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Developmental Biology

현상학 모니터링, 손 오염, 형광 현미경 검사법 및 분자 지노티핑에 의한 일본 매화의 수분 요구 사항 수립

Published: November 9, 2020 doi: 10.3791/61897
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza), Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX), Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있는데, 이는 형광 현미경검사법에 따른 꽃가루 관의 현장 및 실험실 오염물질 및 관찰과 PCR에 의한 S-유전자형 식별 및 수분제 선택을 위한 꽃의 모니터링을 결합한 것입니다.

Abstract

일반적으로 재배되는 일본 매실 품종은 원래 프룬누스 살리시나와 다른 프룬스 종 사이의 십자가에서 파생된 상호 특이적 하이브리드입니다. 대부분의 하이브리드는 여러 개의 알렐을 포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자체 비호환성을 나타낸다. 대부분의 재배 하이브리드는 자체 호환되지 않으며 꽃을 비옥하게하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다. 일본 매화의 수분 요건을 확립하는 것은 알려지지 않은 수분 요건을 가진 새로운 품종의 수가 많기 때문에 점점 더 중요해지고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자가(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 수작업 오염에 의해 결정되며, 그 다음으로 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 신장을 모니터링하고 현장에서 과일 성숙을 모니터링합니다. 수분화 품종의 선택은 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 현장에서의 개화 시간 모니터링을 결합하여 평가된다. 품종의 수분 요구 사항을 알면 새로운 과수원 설계를 위한 품종 의 선택이 가능하고 확립된 과수원의 수분 결핍과 관련된 생산성 문제를 조기에 감지할 수 있습니다.

Introduction

일본 매화(프룬스 살리시나 린들)는 중국1이원산지입니다. 19세기에 일본에서 미국으로 이 작물이 도입되어 다른 북미 디플로이드 자두2와교차했습니다. 20세기에, 이러한 하이브리드의 일부는 전 세계 온대 지역으로 확산되었다. 요즘에는 "일본 매실"이라는 용어는 원래 P. 살리시나 사이의 십자가에서 파생된 광범위한 상호 특이적 하이브리드를 말하며, 최대 15개의 다른 디플리드 Prunus spp.3,4,5.

일본 매화는 Rosaceae 가족의 다른 종과 마찬가지로 여러알렐을포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성(GSI)을 전시합니다. S-메뚜기는 피스틸로 발현된 리보누클레스(S-RNase)와 꽃가루 곡물7에서발현된 F박스 단백질(SFB)을 인코딩하는 두 개의 유전자를 함유하고 있다. 자가비호환성 반응에서, 꽃가루 곡물(haploid)으로 발현된 S-allele이 피슬틸(diploid)에 발현된 두 가지 중 하나와 동일할 때, 스타일 전반에 걸친 꽃가루 관RNA의 성장은 S-RNase8의작용에 의해 꽃가루 관 RNA의 저하로 인해 체포된다. 이 과정은 배란에서 여성 게임 토피의 수정을 방지하기 때문에, GSI는 품종 사이의 횡단을 촉진.

일부 일본 매실 품종은 자기 호환이지만, 현재 재배 된 대부분의 품종은 자기 호환되지 않으며, 자신의 꽃을 수정하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다3. 아몬드9,살구10,11,12 및 달콤한 체리13과같은 프루누스 속의 돌 과일 종에서는 품종의 수분 요구 사항을 다른 접근법에 의해 확립 할 수 있습니다. 자가(in)호환성은 현장에서 꽃의 자가 수분및 과일 세트의 후속 모니터링에 의해 결정될 수 있으며, 또는 실험실에서 제어된 조건에서 반 생체 자체 질립및 현미경14,15,16,17,18의 꽃가루 튜브 관찰에 의해 결정될 수있다. . 품종 간의 비호환성 관계는 잠재적 인 수분화 품종의 꽃가루를 사용하여 필드 또는 실험실에서 교차 오염에 의해 결정될 수 있으며, PCR 분석에 의해 각 품종의 S-alleles의 식별에 의해 결정될 수있다14,15,16,20,21,22 . 달콤한 체리 나 아몬드와 같은 종에서, 자체 (in)호환성은 또한 아몬드23에서달콤한 체리13 또는 Sf에서 S4'로 자기 호환성에 관련된 특정 S 알레일의 식별에 의해 평가 될 수있다.

주요 생산국의 여러 매실 사육 프로그램은 알 수없는 수분 요구 사항을 가진 새로운 품종2,14의숫자를 발표하고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자기(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 자체 오염에 의해 결정되며, 그 다음에형광 현미경 검사의 꽃가루 튜브를 관찰합니다. 수분화 품종의 선택은 현장에서 꽃 시간의 모니터링과 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별을 결합합니다.

