Summary
I microRNA sono coinvolti nella patogenesi della nefropatia da IgA. Abbiamo sviluppato un metodo affidabile per rilevare i livelli di espressione di microRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Questo nuovo metodo faciliterà il coinvolgimento dei miRNA nella nefropatia da IgA.
Abstract
La nefropatia da immunoglobuline A (IgA) è un tipo di glomerulonefrite primaria caratterizzata dalla deposizione anomala di IgA, che porta all'insufficienza renale allo stadio terminale. Negli ultimi anni, il coinvolgimento dei microRNA (miRNA) è stato riportato nella patogenesi della nefropatia da IgA. Tuttavia, non esiste un metodo stabilito per profilare i miRNA nella nefropatia da IgA utilizzando modelli di piccoli animali. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per analizzare i miRNA nel rene di un modello murino IgA (topo HIGA). L'obiettivo di questo protocollo è rilevare i livelli di espressione alterati dei miRNA nei reni dei topi HIGA rispetto ai livelli nei reni dei topi di controllo. In breve, questo metodo consiste in quattro passaggi: 1) ottenere campioni di rene dai topi HIGA; 2) purificazione dell'RNA totale da campioni renali; 3) sintetizzare DNA complementare dall'RNA totale; e 4) reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa (qRT-PCR) dei miRNA. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato con successo i livelli di espressione di diversi miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p) nei reni dei topi HIGA. Questo nuovo metodo può essere applicato ad altri studi che profilano i miRNA nella nefropatia da IgA.
Introduction
La nefropatia da immunoglobuline A (IgA) è un tipo di glomerulonefrite primitiva caratterizzata dalla deposizione anomala di IgA nella regione mesangiale glomerulare renale 1,2. È la più comune delle glomerulonefriti primarie e porta all'insufficienza renale allo stadio terminale nel 20%-40% dei pazienti2. La causa è ancora sconosciuta, ma è stata implicata un'infezione persistente della mucosa 1,3. Corticosteroidi, immunosoppressori e inibitori del sistema renina-angiotensina sono stati proposti come metodi terapeutici1,3, ma non sono stati completamente stabiliti 3. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire l'eziologia e i metodi terapeutici di trattamento della nefropatia da IgA.
I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti che svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica 4,5. I miRNA sono coinvolti nella patogenesi di varie malattie e alcuni sono stati identificati come biomarcatori di malattia e agenti terapeutici 4,5. Negli ultimi anni è stata riportata anche un'associazione tra miRNA e patogenesi della nefropatia da IgA 2,6,7. Ad esempio, miR-148b ha dimostrato di essere coinvolto nelle anomalie strutturali delle IgA nei pazienti con nefropatia da IgA 2,6,7, mentre miR-148b e let-7b sono stati documentati come nuovi biomarcatori per rilevare la nefropatia da IgA7. Sebbene la comprensione degli effetti dei miRNA sulla nefropatia da IgA possa aiutare a chiarire ulteriormente l'eziologia e il trattamento 2, non sono ancora stati stabiliti metodi standard per la profilazione dei miRNA nella nefropatia da IgA utilizzando modelli di piccoli animali2.
Abbiamo sviluppato un metodo semplice e affidabile per misurare i livelli di espressione dei miRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Il topo HIGA è un ceppo ddY caratteristico che mostra un livello particolarmente elevato di IgA sieriche e la deposizione anomala di IgA nei glomeruli renali 8,9,10,11. Pertanto, i topi HIGA possono essere utilizzati come un modello murino per nefropatia IgA 8,9,10,11. Il nostro metodo consiste in quattro fasi principali: in primo luogo, ottenere chirurgicamente campioni di rene da topi HIGA; in secondo luogo, omogeneizzare i campioni e purificare l'RNA totale utilizzando una colonna di spin basata su membrana di silice; terzo, sintetizzare DNA complementare (cDNA) dall'RNA totale utilizzando la trascrizione inversa; e quarto, rilevare i livelli di espressione dei miRNA mediante reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa (qRT-PCR). La logica di questo metodo e l'affidabilità dei risultati si basano sulle relazioni precedenti12,13. Mostriamo che questa è una tecnica utile per misurare con precisione i livelli di espressione dei miRNA in un modello murino di nefropatia da IgA e che potrebbe essere utilizzata per facilitare la ricerca futura sui miRNA nella nefropatia da IgA.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato etico animale della Jichi Medical University e sono conformi alle linee guida sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Guida della Jichi Medical University per gli animali da laboratorio.
