Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hele Mount farvning, visualisering og analyse af fungiform, circumvallate og gane smagsløg

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62126
Automatic Translation
1, 1
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

Summary

Dette papir beskriver metoder til vævsforberedelse, farvning og analyse af hele fungiform, circumvallate og gane smagsløg, der konsekvent giver hele og intakte smagsløg (herunder nervefibrene, der innerver dem) og opretholder forholdet mellem strukturer inden for smagsløg og den omgivende papilla.

Abstract

Smagsløg er samlinger af smagstransfremerende celler specialiseret til at opdage delmængder af kemiske stimuli i mundhulen. Disse transfremkaldende celler kommunikerer med nervefibre, der bærer disse oplysninger til hjernen. Fordi smagstransducingerende celler kontinuerligt dør og erstattes i hele voksenalderen, er smagsløgsmiljøet både komplekst og dynamisk, hvilket kræver detaljerede analyser af dets celletyper, deres placeringer og eventuelle fysiske relationer mellem dem. Detaljerede analyser er blevet begrænset af tungevævs heterogenitet og densitet, der har reduceret antistof permeabiliteten betydeligt. Disse forhindringer kræver sektionsprotokoller, der resulterer i opdeling af smagsløg på tværs af sektioner, så målinger kun tilnærmes, og cellerelationer går tabt. For at overvinde disse udfordringer indebærer de metoder, der er beskrevet heri, indsamling, billeddannelse og analyse af hele smagsløg og individuelle terminal arbors fra tre smagsområder: fungiform papillae, circumvallate papillae og ganen. Indsamling af hele smagsløg reducerer bias og teknisk variation og kan bruges til at rapportere absolutte tal for funktioner, herunder smagsløg volumen, total smag-bud innervation, transducing-celle tæller, og morfologi af individuelle terminal arbors. For at demonstrere fordelene ved denne metode giver dette papir sammenligninger af smagsløg og innervation-mængder mellem fungiform og circumvallate smagsløg ved hjælp af en generel smagsløgsmarkør og en etiket til alle smagsfibre. Der findes også en arbejdsgang for brug af sparsom-celle genetisk mærkning af smagsnuroner (med mærkede delmængder af smagstransfremkaldende celler). Denne arbejdsgang analyserer strukturerne i individuelle smagsnerve-arbors, celletypenumre og de fysiske relationer mellem celler ved hjælp af billedanalysesoftware. Tilsammen giver disse arbejdsgange en ny tilgang til vævsforberedelse og analyse af både hele smagsløg og den komplette morfologi af deres innervering arbors.

Introduction

Smagsløg er samlinger af 50-100 specialiserede epitelceller, der binder delmængder af kemiske smagsstimuli til stede i mundhulen. Smagstransfremerende celler menes generelt at eksistere som typer1,2,3,4,5,6,7,8,9, oprindeligt baseret på elektronmikroskopikriterier, der senere blev korreleret med molekylære markører. Type II celler udtrykker fosfolipase C-beta 2 (PLCβ2)2 og forbigående receptor potentielle kation kanal, subfamily M medlem 51 og omfatter celler, der transduce sød, bitter, og umami1,10. Type III-celler udtrykker carbonic anhydrase 4 (Car4)11 og synaptosomal-associeret protein 258 og betegner celler, der primært reagerer på sur smag11. De celler, der transduce salthed har ikke været så klart afgrænset12,13,14, men kan potentielt omfatte type I, type II og type III celle15,16,17,18,19. Smagsløget er komplekst og dynamisk, da smagstransfremkaldende celler kontinuerligt vender sig over hele voksenalderen og erstattes af basale forfædre3,20,21. Disse smagstransformerende celler forbinder til pseudo-unipolare nervefibre fra geniculate og petrosal ganglier, som videregiver smagsoplysninger til hjernestammen. Disse neuroner er primært blevet kategoriseret baseret på den slags smagoplysninger,de bærer22,23 fordi oplysninger om deres morfologi har været undvigende indtil for nylig24. Type II-celler kommunikerer med nervefibre via calcium homøostasemodulerende protein 1 ionkanal25, mens type III-celler kommunikerer via klassiske synapser8,26. Yderligere karakterisering af smagsløg celler-herunder transducing celle type slægter, faktorer, der påvirker deres differentiering, og strukturerne af forbinder arbors er alle områder af aktiv undersøgelse.