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Protocol

1. 현장에서 수분 수분

  1. 꽃가루 추출
    1. BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면 꽃가루를 얻으려면 스테이지 D24에서꽃봉오리를 수집하십시오.
      참고: 다른 가지각선 종보다 일본 매화에서는 꽃봉오리가 더 적게 생산되기 때문에 꽃봉오리가 더 많이 필요합니다.
    2. 플라스틱 메쉬(2mm x 2mm 모공 크기)를 사용하여 anther를 제거하고 실온에서 24시간 동안 종이에 놓아 주면 안소 침착이 가능합니다.
    3. 꽃가루 곡물을 미세 한 메쉬 (0.26 mm x 0.26 mm 모공 크기)를 체질하고 사용할 때까지 4 °C의 캡이있는 10 mL 유리 튜브에 보존하십시오.
  2. 꽃의 수분
    1. 꽃의 10%~20%가 열려 있을 때 여러 가지를 선택하고 레이블을 지정합니다. BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면, 열린 꽃과 어린 싹을 제거하고 스테이지 D24에서꽃 봉오리만 남기고 있습니다.
    2. 손톱이나 핀셋으로 치료당 800~1,000개의 꽃봉오리꽃잎, 세팔, 창자들을 제거합니다.
    3. 손은 방출 후 24 h의 미세 한 페인트 브러시의 도움으로 피질을 수분합니다. 같은 품종의 꽃가루와 피슬의 절반을 포함하는 일부 가지, 대조군으로 다른 품종에서 호환 꽃가루와 다른 절반. 다른 품종의 꽃가루 곡물로 손가락 끝이나 페인트 브러시를 오염시키지 않도록주의하십시오.
    4. 꽃의 주간 수를 기록하고 과일 드롭 패턴을 특성화하고 각 수분 처리에 설정 된 최종 과일을 정량화하기 위해 과일을 개발.
  3. 현장에서 의 추가 수분
    1. 첫 번째 꽃이 열리기 며칠 전에 0.8mm 메쉬 케이지에 선택된 나무를 둘러싸서 수분 곤충이 도착하는 것을 피하십시오.
    2. 10%-20%의 꽃이 열리면 수분 처리당 여러 가지를 선택하고 라벨을 부착하여 치료당 1,000-1,500개의 꽃을 남깁니다.
    3. 다음 날, 꽃이 열리면 해당 꽃가루 (자체 수분을위한 동일한 품종의 꽃가루및 교차 수분 제어와 같은 품종의 꽃가루)와 페인트 브러시의 도움으로 각 꽃을 수분하십시오.
    4. 모든 꽃이 열릴 때까지 격일로 수분공급합니다.
    5. 꽃의 주간 수를 기록하고 과일 드롭 패턴을 특성화하고 각 수분 처리에 설정 최종 과일을 정량화하기 위해 수확하기 위해 마취에서 과일을 개발.

2. 실험실에서 의 수중 오염

  1. BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면 스테이지 D24에서50~100개의 꽃을 수집합니다.
  2. 실험실에서 치료 당 30 개의 꽃을 방출합니다 (자기 및 교차 수분).
    참고: 액슬에 손상을 방지하기 위해 신중하게 조광을 진행해야 합니다.
  3. 젖은 꽃집 거품 (각 수분 처리에 대한 거품의 한 조각)의 조각에 배치하기 전에 각 꽃 페디셀 수중의 바닥에 신선한 컷을 합니다.
  4. 손 은 이전에 수집 된 꽃가루와 미세 페인트 브러시를 사용하여 나중에 각 피스틸 24 시간 후 수분 (섹션 1.1 참조). 같은 품종의 꽃가루로 한 세트의 피스틸을 수분하고, 다른 세트는 호환되는 품종의 꽃가루를 대조합니다.
  5. 실온에서 수분 후 72h의 수분된 피스틸을 둡니다. 꽃 거품은 지속적으로 물로 젖어야합니다.
  6. 4°C에서 적어도 24시간 동안 에탄올/아세트산(3:1)의 고정 용액에서 피스틸을 수정합니다. 고정을 75%의 에탄올로 대체합니다. 샘플은27를사용할 때까지 4 °C에서이 용액에서 보존 될 수 있습니다.
    참고: 샘플이 솔루션에 완전히 잠겨 있는지 확인합니다.