1. Ottenere campioni di rene da topi HIGA
NOTA: I topi HIGA mostrano un fenotipo stabile di nefropatia da IgA dopo 25 settimane di età 8,9,10,11. I topi Balb/c devono essere selezionati come gruppo di controllo 8,9,10,11. Sono stati ottenuti topi HIGA femmina di 25 settimane (n = 10) e topi Balb / c femmina di 25 settimane (n = 10). È necessario determinare in anticipo il numero di topi necessari per gli esperimenti. Questo passaggio richiede circa 7-8 ore per un campione di 10 topi HIGA e 10 topi Balb / c.
- Preparare questi articoli: topi HIGA (25 settimane, femmina), topi Balb / c (25 settimane, femmina), apparecchio per anestesia inalatoria, isoflurano, foglio di sughero, spillo, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), siringhe per iniezione, aghi, forbici chirurgiche e pinze.
- Anestetizzare un topo HIGA usando il 4%-5% di isoflurano con apparecchio per anestesia per inalazione e montarlo in posizione dorsale sul foglio di sughero usando perni. Regolare la concentrazione di isoflurano al 2%-3% come dose di mantenimento dopo l'induzione dell'anestesia.
NOTA: La profondità dell'anestesia viene mantenuta a un livello in cui il dolore associato alla procedura invasiva viene completamente eliminato. In particolare, la concentrazione di isoflurano deve essere regolata al 4-5% quando si asportano tessuti come il torace. La depilazione e l'unguento per gli occhi non sono essenziali. Non è necessario montare il mouse su una piastra riscaldante se la procedura può essere eseguita rapidamente. - Fare un'incisione della linea mediana di 3-4 cm della parete addominale del topo con forbici chirurgiche e pinze e identificare attentamente entrambi i lati del rene.
- Incidi le costole e il diaframma con forbici chirurgiche e pinze per esporre il cuore. Dopo aver inciso l'atrio destro, iniettare PBS nel ventricolo sinistro fino a quando il colore del rene diventa giallo pallido (questa procedura significa che l'intero corpo del topo è perfuso con PBS).
- Tagliare l'arteria renale, la vena renale e l'uretere e rimuovere il rene. Dividere il rene in pezzi da 30 mg per l'uso nella fase successiva.
NOTA: La patologia della nefropatia da IgA coinvolge principalmente il glomerulo nella corteccia renale (parte esterna del rene). Sebbene sia difficile distinguere macroscopicamente e completamente la corteccia e il midollo, è auspicabile raccogliere principalmente la parte esterna del rene. Questi campioni possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi.
2. Purificazione dell'RNA totale da campioni di rene
NOTA: In questa fase, il kit di isolamento dei miRNA disponibile in commercio viene utilizzato per l'estrazione dell'RNA totale. Inoltre, viene utilizzata la colonna di rotazione per la triturazione dei biopolimeri. Vedere la tabella dei materiali per ulteriori dettagli. Il kit di isolamento dei miRNA contiene una colonna di spin a base di membrana di silice, reagenti di lisi a base di fenolo/guanidina, tampone di lavaggio guanidina/etanolo (tampone di lavaggio 1), tampone di lavaggio con etanolo (tampone di lavaggio 2) e acqua priva di nucleasi. Questo passaggio richiede circa 3 ore per un campione di 10 topi HIGA e 10 topi di controllo.
- Preparare i seguenti elementi: provette di raccolta da 1,5 o 2,0 ml, etanolo al 100%, cloroformio, omogeneizzatore al silicio, micropipette, punte per pipette, centrifuga, colonna di spin per triturazione di biopolimeri, colonna di spin a base di membrana di silice, reagenti di lisi a base di fenolo/guanidina, tampone di lavaggio con guanidina/etanolo (tampone di lavaggio 1), tampone di lavaggio con etanolo (tampone di lavaggio 2) e acqua priva di nucleasi.
- Omogeneizzare campioni di rene da 30 mg utilizzando un omogeneizzatore al silicio e 700 μL del reagente di lisi a base di fenolo/guanidina a temperatura ambiente.