Smagsløgsundersøgelser er blevet hæmmet af flere tekniske udfordringer. Det heterogene og tætte væv , der udgør tungen , reducerer signifikant antistof permeabilitet for immunohistochemistry27,28,29. Disse forhindringer har nødvendiggjort sektionsprotokoller, der resulterer i opdeling af smagsløg på tværs af sektioner, så målingerne enten tilnærmes baseret på repræsentative sektioner eller opsummeres på tværs af sektioner. Tidligere er repræsentative tynde sektioner blevet brugt til at tilnærme både lydstyrkeværdier og transducing-celletal30. Tykkere seriesektion giver mulighed for billeddannelse af alle smagsløgssektioner og opsummering af målinger fra hver sektion31. Skæring sådanne tykke sektioner og vælge kun hele smagsløg bias biass prøveudtagning mod mindre smagsløg32,33,34. Nerve innervation skøn fra sektionsopdelte smagsløg er baseret på analyser af pixel numre13,35, hvis kvantificeret på alle36,37,38. Disse målinger ignorerer fuldstændigt strukturen og antallet af individuelle nervebor, fordi arbors er opdelt (og normalt dårligt mærket). Endelig, selv om skrælning væk epitel gør det muligt hele smagsløg, der skal farves39,40, det fjerner også smag-bud nervefibre og kan forstyrre de normale relationer mellem celler. Derfor har undersøgelser af de strukturelle relationer inden for smagsløg været begrænset på grund af denne forstyrrelse forårsaget af farvningsmetoder.

Hel struktursamling eliminerer behovet for repræsentative sektioner og gør det muligt at fastlægge målinger af absolutte værdier af volumener, celletællinger og strukturmorfologier41. Denne tilgang øger også nøjagtigheden, begrænser bias og reducerer teknisk variation. Dette sidste element er vigtigt, fordi smagsløg viser betydelig biologisk variation både inden for34,42 og på tværs af region43,44, og hele smagsløgsanalyser gør det muligt at sammenligne absolutte celletal mellem kontrol og eksperimentelle forhold. Desuden tillader evnen til at indsamle intakte smagsløg analysen af de fysiske relationer mellem forskellige transfremkaldende celler og deres tilhørende nervefibre. Fordi smagstransfremerende celler kan kommunikere med hinanden45 og kommunikere med nervefibre46, disse relationer er vigtige for normal funktion. Således kan tab af funktion betingelser ikke skyldes et tab af celler, men i stedet for ændringer i cellerelationer. Forudsat her er en metode til indsamling af hele smagsløg for at opnå fordelene ved absolutte målinger til raffinering af volumenanalyser til både smagsløg og deres innervations, smagscelletal og former og til at lette analyser af transducing-cell relationer og nervebor morfologier. To arbejdsgange præsenteres også nedstrøms af denne nye helmonterede metode til vævsforberedelse: 1) til analyse af smagsløgvolumen og total innervation og 2) for sparsomcelle genetisk mærkning af smagsnuroner (med delmængder af smagstransformerende celler mærket) og efterfølgende analyser af smagsnerven arbormorfologi, antal smagscelletyper og deres former og brugen af billedanalysesoftware til at analysere de fysiske relationer mellem transfremkaldende celler og dem mellem transducing celler og deres nervebor. Tilsammen giver disse arbejdsgange en ny tilgang til vævsforberedelse og til analyser af hele smagsløg og den komplette morfologi af deres innervering arbors.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyr blev passet i overensstemmelse med retningslinjerne i den amerikanske folkesundhedspolitik om human pleje og brug af laboratoriedyr og NIH-vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr. Phox2b-Cre mus (MFRRC stamme 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) eller TrkBCreER mus (Ntrk2tm3.1 (cre/ERT2)Ddg) blev opdrættet med tdTomato reporter mus (Ai14). AdvillinCreER47 blev opdrættet med Phox2b-flpo48 og Ai65. For 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) injektioner, EdU blev udarbejdet og doser beregnet i henhold til Perea-Martinez et al.49.

