Summary
ヒトの女性の前部からSRμCT実験用に均一な大きさの皮質骨標本を調達するために、地質学的(スコア)サンプリングプロトコルを用いた。この方法は、最小限の破壊的で効率的な結果、不規則なサンプル形状からのイメージングアーティファクトを最小限に抑え、マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する円筒形の標本を生み出します。
Abstract
骨は、人間の寿命にわたって構造を変化させる動的で機械的に活性な組織です。骨のリモデリングプロセスの産物は、従来の二次元技術を用いて実質的に研究されてきた。デスクトップマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)およびシンクロトロン放射微小断層撮影(SRμCT)によるX線イメージング技術の最近の進歩により、他の3Dイメージング技術(例えば、SEM)よりも大きな視野(FOV)の高解像度3次元(3D)スキャンを取得することができました。ただし、データ分析に影響を与えるストリークアーティファクトの外観を制限するために、標本はFOV内で正確に中心に配置する必要があります。これまでの研究では、不規則な形状の直線的な骨ブロックの調達が報告され、エッジの不均一や画像切り捨てによるイメージングアーティファクトが発生しています。ヒトの女性の前側面からSRμCT実験用に一貫して大きさの皮質骨コア標本を調達するために、地質サンプリングプロトコル(スコア)を適用しました。このスコアリング方法は、効率的で、組織に対して最小限の破壊です。回転中に等角体であること、および走査中のX線ビームに均一なパス長を提供する性質によって、イメージングアーティファクトを減少させる均一な円筒形サンプルを作成します。X線の断層データの成形および不規則な形状のサンプルの画像処理は、皮質骨マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する技術の可能性を確認する。このプロトコルの目標は、さまざまなタイプの高解像度骨イメージング実験に適応可能な皮質骨コアの抽出のための信頼性と再現性のある方法を提供することです。この作業の包括的な目標は、手頃な価格で一貫性があり、簡単なSRμCTの標準化された皮質骨調達を作成することです。この手順は、生物人類学、地球科学、材料科学などの硬質複合材料を一般的に評価する関連分野の研究者によってさらに適応され得る。
Introduction
近年のイメージング技術の進歩により、非常に高い解像度でX線イメージングデータを取得することが可能になりました。デスクトップマイクロCT(μCT)システムは、非破壊性の性質に起因する、消光骨を撮像するための現在の標準である1.しかし、皮質骨の微細構造特徴をイメージングする場合、μCTの使用はより限定的であった。解像度の制約により、デスクトップシステムは、骨細胞ラクナエのような皮質毛穴よりも小さい微細構造特徴を画像化するために必要な解像度を達成できません。このアプリケーションでは、SRμCTは、これらのシステムの解像度が高いため理想的です1.例えば、バイオメディカルイメージングおよび治療(BMIT)ビームライン2のカナダ光源(CLS)での実験では、ボクセルが0.9μmの小さな画像を生成しています。これまでの研究1、3、4、5は、この解像度を使用して、人間の長い骨(図1)からの皮質骨標本から投影とその後の3次元(3D)レンダリングを取得し、骨細胞ラクナー密度4、6、7、8、9およびヒトの寿命と男女間のラクナ形状とサイズ3の変動を定量化した。 さらなる研究は、ヒト10における骨バンディングの存在を実証しており、法医学人類学的文献において非ヒト哺乳類のみに関連付けられていると以前に認識されていた現象である。
例外的な解像度を達成するためには、X線ビームは、多くの場合、直径数ミリメートルに最大標本サイズを制限する視野(FOV)内に細かく焦点を合わせる必要があります。現在、これらの制限を満たす骨サンプル調達を概説する文献に記載されている包括的で標準化された手順はありません。FOV内のセンタリング標本は、1)イメージング中に180°回転する際にサンプルの中心を維持し、2)スキャンアーティファクトが画像切り捨てがないため制限されていることを確認するために重要です。つまり、FOVの外側のサンプルの部分は、FOV内の焦点に入るビームを妨げない。この場合、再構築アルゴリズムは完全に正しい再構築に必要な減衰データの一部を奪われます。360°(フル回転)スキャンはビーム硬化の影響を最小限に抑えますが、イメージング中の不整列やサンプルの動きによって引き起こされるアーティファクトを増加させることは注目に値します。したがって、360°スキャンは通常よりクリーンなデータを生成しますが、イメージング時間は2倍になり、実験コストとデータ品質の妥協に対処する必要があります。
