Summary
mikroRNA är involverade i patogenesen av IgA-nefropati. Vi har utvecklat en tillförlitlig metod för att detektera mikroRNA-uttrycksnivåer i njurarna hos en IgA-nefropatimusmodell (HIGA-möss). Denna nya metod kommer att underlätta för att kontrollera miRNAs engagemang i IgA-nefropati.
Abstract
Immunoglobulin A (IgA) nefropati är en typ av primär glomerulonefrit som kännetecknas av onormal avsättning av IgA, vilket leder till njursvikt i slutstadiet. Under de senaste åren har involvering av mikroRNA (miRNA) rapporterats i patogenesen av IgA-nefropati. Det finns dock ingen etablerad metod för profilering av miRNA i IgA-nefropati med hjälp av smådjursmodeller. Därför utvecklade vi en tillförlitlig metod för att analysera miRNA i njuren i en IgA-musmodell (HIGA-mus). Målet med detta protokoll är att detektera de förändrade uttrycksnivåerna av miRNA i njurarna hos HIGA-möss jämfört med nivåerna i njurarna hos kontrollmöss. I korthet består denna metod av fyra steg: 1) erhålla njurprover från HIGA-möss; 2) rening av totalt RNA från njurprover; 3) syntetisera komplementärt DNA från totalt RNA; och 4) kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR) av miRNA. Med hjälp av denna metod upptäckte vi framgångsrikt uttrycksnivåerna för flera miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p och miR-21-5p) i njurarna hos HIGA-möss. Denna nya metod kan tillämpas på andra studier som profilerar miRNA i IgA-nefropati.
Introduction
Immunoglobulin A (IgA) nefropati är en typ av primär glomerulonefrit som kännetecknas av onormal avsättning av IgA i den renala glomerulära mesangialregionen 1,2. Det är den vanligaste av de primära glomerulonefrit och leder till njursvikt i slutstadiet hos 20% -40% av patienterna2. Orsaken är fortfarande okänd men ihållande slemhinneinfektion har varit inblandad 1,3. Kortikosteroider, immunsuppressiva medel och renin-angiotensinsystemhämmare har föreslagits som terapeutiska metoder1,3, men har inte helt fastställts3. Därför krävs ytterligare forskning för att klargöra etiologin och terapeutiska metoder för behandling av IgA-nefropati.
mikroRNA (miRNA) är små, icke-kodande RNA som spelar en viktig roll för att reglera genuttryck 4,5. miRNA rapporteras vara involverade i patogenesen av olika sjukdomar, och vissa har identifierats som sjukdomsbiomarkörer och terapeutiska medel 4,5. Under de senaste åren har ett samband mellan miRNA och patogenesen av IgA-nefropati också rapporterats 2,6,7. Till exempel visade sig miR-148b vara involverad i strukturella abnormiteter av IgA hos patienter med IgA-nefropati 2,6,7, medan miR-148b och let-7b dokumenterades som nya biomarkörer för att detektera IgA-nefropati7. Även om förståelse av effekterna av miRNA på IgA-nefropati kan hjälpa till att ytterligare belysa etiologi och behandling 2, har standardmetoder för profilering av miRNA i IgA-nefropati med hjälp av smådjursmodeller ännu inte fastställts2.