1. Fremstilling af materialer

  1. Udarbejdelse af løsninger
    1. 5,244 g monobasisk natriumphosphat og 23,004 g dibasisk natriumphosphat opløses i dobbeltdestilleret vand (ddH2O) på en rørplade. pH-tallet justeres til 7,4, og det samlede volumen skal opnå 1 L 0,2 M natriumphosphatbuffer (PB).
    2. Paraformaldehyd opløses i ddH2O i en røghætte ved opvarmning under omrøring på en omrøringsplade, indtil opløsningen når 90 °C. Tilsæt 4 M NaOH opløsning dropwise at rydde paraformaldehyd, og filtrere opløsningen ved hjælp af et vakuum Erlenmeyer kolbe og keramisk filter med filterpapir. Tilføj et tilsvarende volumen på 0,2 M PB, og juster pH-værdi til 7,4 for at opnå 4% PFA i 0,1 M PB.

2. Vævspræparat

  1. Vævssamling
    1. Ofr mus med en bedøvelsesoverdosis med en arbejdsopløsning, der indeholder 10 mL steril saltvand og 0,25 mL af en lageropløsning, der indeholder 5 g 2,2,2-tribromoethanol og 5 mL tert-amylalkohol. Gennemtrænge transcardially med 4% PFA i 0,1 M PB; fjerne tungerne og ganen.
    2. Isoler de circumvallate smagsløg ved hjælp af et koronar snit, der adskiller den bageste tunge, bag intermolar eminence; afskåret smagsløgene med et barberblad; og derefter bisect den forreste tunge på midterlinjen. Post-fix natten over ved 4 °C med 4% PFA i 0,1 M PB.
    3. Kryobeskytte vævet i 30% saccharose natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Vævet kan fryses i optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse ved hjælp af 2-methylbutan kølet i et bæger på tøris og opbevares ved -80 °C, hvis proceduren skal sættes på pause her.
  2. Fungiforme smagsløg
    1. 2-methylbutan i et bægerglas på tøris som forberedelse til trin 2.2.8.
    2. Tø og skyl tungen i 0,1 M PB. Placer den ene halvdel af den forreste tunge, der indeholder fungiformen papillae på et glas dias under en dissekere mikroskop.
    3. Brug stumpe sammenkædninger og dissektionssaks til at fjerne musklen. Brug stumpe sammenkædninger til at holde vævet åbent, da det sproglige epitel er buet, og sørg for en flad orientering ved at holde knivene på den grove dissektionssaks parallelt med epitelet.
    4. Kassér den ventrale ikke-keratiniserede epitel af tungen, da den ikke indeholder smagsløg.
    5. Brug fin dissektionssaks til tættere dissektion til undersiden af det keratiniserede epitel.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at dissekere tæt på epitelet, så den resterende muskel er af ensartet tykkelse, og overfladen er glat for at sikre ensartet antistofindtrængning. Konsekvensen af ikke-ensartet tykkelse af den resterende muskel vil være ujævne afsnit på kryostat, med eksponering af epitel i områder med mindre muskler og et tykkere lag af muskler til andre områder, hvilket hindrer antistof penetration.