骨イメージング実験の重要で見過ごされがちな側面は、スキャン前に行われる正確で複製可能な検体調製技術です。SRμCT法を実験に組み込んだ研究では、サンプリングプロトコルについて簡単に言及しているが、著者らは標本を収集するために使用される特定の方法論についてほとんどまたは全く詳細を提供していない。このような研究の多くは、任意の次元の直線的な骨ブロックを切断することを言及しているが、一般的に使用されるツールや埋め込み材料に関するそれ以上の情報を提供しない3,4,10, 11,12,13,14.一部の研究者は、一般的に、関心領域から骨の直線ブロックを除去するためにハンドヘルドロータリーツール(例えば、Dremel)を使用しています (ROI)3,4,10,11,12,13,14.この方法では、FOV より大きいサイズの不均等なサンプルが得られ、スキャンアーティファクトや画像切り捨ての可能性が高くなります。このような標本は、多くの場合、精密ダイヤモンドウェハソー(例えば、ビューラー異性体)を使用して、さらなる精製を必要とする。(200/mmまで)一貫した次元でサンプルを調達することは、取得したデータセットが最高品質で、その後の結果が複製可能であることを保証するために重要です。
サンプル調達方法論の限定的な報告は、以前の調査で実行された方法を採用および検証しようとする際に、困難の余分な層を追加します。現在、研究者は、サンプリング手順の詳細については、著者に直接連絡する必要があります。ここで詳述するプロトコルは、生物医学研究者に、徹底的に文書化され、複製可能で、コスト効率の高いサンプリング技術を提供します。この記事の主な目的は、マイクロアーキテクチャデータの正確な可視化と抽出のためにミルドリルプレスとダイヤモンドのスコアリングビットを使用して、一貫したサイズの皮質骨コアサンプルを調達する方法に関する包括的なチュートリアルを提供することです。この方法は、高圧岩力学15、16、17、18、19の硬質材料のブロックから均一な、小径(1-5ミリメートル)のシリンダーを日常的に収集するために使用される手順から変更されます。
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Protocol
すべての標本は、トレド大学、医科生命科学部、ノースイーストオハイオ医科大学(NEOMED)のエンバーミングされた死体ドナーから、ドナー自身またはドナーの次の親族のインフォームド・コンセントを得て調達された。アクロン大学人間被験者保護のための機関審査委員会(IRB)は、これらの標本が生きている個人から調達されなかったため、完全なIRBレビューから免除されていると考えました。年齢、性別、死因などの人口統計情報は、すべてのドナーに提供されていました。選択された個体は、死亡時に骨改造に影響を与えた可能性のある骨影響状態や治療レジメンへの暴露を文書化していなかった。皮質骨サンプルは、19歳から101歳までの年齢を持つカダビリック現代男性および女性の女性の女性から得られた(平均= 73.9歳)。大腿部ミッドシャフトは、皮質多孔性20、21、22、23、24および骨組織25、26、27の材料密度の変動の検査を含む広範囲に研究されており、微小構造解析に一般的に使用される部位となっている。
1. 組織調達とマセレーション
- 左フェムラの中性糖尿病から約7.5cmの骨ブロックを調達するために、プランジカットカーバイドブレード(複合材料用)を装備した振動鋸を使用してください。
- 45°Cにセットされたインキュベーターに、粉末プロテアーゼ酵素と水道水溶液を充填したオーブンセーフガラス皿に大腿骨ブロックを浸します。
- インキュベーション後、鈍い解剖または歯科用具を使用して、残っている軟部組織および骨膜を慎重に取り除いてください。
注:柔らかい組織を除去するために鋭いツール(例えば、メス)の使用を避けてください。このような器具は、μCTスキャンで検出可能な骨に損傷を与え、検体の保存およびスキャンデータの品質に影響を与える可能性があります。 - 20:1パーツの水道水で5〜10分間超音波洗浄機に骨ブロックを入れ(材料表を参照)、またはハンドヘルドウォーターフロッサー(例えば、Waterpik)を使用して、髄腔 内の破片または閉塞を取り除きます。
- 骨ブロックを試料カップに浸し、70%エタノールで満たします。脂質を除去するために、骨を少なくとも24時間浸漬させます。
注:キシレンは脂質を除去するために使用されるかもしれません。しかし、キシレンに長時間浸漬すると、乳化剤であるため、骨が脆く、またはチョーク状になることがあります。 - 24時間後、エタノールから骨ブロックを取り除き、24〜48時間周囲温度で空気乾燥させます。
注: プロトコルはここで一時停止される場合があります。
2. 組織切片
- ホットプレートに75×25mmのガラス顕微鏡スライドを140°Cにセットします。 スライドの中央に熱エポキシ樹脂の寛大な量を溶かします( 材料表を参照)。