Vi utvecklade häri en enkel och tillförlitlig metod för att mäta miRNA-uttrycksnivåer i njurarna hos en IgA-nefropatimusmodell (HIGA-möss). HIGA-musen är en karakteristisk ddY-stam som visar en särskilt hög nivå av serum-IgA och onormal avsättning av IgA i njurglomeruli 8,9,10,11. Därför kan HIGA-möss användas som en IgA-nefropati mus modell 8,9,10,11. Vår metod består av fyra huvudsteg: först, kirurgiskt erhållande av njurprover från HIGA-möss; för det andra, homogenisering av prover och rening av totalt RNA med användning av en kiseldioxidmembranbaserad spinnkolonn; för det tredje, syntetisera komplementärt DNA (cDNA) från totalt RNA med användning av omvänd transkription; och för det fjärde detektering av expressionsnivåerna av miRNA genom kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR). Motiveringen för denna metod och resultatens tillförlitlighet baseras på tidigare rapporter12,13. Vi visar att detta är en användbar teknik för att noggrant mäta miRNA-uttrycksnivåer i en IgA-nefropati-musmodell, och att den kan användas för att underlätta framtida forskning om miRNA i IgA-nefropati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök godkändes av djuretikkommittén vid Jichi Medical University och följer riktlinjerna för användning och vård av försöksdjur från Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Få njurprover från HIGA-möss
OBS: HIGA-möss visar en stabil fenotyp av IgA-nefropati efter 25 veckors ålder 8,9,10,11. Balb/c-möss bör väljas som kontrollgrupp 8,9,10,11. 25 veckor gamla kvinnliga HIGA-möss (n = 10) och 25 veckor gamla kvinnliga Balb/c-möss (n = 10) erhölls. Det är nödvändigt att bestämma antalet möss som krävs för experiment i förväg. Detta steg kräver cirka 7–8 timmar för en provstorlek på 10 HIGA-möss och 10 Balb/c-möss.
- Förbered dessa föremål: HIGA-möss (25 veckor gamla, kvinnliga), Balb / c-möss (25 veckor gamla, kvinnliga), inhalationsanestesiapparat, isofluran, korkplåt, stift, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), injektionssprutor, nålar, kirurgisk sax och pincett.
- Bedöva en HIGA-mus med 4% -5% isofluran med inhalationsanestesiapparat och montera den i dorsalläge på korkarket med stift. Justera koncentrationen av isofluran till 2–3 % som underhållsdos efter induktion av anestesi.
OBS: Anestesidjupet upprätthålls på en nivå där smärtan i samband med det invasiva förfarandet elimineras fullständigt. I synnerhet bör isoflurankoncentrationen justeras till 4-5 % vid excision av vävnader såsom bröstkorgen. Hårborttagning och ögonsalva är inte nödvändiga. Det är inte nödvändigt att montera musen på en värmepanna om proceduren kan utföras snabbt. - Gör ett 3-4 cm mittlinjesnitt av musens bukvägg med kirurgisk sax och pincett och identifiera noggrant båda sidor av njuren.
- Skär revbenen och membranet med kirurgisk sax och pincett för att exponera hjärtat. Efter snittning av höger förmak, injicera PBS i vänster kammare tills njurfärgen ändras till blekgul (denna procedur innebär att hela musens kropp perfuseras med PBS.)
- Skär njurartären, njurvenen och urinledaren och ta bort njurarna. Dela njuren i 30 mg bitar för användning i nästa steg.
OBS: Patologin för IgA-nefropati involverar huvudsakligen glomerulus i njurbarken (yttre delen av njuren). Även om det är svårt att makroskopiskt och fullständigt skilja cortex och medulla, är det önskvärt att huvudsakligen samla den yttre delen av njurarna. Dessa prover kan förvaras vid –80 °C i flera månader.
2. Rening av totalt RNA från njurprover
OBS: I detta steg används kommersiellt tillgängligt miRNA-isoleringssats för extraktion av totalt RNA. Dessutom används biopolymer-strimling spinnkolonn. Se Materialförteckning för ytterligare information. miRNA-isoleringssats innehåller en kiseldioxidmembranbaserad spinnkolonn, fenol/guanidinbaserade lysreagens, guanidin/etanoltvättbuffert (tvättbuffert 1), etanoltvättbuffert (tvättbuffert 2) och nukleasfritt vatten. Detta steg kräver cirka 3 timmar för en provstorlek på 10 HIGA-möss och 10 kontrollmöss.
- Förbered följande föremål: 1,5 eller 2,0 ml uppsamlingsrör, 100% etanol, kloroform, kiselhomogenisator, mikropipetter, pipettspetsar, centrifug, biopolymerfragmenteringsspinnkolonn, kiselmembranbaserad spinnkolonn, fenol / guanidinbaserade lysreagens, guanidin / etanoltvättbuffert (tvättbuffert 1), etanoltvättbuffert (tvättbuffert 2) och nukleasfritt vatten.
- Homogenisera 30 mg njurprover med en homogenisator av kisel och 700 μl av det fenol-/guanidinbaserade lysreagenset vid rumstemperatur.