    6. Brug de stumpe sammenkr vilkke til at lægge et stykke epitel i en vævsform (muskelside ned), og sørg for, at den lægger sig fladt. Når vævet er fladt, tilsæt en dråbe OLT til vævet.
      BEMÆRK: Da spidsen af tungen er buet, kan det være nødvendigt at lave et snit i epitelet, hvor det er buet, så vævet kan gøres til at lægge sig fladt.
    7. Placer vævsformen på en metalbase (tidligere afkølet i tøris) under dissekeringsområdet. Fortsæt med at tappe vævet let med sammentrerne, indtil OLT er frosset for at sikre, at vævet fryser så fladt som muligt.
    8. Når OLT har frosset, hurtigt tilføje yderligere OLT, og placere formen i et bægerglas af 2-methylbutan (afkølet i tøris), indtil frosset.
    9. Cryostat-afsnit
      BEMÆRK: Kryostat anvendes til fin fjernelse af resterende subkutant væv, som kan hæmme antistofindtrængning (Figur 1).
      1. Monter OLT forme på cryostat, og skære 20 μm sektioner. Saml hvert afsnit, og se det under lysmikroskopet for at vurdere dets nærhed til bunden af epitelet (Figur 1E - H).
      2. Når vævet er barberet fra undersiden af epitelet, optøs epitelet og skylles det to gange i 0,1 M PB på en shaker.
  3. Circumvallate smagsløg
    1. Brug et koronarskåret med et barberblad, adskille den circumvallate papilla fra den forreste tunge. Brug to parasagittale snit med samme barberblad til at fjerne vævet lateral til papilla under en dissekering omfang. Placer papilla i en vævsform ved hjælp af sammenkæg, så en sidekant af den circumvallate papilla vender mod bunden af vævsformen.
      BEMÆRK: Vævet kan fryses i OLT ved hjælp af 2-methylbutan kølet i et bæger på tøris og opbevares ved -80 °C, hvis proceduren skal sættes på pause her.
    2. Skær vævet i 90 μm flydende sektioner på kryostat.
  4. Smagsløg på ganen
    1. Skær den hårde gane anterior til krydset af den bløde og hårde gane (Figur 2). Brug en saks til at adskille den bløde gane fra det underliggende væv, og sørg for, at eventuelle resterende knoglefragmenter skæres væk. Fjern yderligere muskel og bindevæv.
      BEMÆRK: Når det er fjernet, vil alt væv, der er tilbage, bestå af kirtler og løst bindevæv, som let klæbes til undersiden af ganen.
    2. Hold ganen med stumpe sammenkrammer, og fjern de resterende kirtler og løst bindevæv ved forsigtigt at skrabe dem med et barberblad.
      BEMÆRK: Vævet kan fryses i OLT ved hjælp af 2-methylbutan kølet i et bæger på tøris og opbevares ved -80 °C, hvis proceduren skal sættes på pause her.