3. 현미경 관찰

  1. 체외 꽃가루 발아의 평가
    1. 꽃가루 발아 매체를 정교하게 하려면 250mL의 증류수에 자당 25g을 녹인 다음 질산 칼슘 0.075 g [Ca(NO3)2]및 0.075 g의 붕산(H 3 BO3)을첨가하십시오.
    2. 용액에 2 g의 한고를 넣고 완전히 용해 될 때까지혼합하십시오 28.
    3. 매체를 살균하려면 120°C에서 20분 동안 자동 복제합니다. 매체를 냉각시키고 고화하기 전에 멸균 페트리 접시 당 3mL(55mm x 12mm)를 멸균 라미나르 플로우 후드에 분배합니다. 중간 정도의 고형화 후, 사용전까지 알루미늄 호일로 싸인 페트리 접시를 4°C로 보존하십시오.
    4. 이전에 두 페트리 접시에 제어 된 꽃가루 기증자로 사용 각 품종의 꽃가루를 확산하고 24 시간 동안 25 ° C에서 배양.
      참고: 접종된 배양 매체는 즉시 현미경 검사로 관찰하거나 사용전까지 -20°C에 저장될 수 있다. 이를 위해 페트리 요리는 현미경 관찰 전에 냉장고24h로 변경해야합니다.
    5. 꽃가루 곡물을 관찰하려면 칼로오스얼룩이 1 % (v /v) 애니라인 블루 용액을 준비하십시오. 먼저, 0.1N칼륨 인산염 삼각염(K3PO4)용액을 1,000mL에서K3PO4의 7.97g을 용해하여 준비한다. 1% (v/v) 애니라인 블루 용액을 정교하게 하기 위해 0.1 N K3PO4의100mL에서 애니라인 블루 1mL를 녹입니다.
    6. 각 페트리 접시에 2-3 방울의 애니라인 블루 용액을 추가하고 엑시터 필터 BP340-390 및 배리어 필터 LP425를 사용하여 UV 에피플루오렌스 현미경으로 5 분 후에 관찰하십시오. 플레이트 당 세 개의 필드에 실행 가능한 불가가 곡물을 계산, 각 필드는 포함 100-200 꽃가루 곡물, 각 품종에 대한 두 페트리 요리에.
  2. 꽃가루 튜브 성장
    1. 고정 된 피스틸을 증류수로 3 배 (각각 1 회, 총 3 시간)로 헹구고 24 시간 동안 4 ° C에서 5 % (w / v) 나트륨 황피염 (Na2SO3)으로이송합니다. 이 솔루션을 준비하려면 증류수 100mL에 설파이트 나트륨 5g을 녹입니다.
    2. 조직을 부드럽게 하기 위해 5%(w/v) 나트륨에서 8분 동안 120°C에서 피스트를 오토클랩합니다.
    3. 스쿼시 연화 된 피스틸은 1 % (v / v) 아일린 블루 용액을 슬라이드의 커버 유리 아래에 떨어뜨려 칼로스를 얼룩지게합니다.
    4. 엑시터 필터 BP340-390 및 장벽 필터 LP425를 사용하여 UV 에피플루오렌스와 현미경으로 스타일을 따라 꽃가루 튜브 성장을 관찰한다.

4. 비호환성 관계 결정

  1. 잎에서 DNA 추출
    1. DNA를 추출하려면, 필드에 있는 각 품종의 3-4 개의 젊은 잎을 수집, 바람직하게는 봄에.
      참고 : DNA는 성숙한 잎에서 추출 할 수 있지만 어린 잎의 DNA는 페놀 화합물이 적습니다.
    2. 상용 키트를 사용하여 DNA를 분리하고 제공된 프로토콜 키트를 따릅니다(재료 표참조).
    3. UV-Vis 미세볼륨 분광계에서 DNA 농도를 정량화하고 260 nm에서 각 샘플의 DNA 품질을 평가합니다. DNA 농도를 10 ng/μL로 조정합니다.
  2. 단편 증폭을 위한 PCR 조건
    1. 라벨 0.2 mL PCR 튜브 및 캡.
    2. 표 1에 따라 PCR 시약을 준비하고 얼음 위에 해동시키십시오.
    3. 반응당 16μL의 부피를 고려하여 반응 횟수와 초과 10%에 따라 각 프라이머 쌍의 마스터 믹스를 1.5mL 마이크로튜브에 설정합니다. 표 1에서 주문 후 시약을 추가하고 철저히 섞습니다.
    4. 각 0.2 mL PCR 튜브에 마스터 믹스의 Aliquot 16 μL은 DNA 템플릿4 μL 또는 멸균 증류수 4 μL을 음의 대조군(C-)으로 함유한다. 알려진 유전자형을 가진 품종의 DNA를 긍정적 인 대조군으로 사용하십시오. 부드럽게 섞고, 반응 튜브를 캡으로 닫고, 원심분리기를 30s에 2,000 x g로 닫고 반응 튜브의 하단에 있는 전체 부피를 수집합니다.
    5. 체온사이클러에 반응튜브를 배치하고 다음 온도 프로파일을 사용하여 PCR 프로그램을 설정: 94°C에서 3분, 94°C에서 1분의 35 사이클, 56°C에서 1분, 72°C에서 3분, 72°C에서 7분의 7분의 최종 단계를 설정한다.
  3. 단편 크기의 전기 전동 및 추정
    1. 1.7% (w/v) 아가로즈 미니 젤을 준비하려면 아가로즈 0.68 g와 1x TBE 버퍼 40mL을 100mL 에렌마이어 플라스크에 녹입니다. 끓는 것을 피하기 위해 전자레인지에서 600W 간격으로 가열하여 용액을 녹입니다.
    2. 용액이 벤치에 머무르면 식힌 다음 핵산 염색 용액의 3.5 μL을 추가하십시오.
    3. 젤 트레이를 주조 스탠드에 넣고 선택한 빗을 젤 몰드에 넣습니다. 각 PCR 제품 및 DNA 사다리에 대해 충분한 우물을 가져야 합니다.
    4. 아가로즈 용액을 젤 몰드에 붓고 중합될 때까지 식힙니다. 중합체 젤의 빗을 제거합니다. 젤의 표면을 덮을 수 있는 충분한 1x TBE 버퍼를 포함하는 수평 전기 전광 시스템에 젤을 놓습니다.
    5. DNA 분자량 사다리(1kb DNA 사다리)의 2μL로 첫 번째 및 마지막 우물을 적재합니다. 다른 우물에 PCR의 각 제품의 3 μL을 로드합니다. 챔버를 닫고 전원을 켜고 젤을 100 V에서 30 분 동안 실행합니다.
    6. 젤 문서화 시스템을 사용하여 UV 빛 아래에서 젤을 관찰하십시오. DNA 분자량 사다리를 사용하여 증폭된 단편의 크기를 결정하고 해당 알렐을 식별하기 위해 양성 대조군과 비교합니다.