NOTA: I miRNA nel campione sono vulnerabili fino a quando non sono stati esposti al reagente di lisi a base di fenolo/guanidina, quindi questi passaggi devono essere eseguiti tempestivamente. - Trasferire il lisato nella colonna di spin di triturazione del biopolimero e centrifugarlo a 15.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 140 μL di cloroformio al filtrato e mescolare energicamente per 15 s. Lasciare agire per 2-3 minuti, quindi centrifugare a 12.000 x g a 4 °C per 15 minuti.
- Trasferire delicatamente il surnatante trasparente senza toccare lo strato intermedio in un nuovo tubo di raccolta e aggiungere il volume determinato (vedi sotto) di etanolo al 100%. Vortice per 5 s.
NOTA: è richiesto etanolo al 100% a 1,5 volte il volume del surnatante ottenuto. - Trasferire il campione (limite superiore 700 μL) su una colonna di spin a base di membrana di silice e centrifugare il campione a temperatura ambiente per 15 s a 8.000 x g. Eliminare il filtrato dopo la centrifugazione.
- Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio 1 alla colonna di spin a base di membrana di silice e centrifugare la colonna a temperatura ambiente per 15 s a 8.000 x g. Eliminare il filtrato dopo la centrifugazione.
- Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio 2 alla colonna di spin a base di membrana di silice e centrifugarla a temperatura ambiente per 15 s a 8.000 x g. Eliminare il filtrato dopo la centrifugazione.
- Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio 2 alla colonna di spin a base di membrana di silice e centrifugarla a temperatura ambiente per 15 s a 8.000 x g. Eliminare il filtrato dopo la centrifugazione.
- Centrifugare nuovamente la colonna di spin a base di membrana di silice senza aggiungere nulla per rimuovere l'etanolo aggiuntivo, a 15.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente. Gettare via il filtrato dopo la centrifugazione.
- Sostituire il tubo collegato alla colonna di rotazione con un nuovo tubo di raccolta.
- Aggiungere 30 μL di acqua priva di nucleasi alla colonna di spin a base di membrana di silice e centrifugarla a 8.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
NOTA: La soluzione risultante da 30 μL contiene un'alta concentrazione di RNA totale. Questo campione può essere conservato a –80 °C per diversi mesi.
3. Sintesi di cDNA da RNA totale
NOTA: in questa fase, viene utilizzato un kit di trascrizione inversa disponibile in commercio. Vedere la tabella dei materiali per ulteriori dettagli. Questo kit contiene miscela di acidi nucleici, miscela di trascrittasi inversa e tampone. Questa procedura deve essere eseguita su ghiaccio per impedire il progresso della reazione. Questo passaggio richiede circa 3 ore per un campione di 10 topi HIGA e 10 topi di controllo.
- Preparare i seguenti elementi: provette di raccolta da 1,5 ml, tubi a otto pozzetti, micropipette, puntali per pipette, spettrofotometro, acqua priva di nucleasi, ghiaccio, miscela di acidi nucleici, miscela di trascrittasi inversa, tampone e termociclatore.
- Misurare la concentrazione di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro. Quindi, calcolare il volume richiesto di acqua priva di nucleasi in modo che 12 μL contengano 1 μg di RNA totale.
- Preparare una miscela master con i seguenti contenuti: 2,0 μL di miscela di acidi nucleici, 2,0 μL di miscela di trascrittasi inversa e 4,0 μL di tampone per un totale di 8,0 μL per campione.
- Aggiungere 8 μL della miscela principale a ciascun pozzetto di tubi a otto pozzetti.
- Diluire l'RNA totale nel volume di acqua esente da nucleasi calcolato in 3.2. Quindi, aggiungere 12 μL della soluzione di RNA totale (contenente 1 μg di RNA totale) a ciascun pozzetto di tubi a striscia a otto pozzetti.
- Incubare il campione in 8 tubi a nastro a 37 °C per 60 minuti utilizzando il termociclatore. Quindi, incubare a 95 °C per 5 minuti utilizzando il termociclatore.
NOTA: La soluzione dopo l'incubazione contiene un'alta concentrazione di cDNA. - Trasferire questa soluzione in un tubo da 1,5 mL e aggiungere 200 μL di acqua priva di nucleasi.
