reagente e solução | Preparação | Notas |
| Solução de tripsina pré-digestão | Dissolva a tripsina em HBSS (sem Ca2 + e Mg2 +). Concentração final é de 0,5 mg/mL. Esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm e manter no gelo até o uso. | Fazer pré-digestão solução no dia do experimento. |
| Solução de digestão de colagenase | Dissolva a tripsina em HBSS (sem Ca2 + e Mg2 +). Concentração final é de 0,5 mg/mL. Esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm e manter no gelo até o uso. | Fazer a solução de digestão de colagenase no dia do experimento. |
| Meios de cultura de casos | Mix de 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de soro de cavalo e 12,5 mL de FBS. Suplemento com penicilina 1% e 1% solução de estreptomicina. | Meios de cultura de casos pode ser feito antes do experimento e ser armazenado a 4 ° C por um mês. |
| Meio de teste de estresse mitocondrial | Primeiro, fazer 1 L de meio com DMEM sem qualquer piruvato de sódio, L-glutamina, glicose e Hepes, filtro para esterilizar e armazenar a 4 ° C. No dia de ensaio, adicione piruvato de sódio, L-glutamina, glicose e Hepes. Ajustar o pH para 7,4 antes do uso (esterilização não é obrigatório). | Seguem-se uma concentração final de suplementos: piruvato de sódio (1 mM), L-glutamina (2 mM), glicose (10 mM) e Hepes (2mm) |
| Estoque de oligomicina | Dissolva oligomicina em DMSO. Primeiro, prepare-se 5 mL da solução. Uma vez oligomicina é completamente dissolvida em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l, armazenar a-20 ° C. | No dia do ensaio, tome uma alíquota para usar. Evite muitos ciclos de congelamento e descongelamento. |
| Estoque FCCP | Dissolva o Compararia em DMSO. Primeiro, prepare-se 5 mL da solução. Concentração final é de 5 mM. Uma vez que Compararia é completamente dissolvida em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l, armazenar a-20 ° C. | No dia do ensaio, tome uma alíquota para usar. Evite muitos ciclos de congelamento e descongelamento. |
| Estoque de Antimycin A | Dissolva A de antimycin em DMSO. Primeiro, prepare-se 5 mL da solução. Concentração final é de 5 mM. Uma vez que antimycin A é completamente dissolvida em DMSO, 250 alíquotas µ l, armazenar a-20 ° C. | No dia do ensaio, tome uma alíquota para usar. Evite muitos ciclos de congelamento e descongelamento. |
| Estoque de rotenona | Dissolva a rotenona em DMSO. Primeiro, prepare-se 5 mL da solução. Concentração final é de 5 mM. Uma vez que a rotenona é completamente dissolvida em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l, armazenar a-20 ° C. | No dia do ensaio, tome uma alíquota para usar. Evite muitos ciclos de congelamento e descongelamento. |
| Solução de revestimento de chapa de cultura celular | Em primeiro lugar, fazer 200 mL de solução de gelatina de 0,5%. Dissolva gelatina em PBS e autoclave. No dia do experimento, adicione 50 µ l de solução de fibronectina em 5 mL de solução de gelatina para fazer a solução de revestimento. | 0,5 solução de gelatina % pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 2 meses. |
Tabela 1: Reagentes e soluções.
| Orifício de injecção | Compostos e concentração | Volume injetado durante a execução (µ l) | Concentração final no ensaio |
| A | Oligomicina 16 µM | 25 | 2 ΜM |
| B | COMPARARIA 9 ΜM | 25 | 1 ΜM |
| C | Rotenona 20 µM (Rot) e 20 µM antimycin A (AA) |
25 | 2 µM de cada |
Tabela 2: Misturas de injeção.
| Etapas e procedimentos | Medições e Loops |
| Calibração | - |
| Equilibração | - |
| Medição de referência | 3 vezes: misturar 3 min, esperar 2min, medir 3 min |
| Injetar uma (oligomicina) da porta | - |
| Medições | 3 vezes: misturar 3 min, esperar 2min, medir 3 min |
| Injetar o Porto B (FCCP) | - |
| Medições | 3 vezes: misturar 3 min, esperar 2min, medir 3 min |
| Injetar C Porto (RAA) | - |
| Medições | 3 vezes: misturar 3 min, esperar 2min, medir 3 min |
Tabela 3: Programa de analisador de fluxo extracelular.
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Discussion
Neste estudo, nós estabelecemos um protocolo simples para isolar e cultivar cardiomyocytes neonatal do mouse. Usando estes cardiomyocytes, nós também Aperfeiçoamos as condições para medir a taxa de consumo de oxigênio por meio de um sistema analisador de fluxo extracelular. O protocolo permite que se use rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio nas células de trabalho principal do coração, semelhante ao que seria medido no órgão intacto. Nosso protocolo é diferente de protocolos anteriormente publicados16,18. Em primeiro lugar, para alcançar alta viabilidade, apenas filhotes imediatamente ao nascimento são usados (ou seja, P0), em vez de dias zero para três dias de idade (filhotes de P0 para P3), que são comumente usados em outros protocolos de16,19. Em segundo lugar, para minimizar o tempo do experimento, corações foram apenas pre-digeridas com tripsina para 4 h. Além disso, para tornar o procedimento simples e obter resultados reprodutíveis, utilizamos um número mínimo de etapas, conforme descrito. Por exemplo, nosso protocolo usa somente dois tipos de buffers, PBS e HBSS e apenas um tipo de meios de cultura de células e não emprega agitação durante a digestão de colagenase.