3. Immunohistochemistry farvning

  1. Vask vævene med 0,1 M PB, 3 x 15 min. Vævene placeres i 1 mL-rør med blokerende opløsning (3 % æselserum, 0,5 % ikke-ionisk overfladeaktivt middel (se materialetabellen),0,1 M PB) ved 4 °C natten over.
  2. Blokeringsopløsningen fjernes, og vævet inkuberes i primært antistof (kanin anti-PCLβ2) i antistofopløsning (0,1 M PB, 0,5% ikke-ionisk overfladeaktivt middel) i 5 dage ved 4 °C.
  3. Vask med 0,1 M PB, 4 x 15 min hver vask, og inkuberes i sekundær æsel anti-kanin 488 antistof (1:500) i antistofopløsning i 2 dage ved 4 °C.
  4. Vask med 0,1 M PB, 4 x 15 min hver vask, og bloker med 5% normalt kaninserum i antistofopløsning.
  5. Vask med 0,1 M PB, 4 x 15 min. Inkuberes med æsel antikaninblokerende antistof (20 μg/mL) i antistofopløsning i 2 dage ved 4 °C.
  6. Vask med 0,1 M PB, 4 x 15 min hver vask, og inkuber derefter med primær antistof dsRed (kanin) konjugeret til en fluorescerende etiket (ifølge producentens anvisninger) i en antistofopløsning i 5 dage ved 4 °C.
  7. Vask med 0,1 M PB, 4 x 15 min hver vask, og inkuber derefter med primært antistof (ged anti-Car4 (1:500)) i antistofopløsning i 5 dage ved 4 °C.
  8. Vask med 0,1 M PB, 4 x 15 min hver vask. Inkuberes med sekundær æsel anti-ged 647 antistof (1:500) i antistofopløsning i 2 dage ved 4 °C.
  9. Vask med 0,1 M PB, 4 x 15 min hver vask, og montere (epitel side op) i vandige montering medier, og læg en coverlip over vævssektionen.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes antistoffer fra forskellige arter, som i tilfældet med keratin-8 og dsRed kun, tilsættes alle primære antistoffer til antistofopløsningen i trin 3.2 og alle sekundære antistoffer i trin 3.3, før du fortsætter til trin 3.9.