5. 꽃 날짜 모니터링

  1. 서로 다른 년 동안 꽃에 각 품종의 다른 나무의 phenology를 모니터링할 수 있습니다. 꽃의 길이를 첫 번째 (약 5%)에서 마지막 열린 꽃 (약 95 %)까지 설정합니다. BBCH 스케일25,26의스테이지 65에 따르면 꽃의 50 % 이상이 F24단계에있을 때 만개한 것으로 간주됩니다.
  2. 호환 되는 품종의 꽃 날짜를 비교 하 고 매년 꽃 시간에 일치 하는 것을 결정 하려면, 몇 년에서 데이터와 꽃 시간의 달력을 정교 하 게.

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Representative Results

일본의 매화 꽃봉오리에는 1~3개의 꽃이 들어있는 꽃이 들어 있습니다. 다른 돌 과일 종에서와 마찬가지로, 각 꽃은 네 개의 소용돌이로 구성되어 있습니다 : 카펠, stamens, 꽃잎, 그리고 꽃의 기지에서 컵을 형성하는 융합되는 세팔. 꽃 구조는 다른 돌 과일보다 작으며, 소량의 꽃가루 곡물을 포함하는 stamens로 둘러싸인 짧고 깨지기 쉬운 피질이 있습니다. 만개시, 각 꽃의 꽃은 짧은 줄기에 분리 된 것처럼 보이며, 무신 전 날에 녹색 세팔로 둘러싸인 풍선을 형성하는 흰색 꽃잎 (스테이지 D, 57 BBCH)(그림1A)을보여 주었습니다. 꽃은 마취에서 완전히 열리며, 마취제와 피스틸 (단계 F, 65 BBCH)(그림2A)을보여 주습니다. 다른 온화한 Prunus spp.처럼, 꽃 봉오리 먼저 열고, 잎 싹 은 며칠 후 새싹. 이렇게 하면 꽃이 피는 나무가 많은 꽃을 보여주는 장관을 이루지만 잎은 없습니다.

일본 매화의 손 오염은 피스틸과 stamens가 거의 성숙하지만, 마취가 여전히 deisced되는 마취(그림 1A)에이전 풍선 단계에서 꽃의 수집을 필요로하지만, 마취제는 여전히 deisced. 이 단계는 꽃잎이 여전히 닫혀 있기 때문에 외부 꽃가루를 운반하는 곤충의 도착을 방지합니다. 꽃의 수는 다른 프루누스 종보다 훨씬 높지만, 그들 중 대부분 (85 %-95%)은 과일을 설정할 수 없습니다. 그 결과, 수분 실험을 위해 많은 수의 꽃을 사용하는 것이 필수적입니다. 해독되지 않은 멸신은 실험실에서 꽃에서 쉽게 분리되어 종이조각(도 1B)에확장될 수 있으며, 여기서 마취제는 실온에서 24시간 후에 분해되어 꽃가루 곡물(도1C)을나타내고 있다. 이어서, 꽃가루 곡물은 미세메쉬(도 1D)를통해 쉽게 체질되었고, 즉시 사용하거나 사용할 때까지 저장할 수 있었으며, 둘 다 필드(그림2A-D)및/또는 실험실 오염(도2E,F)에대해 모두 사용할 수 있었다.