- 顕微鏡用の追加の薄いセクション(<50 μm)を準備する場合、骨ブロックは、トラベキュラを保存するために2部構成のエポキシに埋め込む必要があります。また、壊れやすい標本(例えば、ダイジェネティック骨または高度にトラベクラ化された標本)に対してこのプロトコルを実施する場合には、エポキシに埋め込む標本が必要である。
注:このプロトコルで使用される骨サンプルは、エンバーミングされた死体標本から取り出された。SRμCTを介して、組織の軟部構造(例えば、脈管系)を調べるために検死または外科ケースから新鮮な標本を採取した場合、エポキシを含浸させることでそのような組織に損傷を誘発する可能性がある。このような場合、代替接着剤または取り付け媒体(例えば、両面テープ、モデリング粘土)が推奨されます。
- 顕微鏡用の追加の薄いセクション(<50 μm)を準備する場合、骨ブロックは、トラベキュラを保存するために2部構成のエポキシに埋め込む必要があります。また、壊れやすい標本(例えば、ダイジェネティック骨または高度にトラベクラ化された標本)に対してこのプロトコルを実施する場合には、エポキシに埋め込む標本が必要である。
- 骨ブロックの劣った側面を顕微鏡スライド上の熱エポキシ樹脂に押し込み、骨の長さをスライドに垂直にします。骨の下側をコーティングし、スライドへの安全な接着を確保するために、サンプルを前後にシフトします。
- 熱エポキシが毛穴や亀裂にウィックできるように、取り付けられた標本をホットプレートの上に約5分間置きます。
注:スライド上のエポキシは、最高の接着のために泡の自由でなければなりません。気泡を取り除くために、スライド上でサンプルを前後に移動します。気泡は、しばしば水やエタノールが骨の中に閉じ込められ、蒸発して形成されます。 - 鈍い鉗子を使用してホットプレートから取り付けられた標本とスライドを取り外し、室温で〜10分間冷却することを許可します。カミソリの刃を使用してスライドの端からエポキシを取り除き、チャックがスライドを適切につかむようにします。
- 接着したサンプルを付けたスライドをガラススライドチャックに取り付け、低速断面鋸の旋回アームにチャックを取り付けます( 材料表、 図2を参照)。
注:ビューラーIsoMetのこぎりはこのプロトコルで採用されましたが、IsoMetの代わりに使用できる他の精密断面のこぎり(例えば、レコ、エクサクト、スマートカット、CT3、ビューラーペトロティン、ウェルダイヤモンドワイヤー)が利用可能です。 - 位置付けダイヤルを使用してスイベルアームを調整して、ブレードが接触し、サンプルをトランセクトします。骨の断面が長さに対して垂直に切断されるように、標本を配置します。
- 腕の重量に対抗するために、切断アームの反対側に重みを加えます。
注: 不十分なカウンターウェイトが使用されている場合、サンプルがブレードに負担され、ブレードが破綻する可能性があります。 - 切削液(切削液に水を20:1)を加えます。
- ダイヤモンドウェーハブレードをしっかりと固定し、流体レベルがブレードの切断部分を水没させることを確認します。速度を 200 RPM に設定し、サンプルをブレードにゆっくりと下げます (図 3)。
- ブレードとチャックが揺れ動いたり、跳ねたりしていないことを確認します。過度の動きが見られる場合は、切断を再開する前に、すぐに鋸を停止し、ブレードおよび/またはチャックアームアセンブリを締めます。チャックが積極的に上下に動いている場合は、追加のカウンターウェイトを追加します。目に見える左右の動きを含む過度の動きは、ブレードが破壊する原因となる可能性があります。
- 最初の厚いセクションは、各追加のカットに平行に明確に定義された表面を提供する「廃棄物カット」です。最初の廃棄物カット後、スイベルアームを上げ、位置付けダイヤルを使用してチャックをブレード5mmに向かって移動させます。顕微鏡用のさらなる厚いセクション(〜1mm)は、この方法でさらに収集することができる。
注:貴重な組織を節約するために、廃棄物のカットを省略することができます。ただし、不均一なエッジを持つサンプルを切り離す場合、試料のピークを、採点ドリルビットのエッジに接線状に並べて並ぶことが重要です。- 切断時には、ブレードのカーフを考慮してください。例えば、0.5 mmのカーフを持つブレードから5mmのセクションを取得するには、サンプルを移動し、5.5mmをブレードに向かってチャックします。
- 切断が完了したら、ホットプレートに取り付けられた試料を使用してガラススライドを置き、熱エポキシを溶融します。これにより、スライドから骨ブロックを迅速に除去できます。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
3. サンプルスコアリング
- ステップ2.2-2.4で説明したように熱エポキシ結合技術を使用して、浅いアルミニウムスズ(直径8cm)の底部に5mmの骨切片を取り付けます。
- ミルドリルプレスのXYマシンテーブルにスズを置き(材料表を参照)、固定クランプを手で締めます(図4)。