4. Konfokal billeddannelse og dekonvolution

  1. Fang confokale billeder ved hjælp af et konfokalt mikroskop med et 60x-mål (Numerisk blænde= 1,40), 4 ms / pixel, zoom på 3, Kalman af 2 og størrelse på 1024 x 1024. Vælg en trinstørrelse på 0,47 mm langs z-aksen. Til optagelse af innervation til papillen skal du bruge en zoom på 2,5, hvis synsfeltet med en zoom på 3 er for smal til at fange al indervation til papillen.
  2. Hvis du vil dekonvolrere billederne, skal du være opmærksom på, at nogle indstillinger automatisk importeres med billedet. derfor udfylde de resterende detaljer for modalitet, objektiv linse, numerisk blænde, nedsænkning medium, prøve medium, og fluorophores fanget i billedet. Vælg derefter 3D-dekonvolution.

5. Billedanalyse

  1. Smagsløg og innervation volumen
    1. Importer dekonvoluterede billedstakke til en pixelbaseret billedanalysesoftware (se Materialetabellen)for at bestemme smagsløgets volumen og mængden af total innervation i smagsløget.
      1. Fjern markeringen af lydstyrken i hovedmenuen Objekt.
      2. Vælg Tilføj nye overflader i menuen Objekt. Vælg Spring automatisk oprettelse over, rediger manuelt, og vælg derefter Kontur.
      3. Klik på Vælg og observere pilen vises som en + for at hjælpe med at spore kanten af smagsløg. Flyt udsnitslægen, og omrids smagsløget i hver optisk sektion. Når konturerne er færdige, skal du klikke på Opret Surface.
      4. Vær opmærksom på det taste-bud-volumenobjekt, der nu vises i hovedmenuen Objekt. Find lydstyrken på smagsløget under Værktøjer.
    2. Volumen af innervation i smagsløget
      1. Vælg blyantsikonet under smagsløgsobjektet, og vælg derefter Mask Alle.
      2. Vælg den fluorescerende kanal, der svarer til nervefiberetiketten, i rullemenuen. Kontroller Opret dubletkanal.
      3. Markér Angiv voxels udvendige overflade til:, og skriv 0 i feltet.
      4. Overhold den nye kanal, der vises i vinduet Skærmjustering, som er en uændret dublet af den fluorescerende kanal, der er valgt i smagsløget.
      5. Vælg Opret ny Surfacei hovedmenuen Objekt . Fjern markeringen over For spring automatisk oprettelse over, rediger manuelt.
      6. Klik to gange på den blå pil for at gå videre til næste trin.
      7. Klik på Slet, og klik derefter på den grønne dobbeltpil for at fuldføre overfladen, som repræsenterer mængden af de nervefibre, der findes i smagsløget. Hvis du vil finde værdien for diskenheden, skal du vælge Funktioner under menuen NervefiberObjekt og vælge Lydstyrke i rullemenuen.
    3. Volumen af innervation til papilla
      1. Opret et bind af smagsløget som beskrevet i punkt 5.1.
      2. Vælg blyantsikonet under smagsløgsobjektet, og vælg derefter Mask All.
      3. Vælg den fluorescerende kanal, der svarer til nervefiberetiketten, i rullemenuen. Kontroller Opret dubletkanal.
      4. Kontroller Indstil voxels indvendig overflade til: og skriv 0 i boksen. Klik på OK.
      5. Generér en overflade ved at klikke på Tilføj ny surface. Vælg kun Segment et interesseområde.
      6. Klik på den blå pil, og øge Z-værdien, så området af interesse begynder i bunden af smagsløg.
      7. Klik to gange på den blå pil for at gå videre til næste trin.
      8. Klik på Slet, og klik derefter på den grønne dobbeltpil for at fuldføre overfladen, som repræsenterer mængden af innervation til papillen. Hvis du vil finde værdien for diskenheden, skal du vælge Funktioner under menuen NervefiberObjekt og vælge Lydstyrke i rullemenuen.
    4. Terminal arbor kontakt analyse
      1. Forberedelse af billeder
        1. Gå til menuen Rediger , og vælg Beskær 3D. Beskær billedet på alle sider, fjerne plads uden for smagsløg.
          BEMÆRK: Beskær så tæt på smagsløget uden at fjerne nogen relevant struktur- ethvert overskydende billede vil forlænge behandlingstiden.
        2. Vælg Rediger i hovedmenuen, klik på Skift datatype. Vælg Til: 32 bit flyder i rullemenuen.
        3. Vælg Tilføj nye overflader i menuen Objekt. Klik på Spring automatisk oprettelse over, rediger manuelt, vælg Kontur, og træk derefter udsnitspositionen til højre for at finde det samlede antal optiske udsnit.