에뮬레이션 후 수분꽃의 과일 방울 모니터링(도2A, B)또는 비액화 꽃의 보충 수분(도2C, D)은치료 간의 명확한 차이를 보였다. 대부분의 꽃은 두 치료모두에서 수분 후 2-3 주 떨어졌다. 모든 자가 수분된 꽃이 떨어졌다. 그러나, 보충 수분 처리에서 자가 수분꽃의 4%는 수확될 때까지 나무에 남아 있었으며, 이는 이 품종(루비로사)이 자기호환(도 3)으로작용한다는 것을 나타낸다. 대조군으로 사용되는 교차 수분 꽃의 행동은 치료마다 다양합니다. 수분 후 3주까지 추가 수분이 있는 교차 수분 꽃은 과일 세트의 7%를 차지했다. 그러나, 모든 수분화 된 꽃은 모든 자기 수분 꽃의 방울과 일치 떨어졌다.

실험실에서 손 의 질량의 경우, 피스틸은 각 꽃 페디셀 수중(그림 2E)의바닥에 신선한 절단 후 젖은 꽃집 거품에 배치하고 미세 브러시(도 2F)의도움으로 24 시간 후에 수분하였다. 자가 수분꽃에서, 자체 호환 품종은 검사된 대부분의 피스틸에서 스타일의 기초에 도달하는 꽃가루 튜브가 적어도 하나의 꽃가루 튜브를 보였으며, 자체 호환되지 않는 품종에서는 꽃가루 튜브 성장이 상부스타일(표 2)에서체포되었다.

체외 꽃가루 발아는 품종(표 3)사이에크게 달랐다. 꽃가루 알갱이의 20% 이상이 배양 배지에서 24h 이후의 길이보다 더 긴 꽃가루 튜브를 보였을 때 좋은 꽃가루 생존성을 고려하였다(도4A). 그러나, 꽃가루 곡물의 대부분이 발아하지 않았을 때(도 4B),품종은 수컷 멸균으로 간주되고 수분 공급제로 적합하지 않았다.

다른 Prunus에서와마찬가지로, 피질은 낙인, 스타일 및 난소의 세 가지 구조로 구성됩니다. 난소에는 두 개의 배란이 있으며, 그 중 적어도 하나는 열매를 맺기 위해 수정되어야 합니다. 수분 중에 꽃가루 곡물은 24시간(도4C)이내에 발아가 발생한 오명으로 옮겨집니다. 각 발아 꽃가루 곡물은 꽃가루 튜브를 생산, 이는 피질 구조를 통해 성장. 꽃가루 곡물이 피슬틸의 두 S 알레임 중 하나와 일치하는 S 알렐을 갖는 자가 호환 되지 않는 품종에서 꽃가루 튜브는 스타일의 상위 3 분의 1에서 성장을 멈췄습니다(도 4D),난소에 도착을 방지하고 후속 수정. 그러나, 꽃가루 곡물의 S 알렐레가 피슬틸의 것과 다르면, 꽃가루 관은 스타일(도 4E)을 통해 성장할 수 있고, 난소(도4F)에도달하고 난소를 비옥하게 한다.

PCR분석(표 1)은달콤한 체리와 일본 매화의 S-RNase의 보존 된 지역에서 프라이머를 사용하여 수행되었다(그림 5). 사용되는 프라이머 세트인 PruC2-PCER 및 PruT2-PCER(재료 표 참조)는 각 품종에서두 S-alleles의 크기를 결정할 수 있습니다. 증폭된 단편은 전기포고증에 의해 아가로즈 겔로 실행되었고, 7개의 다른 S-alleles(Sa,Sb, Sc, Se, Sf, Sf, Sf, Sk)는품종분석에서 확인되었다. 조각 크기는 PruC2-PCER(그림 5)를사용하여 393에서 1,580 bp 사이이고 PruT2-PCER를 사용하여 820에서 1,993 bp 사이입니다. 6개의 S-유전자형이확인되었다(SaSb, SbSc, SbSf, ScSh, SeSh, SfSk).

각 품종의 현상학은 대부분의 꽃이 단계 F, 단계 65 BBCH에있을 때 만개점을 고려, 4 년의 총 기간 동안 꽃 기간의 길이를 계산 할 수 있었다. 과수원 조건에서 꽃피는(도 6)은품종과 년 사이의 꽃 시간의 비교를 허용하고, 품종은 매년 꽃 시간에 일치하는 결정(그림 7).