NOTA: I 200 μL di soluzione risultanti possono essere utilizzati per la qRT-PCR come modello di cDNA. Questo campione può essere conservato a -80 °C per circa 1 anno.
4. qRT-PCR dei miRNA
NOTA: in questa fase, viene utilizzato un kit PCR disponibile in commercio. Vedere la tabella dei materiali per ulteriori dettagli. Questo kit contiene miscela PCR, primer universale e acqua priva di nucleasi. I campioni devono essere preparati in duplice copia e l'accuratezza dei risultati deve essere considerata in ciascun caso. I livelli di espressione dei miRNA sono quantificati con il metodo ΔΔCT. Questo passaggio richiede circa 4 ore per un campione di 10 topi HIGA e 10 topi di controllo.
- Preparare i seguenti elementi: tubo di raccolta da 1,5 ml, piastra di reazione a 96 pozzetti, pellicola adesiva per la piastra di reazione a 96 pozzetti, micropipette, punte per pipette, miscela PCR, primer universale, acqua priva di nucleasi, primer specifici per miRNA e uno strumento PCR in tempo reale.
- Preparare la miscela master con i seguenti contenuti: 12,5 μL di miscela PCR, 2,5 μL di primer universale, 1,25 μL di primer specifico per miRNA da 5 μM e 6,25 μL di acqua priva di nucleasi per ciascun pozzetto.
NOTA: In questo test sono stati utilizzati primer specifici per i miRNA [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p]. RNU6-2 è stato utilizzato come controllo endogeno14. - Aggiungere 22,5 μL della miscela master a ciascun pozzetto della piastra di reazione a 96 pozzetti.
- Aggiungere 2,5 μL di cDNA preparato al punto 3.7 al singolo pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
- Coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con pellicola di adesione, quindi centrifugare a 1.000 x g per 30 s.
- Eseguire lo strumento PCR in tempo reale. Programmare lo strumento PCR come segue: attivazione iniziale a 95 °C per 15 minuti, poi 40 cicli di denaturazione a 94 °C per 15 s, ricottura a 55 °C per 30 s ed estensione a 70 °C per 30 s.
- Quantificare l'espressione genica utilizzando il metodo ΔΔCT. I livelli di espressione relativa sono determinati come 2–ΔΔCT.
NOTA: Le curve di amplificazione anomala della PCR devono essere considerate per l'esclusione dai risultati.
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Representative Results
Abbiamo studiato i livelli di espressione dei miRNA nei reni dei topi HIGA (n = 10). Questo risultato è stato ottenuto completamente sulla base del protocollo descritto. I reni dei topi Balb/c sono stati selezionati come controllo (n=10). In entrambi i gruppi, sono state selezionate 25 settimane di età. Solo topi HIGA femmina erano disponibili dal fornitore. I livelli di espressione di tre miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p; Figura 1) sono stati rilevati, che erano stati precedentemente segnalati per essere associati a nefropatia da IgA15,16. I livelli di espressione relativa dei miRNA dei due gruppi sono stati confrontati utilizzando un t-test, con P < 0,05 statisticamente significativo. miR-155-5p è stato espresso a livelli 3,3 volte più alti nel gruppo HIGA rispetto al gruppo di controllo (P < 0,001), mentre miR-21-5p è stato espresso a livelli 1,58 volte più alti nel gruppo HIGA (P = 0,007). L'espressione di miR-146a-5p non differiva significativamente tra i due gruppi.