        4. Generer isometriske voxels, og sørg for, at voxels i stedet for, at voxels er rektangler (0,0691 x 0,0691 x 0,474) som henholdsvis XxYxZ, voxels er 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 ved at opdele rektanglerne i terninger med identiske værdier for fluorescensintensitet som den oprindelige, rektangulære voxel. Vælg Egenskaber for billede. Opdel derefter Z-værdien for Voxel-størrelse med X- eller Y-værdien (= 0,474/0,0691) og gang den pågældende værdi med antallet af udsnit (optiske sektioner), der blev fundet i forrige trin.
        5. Gå tilbage til Rediger i hovedmenuen, og vælg Resample 3D.
        6. Erstat Z-værdien (antal udsnit) med den nyligt beregnede værdi.
      2. Oprettelse af automatiske overflader baseret på fluorescens
        1. Klik på Tilføj ny surface igen for at tilføje en ny overflade, fravælg kun segmentet et interesseområde, og klik på Næste.
        2. Vælg kanalen for en af de smagstransducingerende celletyper i rullemenuen Kildekanal. Fjern markeringen af Glat, og fortsæt til næste trin.
        3. Du må ikke ændre noget på den næste skærm, der viser rækken af fluorescerende intensiteter til stede på billedet. Klik på den blå pil nederst igen for at gå videre til næste trin.
        4. Klik på Slet, og klik derefter på den grønne dobbeltpil for at fuldføre overfladen.
        5. Gå til menuen Objekt i venstre side af skærmen, hvor den færdige celleoverflade vises, og kaldes noget generisk,f.eks. Dobbeltklik på overfladenavnet for at navngive det i henhold til, hvad etiketten repræsenterer.
          BEMÆRK: I dette tilfælde er den genererede overflade baseret på den PLCß2-mærkede celle.
        6. Hvis der er prikker i stedet for en overflade, skal du klikke på Surface i stedet for Centerpunkti menuen nederst til venstre . Klik derefter på OK, når du bliver bedt om det.
        7. 5.3.2.1-5.3.2.5 for de øvrige smagstransducingerende cellemarkører og nervefibermarkøren.
        8. Gem (eksporter) status.
        9. Klik på en celletype Surface i hovedmenuen. Klik på Funktioneri objektets menu og derefter på Afstandstransformation.
        10. Vent på, at der vises en pop op-boks med titlen XTDistanceTransformation. Vælg Uden for Surface Object. Noter den nye kanal, der vises i menuen Vis justering med navnet Afstand til overflade.
        11. Vælg overfladen Nervefiber i menuen Objekt. Klik på blyantikonet og derefter Mask alle.
        12. Vælg den nye kanal Afstand til overfladenavni den rullemenu, der vises. Noter den nye kanal, der vises i vinduet Vis justering, der kaldes Maskeret afstand til overfladenavn.
        13. Opret et nyt objekt ved hjælp af hovedmenuen Objekt. Fjern markeringen af segmentet kun et interesseområde, og klik på den blå pil. Vælg den maskerede afstand til PLCß2-kanalen, og fjern markeringen af Smooth.
        14. På den næste skærm skal du kontrollere, om der er nogen regioner, hvor de smagstransfremerende celler er inden for den mindste afstand fra de nervefibre, der kan skelnes af denne software. For at gøre dette skal du indstille en grænse på 0,01-0,11 μm for at kontrollere for enhver receptorcelle fluorescens så tæt på nervefibrene.
        15. Skriv 0,01 i den grønne boks i venstre side for at angive den nedre tærskel, tryk på Tab. Klik derefter på den røde knap, og skriv 0,11 for at angive den øvre tærskel. Tryk på Tab, og klik derefter på den blå pil nederst for at gå videre til næste trin.
        16. Klik på Slet og derefter den grønne dobbeltpil for at afslutte.
        17. Omdøb denne overflade inden for 0.01-0.11 fra PLCß2 i menuen Objekt. Vælg Inden for 0.01 - 0.11 af PLCß2-overfladen i objektmenuen.
        18. Vælg blyanten og klik derefter på Mask All. Vælg den røde (nervefiber) kanal i rullemenuen, og klik på OK. Noter den nye kanal, der vises i vinduet Skærmjustering kaldet Maskeret CHS2.
        19. Klik på navnet på kanalen; omdøbe kanalen Inden for 0,01 - 0,11 af PLCß2.
          BEMÆRK: Dette er en fluorescerende kanal, der repræsenterer en kopi af den røde fluorescerende kanal, der er til stede i den skabte overflade.
        20. Klik på hvid i midten af farvevælgeren. Vælg en farve, der står i kontrast til farverne på strukturerne.
        21. Eksporter (dvs. gem) filen på dette stadium.
        22. 5.4.2.9-5.4.2.21 for andre smagstransucerende cellemarkører.
        23. Eksporter (dvs. gem) filen på dette stadium.
          BEMÆRK: Hvis du vil analysere nærheden af en mærket celletype til en anden, skal du blot udskifte nervefiberoverfladen i trin 5.4.2.11 (og følgende trin) med interesseobjektet og de tilsvarende komponenter, der vedrører hver efterfølgende trin.