- 2 mm 内径中空軸ジュエラーのダイヤモンドチップの採点ドリルビット(材料表を参照)をミルドリルチャックに挿入します。深度リミッターを調整して、スズを通してのスコアリングを防ぎます(図5)。
- 骨膜、内視鏡、または高度にトラベキュラー化された領域との密接な接触を避けながら、ドリルビットの下の骨サンプルの中央前側面を整列させます。
注:中前大腿皮質の自動選択は、皮質の厚さが個人間で変化するため、特に年齢が増加するにつれて実現不可能です。 - スズに蒸留水を入れ、サンプルを完全に覆います。これにより、熱の蓄積、サンプルの燃焼、および/または、スコアリング中のドリルビットへの損傷を防ぎます。
注:採点による熱損傷の可能性を評価するために、赤外線温度計を使用して、最初に採点ビットが骨の表面を貫通する際に、蒸留水からの温度測定値を得ました。温度は、この試験のために腐食した10個のサンプルのうち22.9~23.9°Cから1°C変化した。したがって、熱による損傷はごくわずかであると主張する。 - コアビットと骨の間の接触の最初のいくつかのインスタンスのために、骨の上面にリングを着用するために穏やかな圧力を適用します。これにより、採点プロセスの開始時にドリルビットの偏向が防止され、ビットの正しい配置が保証されます。
- 採点中に、ドリルビットをサンプルの中に持ち上げ、水面の下にビットの先端を保ちます。このテクニックを数秒ごとに続けて、閉じ込められた骨のほこりを洗い流し、破片がドリルビットを閉塞していないことを確認します。
注:コアが円錐形を形成している場合、1)がスコアリングビットから骨のほこりを洗い流す時間が不十分であり、2)スコアリングが速すぎるためです。速度が上がると、サンプルから大きな部分が切れ、優れた側面が粉砕される可能性があります。 - スコアリングが完了すると、得られた骨コアが中空ステムドリルビットに滞る可能性があります(図6)。ビットからコアを取り外すために、細かい先端の鉗子または小さいアレンレンチのペアを使用してください(図2)。
- 芯付きサンプルを、画像が撮れるまで、冷たく乾燥した場所にラベル付きのマイクロ遠心分離チューブに保管します。
4. 皮質骨コアからの骨微小建築パラメータを評価するための画像処理ルーチン
- μCT画像の再構成
- SRμCTプロジェクションイメージの再構築のために 、https://www.bruker.com/products/microtomography.html で最新のNReconバージョンをダウンロードしてインストールします。
- デスクトップ上の NRecon ショートカットを選択すると、関連するGPUReconサーバが表示されます。
- 目的のデータセットをポップアップ ウィンドウで開きます。ウィンドウが表示されない場合は、データビューアウィンドウの左上隅にあるフォルダアイコンを選択します。
- SRμCT取得から最初の投影を選択します。[ 出力] で 、[ROI を使用] および [ スケールオン] の選択を削除します。
- 再構築ファイルの保存先を選択します。[ 参照] を選択 し 、Reconという名前の新しいフォルダを作成します。選択したファイル形式は BMP(8) でなければなりません。
- [不整合補正]を確認します。
注: この推定値は、多くの場合、修正に近いです。ラフ 3D レンダーは、矢印を上下に動かして、重なり合うイメージを移動して、左右のエッジができるだけ近くに揃うように手動で調整できます。 - [ 設定]で、 スムージング、 ビーム硬化、CS 回転、オブジェクトが FOV より大きい、リング アーティファクト アルゴリズムを適用する選択を選択します。
- [自動] を選択して、[出力]の下のヒストグラムを調整します。
注: 結果のイメージは薄暗い場合があります。 - [ 開始] を選択して、再構築の処理を開始します。
- 運河/骨細胞ラクナール指数28の標準命名法を使用してください。これには、VOI組織総容積(TV)、運河容積(Ca.V)、運河の総数(Ca.N)、平均運河径(Ca.Dm)、皮質多孔性(Ca.V/TV)、パーセンテージ、ラクナエ(N.Lc)の総数、および平均ラクナボリューム(Lc.V)などが含まれる。mm3 当たりのラクナ密度(N.Lc/BV)を求めるために、骨容積(BV)は総体積から運河容積(TV-Ca.V)を引いたものとして計算される。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
- 再構成画像からのマイクロアーキテクチャデータの収集
- マイクロアーキテクチャパラメータの解析のために 、https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html で最新バージョンのCTAnalyserをダウンロードしてインストールします。