OBS: MiRNA i provet är sårbara tills de har utsatts för fenol / guanidinbaserat lysreagens så dessa steg bör utföras omedelbart. - Överför lysatet till spinnkolonnen med biopolymerfragmentering och centrifugera det vid 15 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 140 μl kloroform till filtratet och blanda kraftigt i 15 s. Låt verka i 2–3 minuter och centrifugera sedan vid 12 000 x g vid 4 °C i 15 minuter.
- Överför försiktigt den genomskinliga supernatanten utan att vidröra mellanlagret till ett nytt uppsamlingsrör och tillsätt den bestämda volymen (se nedan) av 100% etanol. Virvel för 5 s.
OBS: 100% etanol vid 1,5x volymen av den erhållna supernatanten krävs. - Överför provet (övre gräns 700 μl) till en kiseldioxidmembranbaserad spinnkolonn och centrifugera provet vid rumstemperatur i 15 s vid 8 000 x g. Kassera filtratet efter centrifugering.
- Tillsätt 700 μl tvättbuffert 1 till den kiselmembranbaserade centrifugeringskolonnen och centrifugera kolonnen vid rumstemperatur i 15 s vid 8 000 x g. Kassera filtratet efter centrifugering.
- Tillsätt 500 μl tvättbuffert 2 till den kiseldioxidmembranbaserade centrifugeringskolonnen och centrifugera den vid rumstemperatur i 15 s vid 8 000 x g. Kassera filtratet efter centrifugering.
- Tillsätt 500 μl tvättbuffert 2 till den kiseldioxidmembranbaserade centrifugeringskolonnen och centrifugera den vid rumstemperatur i 15 s vid 8 000 x g. Kassera filtratet efter centrifugering.
- Centrifugera den kiseldioxidmembranbaserade spinnkolonnen igen utan att tillsätta något för att avlägsna ytterligare etanol, vid 15 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur. Kasta filtratet efter centrifugering.
- Byt röret som är fäst vid centrifugeringskolonnen till ett nytt uppsamlingsrör.
- Tillsätt 30 μl nukleasfritt vatten till den kiseldioxidmembranbaserade spinnkolonnen och centrifugera den vid 8 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur.
OBS: Den resulterande 30 μL-lösningen innehåller en hög koncentration av totalt RNA. Detta prov kan förvaras vid –80 °C i flera månader.
3. Syntes av cDNA från totalt RNA
OBS: I detta steg används en kommersiellt tillgänglig omvänd transkriptionssats. Se Materialförteckning för ytterligare information. Detta kit innehåller nukleinsyrablandning, omvänd transkriptasblandning och buffert. Denna procedur måste utföras på is för att förhindra reaktionens framsteg. Detta steg kräver cirka 3 timmar för en provstorlek på 10 HIGA-möss och 10 kontrollmöss.
- Förbered följande föremål: 1,5 ml uppsamlingsrör, åtta brunnsrör, mikropipetter, pipettspetsar, spektrofotometer, nukleasfritt vatten, is, nukleinsyrablandning, omvänd transkriptasblandning, buffert och termisk cykler.
- Mät koncentrationen av totalt RNA med hjälp av en spektrofotometer. Beräkna sedan den erforderliga volymen nukleasfritt vatten så att 12 μL innehåller 1 μg totalt RNA.
- Bered en masterblandning med följande innehåll: 2,0 μL nukleinsyrablandning, 2,0 μL omvänd transkriptasblandning och 4,0 μL buffert till totalt 8,0 μL per prov.
- Tillsätt 8 μL av masterblandningen till varje brunn med åtta brunnsrör.
- Utspädd total RNA i volymen nukleasfritt vatten beräknat i 3.2. Tillsätt sedan 12 μL av den totala RNA-lösningen (innehållande 1 μg totalt RNA) till varje brunn med åtta brunnsrör.
- Inkubera provet i 8 brunnsrör vid 37 °C i 60 minuter med hjälp av termocyklern. Inkubera sedan vid 95 °C i 5 minuter med hjälp av termocykeln.