Figura 1: Livelli di espressione dei miRNA nei reni dei topi HIGA. qRT-PCR ha determinato i livelli di espressione relativa di miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p in topi HIGA (n = 10) e topi Balb / c (n = 10). I livelli di espressione relativi sono indicati come valori medi ed errori standard. (A) l'espressione di miR-155-5p era 3,3 volte superiore nel gruppo HIGA (P < 0,001). (B) L'espressione di miR-146a-5p non differiva significativamente tra i due gruppi. (C) l'espressione di miR-21-5p era 1,58 volte superiore nel gruppo HIGA (P = 0,007). reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR); microRNA (miRNA); non significativo (NS); *, p <0.05. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Siamo stati in grado di misurare i livelli di espressione dei miRNA nei reni di un modello murino di nefropatia da IgA (topi HIGA) utilizzando questo nuovo metodo. La nefropatia da IgA è una malattia inspiegabile che necessita di ulteriori ricerche per chiarirne l'eziologia e gli obiettivi terapeutici 1,3. Tuttavia, ottenere campioni di rene umano è altamente invasivo. Questa nuova tecnica è vantaggiosa in quanto consente lo studio della nefropatia da IgA utilizzando piccoli animali e dovrebbe facilitare la ricerca futura sulla nefropatia da IgA e sui miRNA. In uno studio futuro, questo metodo potrebbe essere applicato allo studio di nuovi miRNA per il trattamento della nefropatia da IgA. La modulazione artificiale dei miRNA nei topi HIGA può influenzare il fenotipo della nefropatia da IgA. In tal caso, questo metodo può essere utile per verificare i cambiamenti dei miRNA. Questo metodo non è destinato all'analisi dei miRNA nel siero, ma potrebbe essere possibile utilizzarlo per questo modificando il protocollo.
La logica di questo metodo si basa su rapporti precedenti. Abbiamo usato colonne di spin per la triturazione dei biopolimeri per distruggere i biopolimeri nel campione, che in precedenza si è dimostrato una tecnica efficace12. Rapporti precedenti hanno anche dimostrato l'accuratezza della sintesi del cDNA dall'RNA totale utilizzando la trascrizione inversa e l'esecuzione della PCR utilizzando il cDNA preparato come modello13. Come passo critico in questo metodo, la valutazione dei risultati della PCR è importante. È necessario escludere curve di amplificazione anomale dai risultati. Inoltre, i cambiamenti nei controlli endogeni dovrebbero essere presi in considerazione se non si ottengono risultati stabili14.
Un grosso problema che può essere incontrato con questo metodo è l'espressione anormalmente bassa dei miRNA. I miRNA sono composti altamente degradabili, quindi il metodo dovrebbe essere eseguito rapidamente. Inoltre, gli effetti della ribonucleasi (RNasi) nell'ambiente sperimentale devono essere eliminati. I ricercatori dovrebbero sempre essere consapevoli della presenza di RNasi nella pelle e nei capelli17. È necessario indossare guanti monouso, maschere e cuffie per capelli per gli esperimenti. Inoltre, le apparecchiature di laboratorio come micropipette, punte per pipette e provette di raccolta devono essere pulite per garantire l'assenza di RNasi17. La disattivazione della RNasi utilizzando un'autoclave deve essere eseguita secondo necessità17. In caso contrario, i ricercatori dovrebbero utilizzare elementi certificati RNase-free17. Tutti i campioni devono essere conservati correttamente nelle condizioni raccomandate per ridurre il rischio di contaminazione da RNasi.
Il nostro metodo ha tre importanti limitazioni. Il primo è che non abbiamo dimostrato se può essere applicato ad altri animali e altri organi. Questo è rilevante perché i miRNA sono noti per svolgere un ruolo importante nelle cellule del sangue nella nefropatia da IgA 2,6,7, ma non abbiamo studiato se il nostro metodo può essere utilizzato nelle cellule del sangue. In secondo luogo, la dimensione del campione dei nostri esperimenti potrebbe essere piccola. La dimensione del campione deve essere determinata in base al disegno dello studio, all'analisi statistica, al tempo richiesto e ai costi richiesti. Pertanto, ogni ricercatore deve determinare la dimensione del campione appropriata prima di iniziare questo esperimento. In terzo luogo, la gravità e il fenotipo della nefropatia da IgA nei topi HIGA possono variare tra gli individui9. Inoltre, il pregiudizio del sesso e dell'età non è stato completamente studiato. Si raccomanda di aggiungere immunoistochimica per confermare la gravità e il fenotipo della nefropatia da IgA, se necessario. Inoltre, si raccomanda di eseguire i metodi diversi dalla PCR, compresi i test di protezione da microarray, northern blotting e ribonucleasi, come necessario.
In conclusione, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per misurare i livelli di espressione dei miRNA nei reni di un modello murino IgA (topi HIGA).
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Sarah Williams, PhD, di Edanz Group (www.edanzediting.com) per aver curato una bozza di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
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