注: CTAnalyser の無料版は機能に制限されています。したがって、より詳細な分析を実行するために、完全なライセンスを購入することをお勧めします。 - イメージ |プロパティ |[ピクセルサイズを変更]で、適用されたμCTイメージングプロトコルのピクセルサイズと一致していることを確認します。
注: ImageJ または同様のプログラムでイメージを編集する場合は、保存時に TIFF ファイルに埋め込まれたヘッダーが変更され、データセットをインポートするときに解析ソフトウェアによってピクセル サイズが変更されることに注意してください。 - 選択 カスタム処理 タスク リストを作成するために 補足資料) をクリックして、スキャン データセットからボーン マイクロアーキテクチャを分析します。CTAnalyser 独自のプラグインを使用して骨細胞のラクナー ネットワーク パラメーターの一般的なプロトコルは、次のとおりです。
注: プラグインタスクリストは、サンプルが FOV で表示される唯一のサブジェクトであるデータセットに適しています。空きスペースが試料を囲む場合は、ROIの適用が必要です。そうでない場合は、3D 解析と個別オブジェクト解析で収集された値が人為的に減少します。- 解析ソフトウェアでカスタム処理メニューを開く前に、画像を再ロードして変更をリセットしたり、変更を調整したり(ImageJなどの編集から)、変更を調整します。
- 画像のノイズを低減するには、3D 空間にガウスローパスフィルタを適用し、丸いカーネルと半径を 2 ~3 にします。
注: これらの設定は、試行錯誤テストを通じて報告された SRμCT 実験のデータセットに適用されました。目標は、データの最高品質の再構築を取得することであった。それぞれのユニークな実験セットアップに合わせて、再構成の設定を調整します。 - 低い値と高い値を選択して、血管管を強調することで、画像にグローバルグレースケールの閾値を適用します。 図 8B と 8D に示す再構成されたスライスは、0~155 のしきい値の例を示しています。
注: ステップ 4.2.3.2 と同様に、ここで適用されるしきい値設定は、試行錯誤を行って選択されました。閾値は、使用する実験用セットアップおよびμCTイメージングシステムごとに調整する必要があります。 - 脱スペックル (ノイズ除去)は、運河のみを分離するために、骨細胞ラクナエの体積ピクセル(ボクセル)サイズ範囲内にある3D空間内の白い斑点を除去する。
注:0.9 μmピクセルサイズで採取したヒト皮質骨のSRμCTスキャンの場合、骨細胞ラクナエの下限は13ボクセルです。 - 運河のアーチファクトを取り除くために2D空間の黒い斑点を取り除くために脱スペックル。これらは 2D では非常に大きくなる可能性があるため、<15,000 ピクセルのフィーチャを削除します。
- 運河に閉じ込められた柔らかい組織を分離するために、画像の品質に応じて、半径2または3の丸いカーネルを使用して、3D空間の細孔を拡張します。
- ステップ 4.2.3.5 と同じ設定を使用して、追加の 脱スペックル 関数を実行します。運河内の孤立した軟組織を除去するために。
- ステップ 4.2.3.6 から拡張を侵食します。.半径 2 または 3 のラウンド カーネルを使用して 、形態演算 関数を使用します。このステップの半径は、手順 4.2.3.6 で使用されている半径と一致する必要があります。
- 3D解析を実行し、血管管の体積を計算するパラメータを選択します。一般的に、基本値は十分な情報を提供します。
- 処理された画像を 保存ビットマップ をディレクトリ内のカスタムサブフォルダに保存します。
注:アミラ/アビゾ、トンボ、ドリシュティなどのプログラムを使用して処理された画像から3D再構成画像を作成する場合は、モノクロ(1ビット)として保存することをお勧めします。 - 血管管の数を計算し、 個々のオブジェクト分析 機能を使用して、そのサイズ、形状、および向きを記述します。
- ステップ 4.2.3.1 ~ 4.2.3.3 を繰り返します。骨細胞ラクナ解析のために画像をリセットします。
- デスペックル関数を使用して 3D 空間内の白い斑点を除去し、そのようなアーティファクトがラクナーサイズの下限よりも小さくなっていることを確認します。このステップは、真の骨細胞ラクナエを維持しながら、皮質毛穴のように見えるスキャンからノイズを除去します。0.9 μmピクセルサイズのヒトSRμCTスキャンの場合、この下限は13ボクセルです。
- ラクナーサイズの上限を超える白い斑点を取り除くためにもう一度脱ペックル。ステップ 4.2.3.13 に記載されている設定を持つヒト SRμCT データセットの場合、この制限は 2743 ボクセルです。
- 骨細胞ラクナエに関する微細構造情報を具体的に抽出するために 3D解析 を行う。
- [ ビットマップを保存] を選択して、処理された画像を保存して、骨細胞ラクナエを分離します。
- 個別オブジェクト分析を実行して、選択した関心量(VOI)内の3Dの骨細胞数を計算します。