OBS: Lösningen efter inkubation innehåller en hög koncentration av cDNA. - Överför denna lösning till ett 1,5 ml rör och tillsätt 200 μL nukleasfritt vatten.
OBS: Den resulterande lösningen på 200 μL kan användas för qRT-PCR som en mall för cDNA. Detta prov kan förvaras vid –80 °C i cirka 1 år.
4. qRT-PCR av miRNA
OBS: I detta steg används ett kommersiellt tillgängligt PCR-kit. Se Materialförteckning för ytterligare information. Detta kit innehåller PCR-blandning, universell primer och nukleasfritt vatten. Proverna bör beredas i två exemplar, och resultatens noggrannhet bör beaktas i varje enskilt fall. Uttrycksnivåer av miRNA kvantifieras med ΔΔCT-metoden. Detta steg kräver cirka 4 timmar för en provstorlek på 10 HIGA-möss och 10 kontrollmöss.
- Förbered följande föremål: 1,5 ml uppsamlingsrör, reaktionsplatta med 96 brunnar, självhäftande film för reaktionsplattan med 96 brunnar, mikropipetter, pipettspetsar, PCR-blandning, universell primer, nukleasfritt vatten, miRNA-specifika primrar och ett PCR-instrument i realtid.
- Förbered masterblandningen med följande innehåll: 12,5 μL PCR-blandning, 2,5 μL universalprimer, 1,25 μL 5 μM miRNA-specifik primer och 6,25 μL nukleasfritt vatten för varje brunn.
OBS: I denna analys användes primrar specifika för miRNA [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p och miR-21-5p]. RNU6-2 användes som en endogen kontroll14. - Tillsätt 22,5 μL av masterblandningen till varje brunn på reaktionsplattan med 96 brunnar.
- Tillsätt 2,5 μL cDNA som beretts i steg 3.7 till den enskilda brunnen på 96-brunnsplattan.
- Täck reaktionsplattan med 96 brunnar med vidhäftningsfilm och centrifugera sedan vid 1 000 x g i 30 sekunder.
- Kör PCR-instrumentet i realtid. Programmera PCR-instrumentet enligt följande: inledande aktivering vid 95 °C i 15 minuter, därefter 40 denatureringscykler vid 94 °C i 15 sekunder, glödgning vid 55 °C i 30 sekunder och förlängning vid 70 °C i 30 sekunder.
- Kvantifiera genuttryck med ΔΔCT-metoden. Relativa uttrycksnivåer bestäms som 2–ΔΔCT.
OBS: Onormala PCR-förstärkningskurvor bör övervägas för uteslutning från resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi undersökte uttrycksnivåerna av miRNA i njurarna hos HIGA-möss (n = 10). Detta resultat erhölls helt baserat på det beskrivna protokollet. Njurarna hos Balb/c-möss valdes som kontroll (n=10). I båda grupperna valdes 25 veckor i åldern. Endast kvinnliga HIGA-möss var tillgängliga från leverantören. Uttrycksnivåerna för tre miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p och miR-21-5p; Figur 1) upptäcktes, som tidigare rapporterats vara associerade med IgA-nefropati15,16. Relativa miRNA-uttrycksnivåer för de två grupperna jämfördes med hjälp av ett t-test, där P < 0,05 var statistiskt signifikant. miR-155-5p uttrycktes vid 3,3 gånger högre nivåer i HIGA-gruppen jämfört med kontrollgruppen (P < 0,001), medan miR-21-5p uttrycktes vid 1,58 gånger högre nivåer i HIGA-gruppen (P = 0,007). miR-146a-5p-uttrycket skilde sig inte signifikant mellan de två grupperna.