Figure 1
그림 1: 일본 매화의 꽃가루 추출. (A)풍선 스테이지 D에서 꽃봉오리, 바지올리니에 따르면24,BBCH 규모의 스테이지 57. (B)꽃에서 해독되지 않은 마취제의 제거. (C)꽃가루 곡물을 보여주는 해독 된 마취제. (D)미세 메쉬를 사용하여 마취부로부터 꽃가루 곡물의 체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 수분 실험으로 일본 매화의 자체(in) 호환성을 결정합니다. 필드 폴리네이션:(A)일본 매화꽃, 무신론과 풍선 단계에서 꽃. (B)풍선 스테이지 D의 꽃, 바지올리니(24)24,단계 57 의 BBCH 스케일 에뮬레이션 후. (C)곤충의 도착을 피하기 위해 케이지 나무. (D)비액꽃의 추가 수분. 실험실 오염:(E)페디셀 수중의 기저에 잘라 서 젖은 거품에 놓인 꽃을 방출. (F)미세한 페인트 브러시로 피스틸의 수분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 다른 수분 처리에 의해 영향을 받는 일본 매화의 과일 드롭. 방출및비액화된 꽃의 자체 및 교차 수분. '루비로사'에서 수분 후 4주 동안 나무에 남은 꽃의 원래 수와 열매의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 일본 매화의 자수꽃에서 꽃가루 발아 및 꽃가루 튜브 성장. (A)체외 꽃가루 발아. (B)발아되지 않은 꽃가루 곡물 (화살표)은 시험관내. (C)낙인 표면에 꽃가루 곡물 발아. (D)꽃가루 튜브는 스타일의 상위 3 분의 1에서 체포. (E)꽃가루 튜브는 스타일을 따라 성장. (F)꽃가루 튜브는 스타일베이스에 있습니다. 스케일 바, 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 9개의 일본 매실 품종의 프라이머 세트 PruC2-PCER를 이용한 PCR 증폭. 7개의 S-Alleles(Sa,Sb, Sc, Se, Sf, Sh, Sk)및 6개의 S-유전자형(SaSb,SbSc, SbSf, ScSh, SeSh, SfSk)의식별). 비호환성 그룹(I.G.3),'포춘'(F), 'TC 선'(TS), '라로다'(LR), '퀸 로사(QR), 레드 보트'(RB), '골든 글로브'(GG), '켈시'(K), 네거티브 컨트롤(증류수) (C-), '잔지 선'(ZS), '라에티티'(Lt). 1 kb: 크기 표준. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 일본 매화의 현상학 모니터링. 다른 현상 단계에서 꽃과 두 개의 일본 매화 품종. 스테이지 C24,BBCH 스케일 스테이지 55(왼쪽) 및 스테이지 F24,BBCH 스케일 의 스테이지 65(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 4년 동안 일본 매화 품종 4개에서 꽃피는 시간. 첫 번째에서 마지막 열린 꽃까지의 기간. 노란 세포는 대부분의 꽃이 열리는 만개한 날을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시약 1반응당 부피(μL)
H2O 11.50
20mMgCl 2와 10X 버퍼 2.80
dNTP 믹스, 각각 10mM 0.80
프라이머 포워드 0.40
PruC2 (5'-CTATGGCCAAGTAATTCAAACC-3')40 또는
프루T2 (5'- TSTTSTTGSTTTTTTTTCTT-3')40
프라이머 역 0.40
PCER (5'-TGTGTGTTCCATTCCATTCGTTCCC-3')41
DNA 템플릿 4.00
타크 DNA 폴리머라제, 500 U 0.09
최종 볼륨 20.0

표 1: 이 프로토콜에 사용되는 반응 조건입니다.

품종(S- 유전자형) 검사된 피스틸 수 오명에 발아 꽃가루 곡물 (%) 꽃가루 튜브가 있는 피스틸은 스타일(%) 스타일의 기초에 꽃가루 튜브 (평균 번호) 셀프/크로스 호환성 반응
TC 선(SbSc)× 래리 앤(SbSh) 22 92.3 27 1.2 +
TC 태양(SbSc)× 블랙 앰버(SbSc) 10 74.8 0 0.0 -
TC 태양(SbSc)자기 수분 44 78.3 7 1.0 +
골든 매화(SbSc)× 블랙 스타(세스프) 11 64.7 36 1.5 +
골든 매화(SbSc)× TC 태양(SbSc) 11 98.4 0 0.0 -
골든 매화(ShSk)자기 수분 38 85.2 0 0.0 -

표 2: 꽃가루 발아 및 꽃가루 튜브 성장 은 자기 및 교차 꽃가루 후 두 개의 일본 매화 품종에 대한 스타일을 통해 성장. 검사 된 수분 이면 의 분모, 낙인에 발아 꽃가루 곡물의 비율, 스타일의 기초에 꽃가루 튜브와 피스티의 비율, 스타일의 기초에 꽃가루 튜브의 평균 수, 자기 또는 교차 호환 (-) 및 자기 또는 교차 호환 (+).