メモ:タスクリストが確立され、テストされると、CTAnalyserは、データ抽出を高速化し、均一な画像処理を保証するために使用することができるバッチマネージャ(BatMan)機能を持っています。手順 4.2.3 の設定例を含むタスク リスト。 補足資料を見つけることができます。
- マイクロアーキテクチャパラメータの解析のために 、https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html で最新バージョンのCTAnalyserをダウンロードしてインストールします。
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Representative Results
コアサンプリングの記載された方法は、非常に効果的かつ効率的であることが判明しました。このプロトコルを使用した試料の採点は、1.49 μmボクセルサイズで約2mmのFOVを有するCLS BMIT-BMビームライン2での実験用に、一貫してサイズのサンプルを>300の調達に可能にした。コア直径の一貫性を検証するために、人間の前大腿心のサブセットの長さ(上、中央、下)に沿って3つの測定値を測定しました(n=69)。コアの平均直径は1.96±0.11mmで、コアの長さに沿った平均薄化は0.06±0.06mm/mm他の硬質複合材料への適用性を強調するために、この方法をドロマイト(n=32)のサンプルに対して試みたため、平均直径は1.06±0.02mmでした。コアサンプルの長さに沿って間引きは0.01±0.005 mm/mmとして記録されました。ステップ4.2.3で説明したように、硬化した試料とロータリーツールを用いて調達した1本(例えば、ドレメル)の画像処理ワークフローを比較した代表的な図は、図7に示すことができる。一般的な回転ツールを使用したサンプルカットでは、カナル(Ca.N)とラクナエ(Lc.N)の数が増加し、平均運河径(Ca.Dm)、運河容積(Ca.V)、皮質孔質(Ca.V/TV)がコードサンプルと比較して減少しました。これらの違いの一部は、個人間の骨の微細構造の変動が原因である可能性がありますが、回転ツールデータセットから抽出された運河およびラクナエの数が多いほど、スキャンアーティファクトとノイズのために人工的に増加した可能性があります(図7)。各サンプルのステップ 4.2.3.9 から収集された空隙率データは、表 1にあります。この採点プロトコルはSRμCTスキャンで観察されたアーチファクトを減少させるが、直流骨ブロック実験(図7A)の低品質の人工物を含む数値は多面的な問題を表していることは注目に値する。特定のアーティファクト(例えば、位相コントラスト信号)は、シンクロトロン施設またはビームライン特有の問題によって引き起こされた可能性があります。実験の代表的なセットと関連する図(図7A、7B)の両方のスキャンパラメータは、補足材料(表S1、S2)にあります。
上記に示すように、コレクトされたサンプルから収集されたシンクロトロンマイクロCT画像は、ストリークアーティファクトを含むスキャンアーティファクトを正常に抑制しました。その後の画像処理は、皮質骨マイクロアーキテクチャの可視化を改善する技術の可能性を確認した。例えば、鉱化の違い、骨界境界の改善された線引き、および血管管内の軟組織の一貫した視覚化が観察された(図8C、8D)。後者は、細孔が完全に満たされていないので、運河内の軟組織の部分的な視覚化が、気孔率と孔厚の不正確な計算をもたらす可能性があるため、画像処理にとって重要である。骨細胞ラクナエの境界も複屈折の減少により改善され、形状パラメータの定量化が可能であった。記載されたスコアリング技術の潜在的な利点は、FOVに標本を中心にする容易さ、分析要件の低下、および血管管内の軟組織の一貫した視覚化を含む。
同様の手順は、高圧岩変形実験のためのオルトピロキセン18、多結晶マグネサイト19および他の地質材料15、16、17のコア単結晶にうまく使用されています。これらの実験では、配向特異的強度を決定するために、単結晶18の結晶学的軸に対して特定の向きのコアが必要、または多結晶岩19の結晶に整列する。上述のアプローチは、最初に指向スラブを作成し、その後、一連の変形実験のために複数の均一な円筒形コアを収集するために使用されてきました。これらの方法は、骨、セラミックス、ガラスなどの硬質材料のコアを収集するために使用することができます。例えば、上記の方法論は、皮質骨内の特定の領域および関連する生体力学的(例えば、張力/圧縮)軸からのコアを評価するために生物人類学者によって適用することができる。