Figur 1: Uttrycksnivåer av miRNA i njurarna hos HIGA-möss. qRT-PCR bestämde de relativa uttrycksnivåerna för miR-155-5p, miR-146a-5p och miR-21-5p hos HIGA-möss (n = 10) och Balb/c-möss (n = 10). Relativa uttrycksnivåer visas som medelvärden och standardfel. (A) miR-155-5p-uttrycket var 3,3 gånger högre i HIGA-gruppen (P < 0,001). (B) miR-146a-5p-uttrycket skilde sig inte signifikant mellan de två grupperna. (C) miR-21-5p-uttrycket var 1,58 gånger högre i HIGA-gruppen (P = 0,007). kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion med omvänd transkription (qRT-PCR); mikroRNA (miRNA); inte signifikant (NS); *, s <0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi kunde mäta uttrycksnivåerna av miRNA i njurarna hos en IgA-nefropatimusmodell (HIGA-möss) med hjälp av denna nya metod. IgA-nefropati är en oförklarlig sjukdom som behöver ytterligare forskning för att klargöra dess etiologi och terapeutiska mål 1,3. Att få mänskliga njurprover är dock mycket invasivt. Denna nya teknik är fördelaktig eftersom den möjliggör studier av IgA-nefropati med hjälp av små djur och bör underlätta framtida forskning om IgA-nefropati och miRNA. I en framtida studie kan denna metod tillämpas på studier av nya miRNA för behandling av IgA-nefropati. Artificiell modulering av miRNA i HIGA-möss kan påverka fenotypen av IgA-nefropati. I så fall kan denna metod vara användbar för att verifiera förändringarna av miRNA. Denna metod är inte avsedd för analys av miRNA i serum, men det kan vara möjligt att använda den för detta genom att modifiera protokollet.
Motiveringen för denna metod bygger på tidigare rapporter. Vi använde biopolymerfragmenterande spinnkolonner för att störa biopolymerer i provet, vilket tidigare har visat sig vara en effektiv teknik12. Tidigare rapporter har också visat noggrannheten i att syntetisera cDNA från totalt RNA med omvänd transkription och utföra PCR med det beredda cDNA som mall13. Som ett kritiskt steg i denna metod är utvärdering av PCR-resultaten viktigt. Det är nödvändigt att utesluta onormala förstärkningskurvor från resultaten. Dessutom bör förändringar i endogena kontroller övervägas om stabila resultat inte uppnås14.
Ett stort problem som kan uppstå med denna metod är det onormalt låga uttrycket av miRNA. miRNA är mycket nedbrytbara föreningar så metoden bör utföras snabbt. Dessutom måste effekterna av ribonukleas (RNase) i experimentmiljön elimineras. Forskare bör alltid vara medvetna om förekomsten av RNas i hud och hår17. Det är nödvändigt att bära engångshandskar, masker och hårlock för experiment. Dessutom måste laboratorieutrustning som mikropipetter, pipettspetsar och uppsamlingsrör rengöras för att säkerställa frånvaron av RNas17. Avaktivering av RNas med hjälp av en autoklav bör utföras vid behov17. Annars bör forskare använda RNase-fria certifierade objekt17. Alla prover ska förvaras korrekt under rekommenderade förhållanden för att minska risken för RNas-kontaminering.
Vår metod har tre viktiga begränsningar. Den första är att vi inte visade om det kan tillämpas på andra djur och andra organ. Detta är relevant eftersom miRNA är kända för att spela en viktig roll i blodceller vid IgA-nefropati 2,6,7, men vi undersökte inte om vår metod kan användas i blodceller. För det andra kan provstorleken på våra experiment vara liten. Provstorleken bör bestämmas beroende på studiedesign, statistisk analys, erforderlig tid och nödvändiga kostnader. Därför måste varje forskare bestämma lämplig provstorlek innan detta experiment påbörjas. För det tredje kan svårighetsgraden och fenotypen av IgA-nefropati hos HIGA-möss variera mellan individer9. Dessutom har bias av kön och ålder inte undersökts fullständigt. Det rekommenderas att tillsätta immunhistokemi för att bekräfta svårighetsgraden och fenotypen av IgA-nefropati, om det behövs. Dessutom rekommenderas andra metoder än PCR, inklusive microarray, northern blotting och ribonukleasskyddsanalyser, att utföra vid behov.
Sammanfattningsvis utvecklade vi en tillförlitlig metod för att mäta uttrycksnivåerna av miRNA i njurarna i en IgA-musmodell (HIGA-möss).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Sarah Williams, PhD, från Edanz Group (www.edanzediting.com) för att redigera ett utkast till detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N.
- Szeto, C. C., Li, P. K.
- Wyatt, R. J., Julian, B. A.
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).