재배종 발아 (%) SD*
얼문 50 3.3
얼리퀸 30 4.2
엘도라도 10 1.3
프리어 (주) 52 2.0
골든 재팬 17 3.8
골든 플럼자 18 3.3
라로다 주 46 3.6
래리 앤 20 5.8
메슬리 (동음이의) 2 0.8
오웬 T 16 0.3
황금 시간대 20 3.3
로사 여왕 42 3.9
로얄 다이아몬드 19 2.2
산타 로사 36 2.0
TC 태양 49 3.1
*SD = 표준 편차

표 3: 일본 매실 품종 15종의 체외 꽃가루 발아비율. 6개의 복제의 ± SD를 의미합니다.

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Discussion

본원에 설명된 방법론은 일본 매실 품종의 수분 요건을 위해 필드 또는 실험실에서 제어된 오염물질에 의한 각 품종의 자체(in) 호환성을 결정하고, 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 성장의 후속 관찰을 요구한다. 비호환성 관계는 분자 지노티핑에 의한 S-alleles의 특성화에 의해 확립된다. 마지막으로, 수분 제의 선택은 매년 꽃에서 일치하는 그 품종을 검출하기 위해 모니터링 phenology에 의해 수행됩니다.

새로운 일본 매화형 품종에 수분 요건을 확립하는 것은 알려지지 않은 수분 요건을 가진 새로운 품종의 수가 많고 그 대부분이 자체호환3이기때문에 점점 더 중요해지고 있습니다. 본 원에 기재된 접근법은, 페네로지모니터링, 통제된 오염, 형광 현미경 및 분자 지피핑을 결합하여,품종(14)의수분 요건을 결정하는 데 유용함을 입증했다.

일본의 매실 하이브리드는 다른 Prunus 종에 사용되는 수분 요구 사항을 결정하기위한 단일 접근 방식의 사용을 방해하는 여러 가지 특수성을 보여줍니다. 첫째, 꽃은 작고 더 깨지기 쉬운3. 꽃가루 추출 및 취급은 다른 Prunus spp.12의것과 유사하지만, anthers가 꽃가루 곡물3의양이 적기 때문에 더 많은 수의 꽃을 수집할 필요가 있다. 루비로사와 같은 일부 품종에서는 이 기술이 배란변성을 유발하기 때문에 꽃의 방출을 사용할 수 없으며, 이는 자기 비호환성의 잘못된 진단을 초래할 수 있는꽃(21)의후속 낙하를 야기한다. 사육 을 위해, 여성 부모로 사용되는 민감한 품종에서 꽃 방출은 자손3의부족으로 이어질 수 있습니다.

꽃의 수는 과일 나무의 다른 종에 비해 훨씬 높지만, 과일 세트의 비율은 매우 낮은3. 이것은 필드 와 실험실 오염21,22모두에 대한 꽃의 높은 수를 사용할 필요가있다. 이 기술은 환경적 영향을 피하고 현장 실험보다 더 많은 품종의 분석을 허용하기 때문에, 수확 될 때까지 현장에서 수분 꽃을 모니터링하여 보다 자기 (에서) 호환성의 평가를 보다 더 정확하게 자체 (에서) 호환성의 평가를 허용한다. 그러나, 꽃 취급은 살구12와같은 다른 Prunus 종에 보다는 더 수고, 거품에 피스틸을 놓기 전에 수중페디셀을 절단할 필요가 있기 때문에. 더욱이, 일본 매실 하이브리드 간의 호환 꽃가루-피질 관계에서 꽃가루 관이 꽃3의 감소된 비율로 난소에 도달하기 때문에 다른 종에 비해현미경으로 더 많은 수의 피스틸을 분석해야 한다. 또한, 꽃가루관은 현미경하에서 검출하기가 더 어렵고, 스타일의 기지에 도달하는 튜브의 수는15,18,20,28,29,30,31,32,33,34로 낮습니다. . 꽃가루 튜브가 스타일의 기지에 도달하기 전에 꽃가루 튜브가 실험실 조건에서 특히 깨지기 쉽고 퇴화되는 품종에서 자체 (in)호환성은 현장 오염에 의해 평가되어야합니다.

꽃가루 생존능력의 평가는 수제 오염물질에 사용된 꽃가루가 적절한지 여부를 알 수 있으므로 저또는 null 발아 비율의 경우 자기 비호환성의 가능한 거짓 진단을 버릴 수 있습니다. 이 기술의 사용은 일본매화 품종21,22,35사이의 꽃가루 발아에 상당한 차이를보고했다. 더욱이, 이러한 접근법은 상업적 과수원및 사육 목적으로 십자가에서 꽃가루 기증자로서 남성 멸균 품종을 폐기하는 데 매우 중요한 남성 멸균22,36,37을검출하는 데에도 유용합니다.