図 1.左前前から円筒形VOIヒト中シャフト大腿骨。 左前前のヒト中軸大腿骨(21歳の女性)(A)からコア全体の単一のSRμCT再構成されたスライス(A)と、上面(B)と前方のビュー(C)からの円筒形VOIの3Dレンダリングが可視化される。投影は0.9 μmで撮影され、血管管は赤で、骨細胞ラクナエは灰色で強調された。スケール バーは 0.25 mm (A) と 0.02 mm (B,C) を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.中軸の大腿試料(厚さ5mm)を熱エポキシ(材料表参照)でガラス顕微鏡スライドに取り付け、ガラススライドチャックに固定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.取り付けられた標本が付いたガラススライドチャックは、断面化前に低速断面鋸(材料表を参照)の旋回アームに固定されています。 鋸刃に対する回転腕の横位置と断面速度(RPM)は、LCDディスプレイの上下の列にそれぞれ表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.アルミニウムスズに取り付けられた5mmの大腿部は、コーリングに備えて固定クランプを使用してXYミルドリルプレス機テーブルに固定されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.工夫されたプロトコル(A)に採用されているミルドリルプレス。矢印は深度リミッターを識別し、ドリルビットがサンプルに深く浸透したり、スズの底部(B)を通り抜けないようにします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.前側面からの中心調達後の5mm大腿骨の断面。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.単一SRμCTは、2人の個体から左大腿骨の前側面のスライスを再構築した。標本(A)を共通の回転工具を用いて切片し、ここで説明した採点方法を用いて(B)調達した。各スライスは、セグメント化された対応する(C と D) と比較されます。回転工具(C)で採取した試料とは対照的に、芯付き試料(D)中の皮質孔隙間を単離し易さに注意してください。これは、各サンプルの血管管の3Dレンダリング(EおよびF)でさらに証明される。Bの周囲の騒音は明らかであり、標本はFOVを離れ、画像処理中の課題が増加する。パネルのスケールバー(D)は、パネル用の250 μm(A-D)を示します。パネルのスケールバー(EとF)はそれぞれ700と600μmを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8.ロータリーツール(A-C)で調達したサンプルからの代表的なROIと、ここで示す方法(D-F)を使用して1つのコーレド。 パネル (A) および (D) は、SRμCT スキャンからの指定された ROI を表します。パネル(B)および(E)は、血管管パラメータを分離して抽出するために使用される処理段階を表す。パネルの右上(B)には、画像処理ソフトウェアによって血管管に分類された無関係な物体(矢印)があります。パネル(C)と(F)は、ラクナエを分離して抽出するために使用される処理段階を表します。スケール バーは、すべてのパネルの 0.1 mm を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ティッシュボリューム(テレビ) | 運河容積(Ca.V) | カナルサーフェス(Ca.S) | 皮質多孔性(Ca.V/TV) | 運河表面から組織への体積(Ca.S/TV) | 平均運河径 (Ca.Dm) | 平均運河分離 (Ca.Sp) | いいえ。運河の中で | いいえ。ラクナエ(Lc.N)の | 細孔密度(毛穴/テレビ) | |
| 単位 | mm³ | mm³ | mm² | % | 1/mm | Μ m | Μ m | # | # | 毛穴/μm³ |
| ロータリーカット | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| コラード (このメソッド) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
表 1.回転工具および芯付き試料のステップ4.2.3.9の代表的な結果を 図8に可視化。減少したCa.V、Ca.V /TV、Ca.Dm、ロータリーカットサンプルの細孔および細孔密度の数だけでなく、血管管およびラクナエの数の増加に注意してください。不均一に切断されたサンプルによって部分的に誘発されたスキャンアーティファクトは、ラクナおよび皮質毛孔の人工的な増加に寄与した可能性が高い。
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Discussion