Para alcançar alta viabilidade de rato neonatal cardiomyocytes, que é importante para a reprodutibilidade do ensaio OCR, existem vários pontos críticos. Primeiro, usando P0 filhotes recém-nascidos e pré-digestão tripsina e digestão de colagenase, executar no mesmo dia é fundamental para alcançar alta viabilidade. Em segundo lugar, durante a digestão de colagenase, não é recomendável para agitar o tecido cardíaco em banho-maria a 37 ° C. Apesar de agitação é sugerida em muitos protocolos, achamos que isso não é necessário como P0 corações são fáceis de ser digeridos por colagenase. Finalmente, moer suavemente o tecido cardíaco é fundamental para dissociar o cardiomyocytes após a digestão de colagenase.
Nós também testamos miócitos de P1 e P2 tecido cardíaco filhote, usando o mesmo protocolo. No entanto, para estas amostras antigas de coração, achamos que é necessário executar a pré-digestão tripsina durante a noite para atingir rendimentos suficientes de célula (dados não mostrados). Além disso, a viabilidade celular para P1 e P2 cardiomyocytes ascendeu a cerca de 60%, semelhante ao que em outros publicou estudos16. Estes resultados sugerem que o miocárdio P0 tem relativamente menor quantidade de matriz extracelular que corações mais velhas, que permite tempos mais curtos para a pré-digestão tripsina, resultando em maior viabilidade celular e produz estes jovens corações.
Análise de fluxo extracelular (XF) tornou-se um grande e popular método para medir a função bioenergética em células e em mitocôndrias isoladas de20,21. Até à data, um número de estudos utilizados ratos neonatal cardiomyocytes e medido o consumo de oxigênio, usando um Agilent XF24 sistema22,23,24 . Estes estudos utilizando células de rato ao contrário de células de rato-derivado, provavelmente foram realizadas como as células de rato geralmente tem maior viabilidade celular e reprodutibilidade do ensaio, em comparação com os rato miócitos estudadas aqui. Dado que os animais geneticamente modificados foram gerados principalmente em linhas de rato, um protocolo simples e reprodutível para analisar a função bioenergética no rato cardiomyocytes neonatal, como discutimos neste manuscrito, fornece oportunidades para estudar função mitocondrial em miócitos de rato. Esse método pode ser mais facilmente traduzido para dados que podem conduzir à compreensão de novos mecanismos de regulação bioenergética no coração, usando linhas de novo ou existente do rato geneticamente manipulado25,26.
Neste estudo, nós testamos o efeito do número de telemóvel e densidade sobre OCR. Como mostrado na Figura 4B, OCR, medido em poços com 10 x 10320 x 103e 30 x 103 células/poço, foi semelhante. Dado que o chapeamento de 30 x 103 células/poço produziu um poço confluente dentro de um dia após a semeadura, recomendamos dividir células entre 10 x 103 a 30 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços, para o ensaio de OCR. Curiosamente, encontramos 3 h de fome de soro diminuído de OCR. Fatores de crescimento são conhecidos para ativar a glicólise e aumentar o consumo de oxigênio27. Também foi relatado que fatores de crescimento global aumentar a atividade celular e contração dos cardiomyocytes3,28. Contração de casos requer ATP geração2, que depende do consumo de oxigênio. Portanto, esses dados sugerem que fome de soro diminui o consumo de oxigênio através da inativação dos cardiomyocytes. Recomendamos que teste o efeito da fome de soro em OCR na própria configuração experimental.
Como mencionado, as mitocôndrias desempenham papéis-chave na função do coração. Portanto, identificar novos reguladores e vias que regulam o metabolismo oxidativo pode fornecer um meio para identificar novos alvos terapêuticos para o tratamento da insuficiência cardíaca. Desde que um formato bem 96 prevê a possibilidade de testar um maior número de ensaios em comparação com um formato bem 24, esse protocolo também pode ser facilmente adaptado para uma tela de alta taxa de transferência para a identificação de novos reguladores bioenergético em cardiomyocytes29 . Assim, combinando nosso protocolo com geneticamente manipulados cardiomyocytes neonatal, tais como aquelas que têm mutações mitocondriais30, poderia fornecer estudos interessantes para a tela os efeitos dos compostos químicos ou bibliotecas de cDNA, sobre OCR em selvagem-tipo vs. com defeito metabolicamente cardiomyocytes.
Estamos conscientes de que cardiomyocytes Neonatais e adultos têm muitas características diferentes e funções metabólicas31, incluindo os níveis de expressão das enzimas metabólicas de glicose e ácidos graxos32. Portanto, idealmente para usar cardiomyocytes cultivadas in vitro como um sistema de modelo do coração intacto, seria importante continuar a desenvolver um protocolo para analisar eficientemente OCR em adultos cardiomyocytes, para que um poderia comparar sua capacidade oxidativa e características com cardiomyocytes neonatal. Estudos futuros precisará ser perseguido para adaptar esta metodologia para um sistema pode ser reproduzido usando miócitos adultos.
Em resumo, nós mostramos um protocolo simples e reprodutível para analisar o consumo de oxigênio, usando o mouse culto principal rato neonatal cardiomyocytes. Usando este protocolo, conseguimos pode isolar e cultura rato neonatal cardiomyocytes e executar este ensaio de OCR usando um sistema de analisador de fluxo extracelular de formato de 96 poços. Nosso protocolo dá alta viabilidade e importante, resultados consistentemente reprodutíveis. Embora o estudo atual é focado principalmente no consumo de oxigênio e um teste de estresse mitocondrial, o protocolo pode ser facilmente adaptado para analisar a oxidação de ácidos graxos e da glicólise em cardiomyocytes.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório de Murphy e laboratório de Ross. Este trabalho é apoiado pela associação americana do coração (14SDG17790005) para Y.C. NIH (HL115933, HL127806) e mérito de VA (BX003260) para R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
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