품종 간의 비호환성 관계는 실험실 오염에 의한 자체(in) 호환성 평가에 사용되는 동일한 접근 방식을 사용하여 결정할 수 있지만, 그 기술은 이러한 목적을 위해 몇 가지 단점이 있습니다. 꽃피는 꽃기 동안만 수행 할 수 있으며, 실험실 근처에 배치 된 성인 나무가있는 컬렉션이나 과수원은 수명이 매우 짧은3,38입니다. 더욱이, 각 품종 쌍은 특정 교차 수분이 필요하기 때문에 매년 분석된 관계의 수는 낮습니다. 대안으로, PCR에 의한 S-alleles의 식별은 DNA가 어떤 식물 조직든지에서 추출될 수 있기 때문에 꽃을 요구하지 않습니다; 따라서 샘플을 수집할 수 있는 기간은 더 길어집니다. 더욱이, 즉시 사용해야 하는 꽃과 는 달리 잎이나 다른 식물 조직을 저장할 수 있으므로 분석은 봄에 며칠에 국한되지 않고 일년 내내 할 수 있습니다39. 프라이머 세트를 이용한 제2 S-RNase 인트론의 증폭에 의한 각 품종에 대한 두 개의 S-알레임의 식별은 PruC2-PCER 및 PruT2-PCER40,41 및 증폭된 조각의 크기의 후속 분석 아가로즈 겔 전기포레시스(20,21)를 해당 Gvars에 해당하는 집단으로 할당할 수 있도록 허용한다. ). 각 I.G.에는 동일한 두 개의 S-alleles가 있는 자체 호환되지 않는 품종이 포함되어 있으며, 따라서 상호 호환되지 않습니다. 다른 그룹의 품종, 적어도 하나의 다른 S-allele을 들고, 상호 호환됩니다.

이 기술은 아몬드42및 S4의Sf와 같은 특정 S-allele과 같은 특정 S-allele과 달콤한 체리43과같은 특정 S-allele과연관되어 있는 다른 프루누스 종에서 발생하는 일본 매실 품종에 대한 자체(in)호환성의 결정을 허용하지 않는다는 한계를 가지고 있다. 일부 S-alleles는처음에 Sb20,44, Se19, 20,44,S g45및 St46과같은 일본 매화의 자기 호환성과 관련이 있었다. 그러나, 후속 작품은 이러한 S-alleles14,20,21,22,47을운반하는 자가 호환 되지 않는품종을보고했다. 따라서, S-allele 시퀀싱의 추가 작업은 동일한 크기 또는 돌연변이의 상이한 색유전자가 Sb, Se, Sg또는 S t3로잘못 식별되었는지 여부를 명확히 하기 위해 일본 매화에서 요구된다. 한편, 일본 매화의 자체(in) 호환성 평가는 현장 또는 실험실-오염및 현장에서 과일 낙하의 후속 모니터링 또는 현미경하에서 꽃가루 관의 행동에 의해 분석되어야 한다.

PCR 분석에 의한 S-alleles의 식별은 품종3사이의 비호환성 관계를 확립하기에 적합한 것으로 나타났다. 그러나 적절한 수분제를 선택하려면, 개화 기간에 불일치가 발생하기 때문에, 몇 년 동안 각 지역의 각 품종의 개화 시간에 대한 데이터와 이 정보를 결합할 필요가 있으며, 몇 년 만에 발생하더라도수확14의현저한 감소와 과일 세트의 부족을 야기할 수 있다.

꽃 생물학과 품종 사이의 농업 적 행동에서 관찰 된 많은 차이는 현재 재배 된 모든 품종이 동일한 속의 다른 종과 원래 종 P. 살리시나 사이의 십자가에서 파생된 하이브리드이지만 다른 특성5,48을가진 그들의 기원과 관련이있을 수 있습니다. 이것은 다른 과일 종과 달리 수분 요구 사항을 결정하기 위해 다른 기술을 결합할 필요가있는 주된 이유일 수 있습니다. 각 품종의 수분 요구 사항을 알면 새로운 과수원 설계를 위한 품종의 적절한 선택이 가능하며, 확립된 과수원의 수분 부족과 관련된 생산 문제의 검출 및 해결을 가능하게 한다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y 알리멘타리아 (RFP2015-00015-00 및 RTA2017-00003-00);에 의해 투자되었습니다. 고비에르노 데 아라곤-유럽 사회 기금, 유럽 연합 (그루포 콘솔리다 A12-17R), 그리고 준타 드 엑스트레마두라 —폰도 유럽오 데 데사롤로 지역 (FEDER), 계획 지역 드 Investigación (IB16181), 그루포 드 Investigación (AGA001, GR1819). B.I. 게레로는 멕시코의 콘세조 나시오날 드 시엔시아 이 Tecnología (CONACYT, 471839)의 펠로우십에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744

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Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).

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