限られたFOVセットアップで高解像度のSRμCTイメージング用の均一および円筒形皮質骨コアサンプルを調達するための包括的で標準化されたプロトコルはありませんでした。ここで詳述するプロトコルは、SRμCTイメージングのための一貫したサイズの皮質骨コアサンプルを調達する方法と、その後のマイクロアーキテクチャデータの正確な可視化と抽出に関する包括的なチュートリアルを提供することによって、その空隙を埋めます。我々のプロトコルは、任意の次元の直線的な骨ブロックを断面化する以前の記述よりも、皮質骨コアを調達するためのより標準化された信頼性の高い方法を提供することを示した。したがって、不規則な大きさの骨ブロックを除去するためにハンドヘルドロータリーツール(例えばDremel)に頼ってきた研究者は、イメージング中にサンプルセットアップ時間がはるかに長くなり、分析中の閾値および皮質毛穴抽出におけるより大きなエラーが発生した可能性が高い。この不一致は、骨サンプルの調製、その後の可視化と分析、および解釈結果に関するこの標準化されたプロトコルの必要性と重要性を強調しています。
ここで概説する手順は、生物人類学者や考古学者などの骨組織を一般的に評価する関連分野の研究者によってさらに適応される可能性があります。しかし、説明された研究プロトコルのために、糖尿病性も考古学的/歴史的骨標本も取り除かれなかった。ジアジェネシスは、地質学において、沈着後の物質(例えば、骨)の変化をいい、物理的、化学的、または生物学的手段29、30によって引き起こされる変化を包含し得る。地下水、真菌、および他の微生物浸潤は、いずれも、糖尿病の薬剤として作用し、骨組織の微小形態を変化させることができる。このような標本は、メチルメタクリレート(MMA)または2部エポキシ樹脂に埋め込むなど、スコアリングの前に追加の手順を必要とすることがあります。大腿骨ブロックを埋め込むのは、大腿皮質骨の密な性質と、死の直後に死体標本がエンバーミングされたという事実のために、記載された実験には必要ではなかった。ただし、壊れやすい骨格要素とその柱状子(例えば、肋骨)を評価する場合は、採点前に骨ブロック全体を埋め込むのがおすすめです。
この研究で評価されたすべての骨組織は、新鮮な間にエンバーミングされた。著者らは、エンバーミングプロセス中に使用される化学物質の特定の組み合わせにはアクセスできませんでしたが、保存化学物質にはホルムアルデヒド、エタノール、フェノール、エチレングリコール、グルタルアルデヒドが一般的です。ホルムアルデヒド飽和骨の微細構造の変化を記録した法医学人類学的データは限られているが、フライドランダー32はホルムアルデヒド固定が、Haversian運河および二次骨を含む特定の特徴の形態を変化させないことを実証した。しかしながら、ホルムアルデヒド飽和度は、衝撃強度および破壊靭性33,34のような非ヒト骨の特定の機械的特性および破壊特性に対する影響を文書化している。
高解像度X線システム(SRμCT)によるイメージングの前に皮質骨サンプルを採点する方法を報告しました。この方法は、材料や機器が地元のハードウェアストアから調達され、効率的であり、試料全体で均一なサンプルサイズを保証することができるという事実のために、費用対効果が高いです。既存の文献はまばらであり、準備とその後の分析に関する重要な詳細が欠けているため、SRμCTのサンプル調達、コーレート、分析方法に関する問い合わせを減らすことを期待しています。私たちの主な目標は、研究者がこの採点プロトコルを高解像度の骨イメージング研究のための標準化された手順として適用する動機付けすることです。さらに、この手法の開発において、前述の困難が、一般的な質問を緩和し、トラブルシューティングのガイダンスを提供することを期待しています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この論文に記載されている研究は、カナダイノベーション自然科学工学研究評議会、サスカチュワン大学、サスカチュワン州政府、カナダ西部経済多様化カナダ、カナダ国立研究評議会、カナダ保健研究所の支援を受けたカナダ光源のBMIT施設で行われました。著者らは、カナダ光源、特にアダム・ウェッブ、デニス・ミラー、セルゲイ・ガシロフ、寧ズーのビームライン科学者に、SkyScan SRμCTと白いビーム顕微鏡システムのセットアップとトラブルシューティングに協力してくれたことに感謝したいと考えています。また、トレド医科生命科学大学のベス・ダルツェルと、オハイオ州北東部医科大学のジェフリー・ウェンストルップ博士に感謝したいと考えています。JMアンドロノフスキは、アクロン大学と国立司法科学法医学研究所が提供するスタートアップ研究資金(2018-DU-BX-0188)を通じて支援されています。RAデイビスは、アクロン大学が提供する大学院助手によってサポートされています。採点および鋸で使用される装置および供給は、アクロン大学とNSFが、CW HolyokeにEAR-1624242を交付するスタートアップ資金によって購入された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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