6. Neuron arbor rekonstruktion og absolut cellenummer kvantificering

  1. Sporing og analyse af terminal arbor
    1. Åbn den dekonvoluterede billedfil i en 3D-vektorbaseret billedanalysesoftware (se materialetabellen), vælg Spor, klik på Neuron, og klik derefter på Dendrite.
    2. Rul til bunden af smagsløget i billedstakken. Spor hver fiber til slutningen, mens du ruller gennem billedstakken.
    3. Når du er i grenens slutning, skal du højreklikke på slutningen og vælge Slut. Højreklik på grenpunkter, og vælg Bifurcating Node.
      BEMÆRK: Dette gør det muligt at spore en gren til slutningen og derefter vende tilbage til bifurcating-punktet og spore den anden gren med programmet, der erkender, at denne sporing stadig er af samme neuron.
    4. Gem datafilen som en . DAT-fil, som derefter kan åbnes til analyse i den 3D-vektorbaserede billedanalysesoftware.

7. Kvantificering af celletal

  1. Kvantificer de mærkede smagsløgsceller i enhver billedanalysesoftwarepakke, så længe forskellige markører for transducingcelletyper, der er forankret til z-positionen, kan placeres på atomniveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farvning af lingual epitel med antistoffer mod dsRed og keratin-8 (en generel smagsløg markør) mærket både hele smagsløg og alle smag-bud innervation i Phox2b-Cre:tdTomato mus50,51 (Figur 3A). Imaging disse smagsløg fra deres porer til deres baser gav den højeste opløsning x-y plan billeder (Figur 3A,B). Konturfunktionen i det pixelbaserede billedbehandlingsprogram blev brugt til at skitsere smagsløgets periferi i hvert afsnit (Figur 3B) og derefter generere en overflade (Figur 3C), der repræsenterede smagsløgsvolumen. Maskering (eller duplikering) fluorescens forbundet med smagsløg etiketten kun inden for overfladen skabt en ny kanal, der indeholdt kun denne fluorescens og elimineret enhver papilla farvning tilsløring smagsløg (Figur 3D). Nervefiber fluorescensen i smagsløget blev maskeret (Figur 3E) og bruges til automatisk at skabe en overflade, der repræsenterer mængden af innervation i den (Figur 3F). En lignende fremgangsmåde blev også anvendt til at måle smagsløg volumen og dens tilhørende innervation i circumvallate smagsløg (Figur 3G). Repræsentative måledata viste ingen korrelationer mellem smagsløgsvolumener og innervationmængder i hverken fungiformen (p = 0,115) eller måleregionerne (p = 0,090) (Figur 3H).

Administrationen af en lav dosis tamoxifen i TrkBCreER:tdTomato mus forårsager gen rekombination og mærkning af et lille antal neuroner, således at smagsløg er innerveret med nul til et par mærket terminal arbors (den neuronale del i smagsløg). Det sproglige epitel blev plettet ved hjælp af et anti-dsRed antistof til terminal arbors og anti-Car4 (sur) og anti-PLCβ2 (søde, bitre og umami) antistoffer mod de smagstransfremerende celler (Figur 4A). Et vektorbaseret billedanalyseprogram blev brugt til at spore de mærkede terminalbor (Figur 4B). De ortogonale højder af arborerne i forbindelse med de blå og grønne sporninger var henholdsvis 33,4 μm (Figur 4C) og 32,4 μm (figur 4D). 3D Convex Hull målingerne (dvs. omfanget af terminalen arbor i smagsløget) for den blå terminal arbor var 644,0 μm3 og 3647,0 μm3 for den grønne arbor. Dendrogram til den grønne sporing er vist i figur 4E med grenlængder målt i mikron. Den grønne arbor havde syv gren ender og en samlet længde på 183,4 μm. Kvantificering af det absolutte antal PLCβ2+ og Car4+-celler viste, at denne smagsløg havde 17 PLCβ2+ celler og to Car4+-celler. Ved hjælp af celle pixel-baseret billedbehandling software til at bestemme den nærmeste nærhed mellem nervefibre og smagstransformerende celler afslørede, at ud af i alt 19 smagstransducingerende celler i smagsløget, den blå terminal arbor (vist med rødt i figur 4F, G) var inden for 200 nm (opløsningen af lysmikroskop) af den lyseblå Car4 + celle (hvide områder angivet med pile i figur 4G). Terminalen arbor forbundet med den grønne sporing er vist i magenta (Figur 4F og Figur 4H) og er inden for 200 nm af både de lyse og mørkeblå Car4 + celler (hvide områder i figur 4H). Da den næste nærmeste celle til disse arbors var mere end 200 nm væk, var der en umærket voxel, der adskiller de to strukturer.

Dividere stamfader celler blev mærket ved hjælp af injektioner af EdU på dag 0, 1 og 3, og væv blev indsamlet på dag 4. Hele mount keratin-8 og EdU farvning af fungiforme smagsløg afslørede, at EdU-mærkede celler var til stede både inden for og uden for smagsløgene (Figur 5A-C). Individuelle EdU+/keratin-8+ celler (blågrøn og gul) og EdU+/keratin-8- kerner (lilla og magenta) blev segmenteret (Figur 5B, C). Den mørkeblå celle vist var keratin-8 + og havde en langstrakt form i overensstemmelse med modne smag-transducing celler. Disse overflader vises med smagsløget orienteret fra pore til base (figur 5B) og langs smagsløgets lange akse (Figur 5C). Hver struktur kan ses i individuelle optiske skiver ved at maskere fluorescensen inden for hver struktur (Figur 5D-F). Magenta og lilla kerner er uden for keratin-8 + kant af smagsløg angivet af den hvid-prikket skitse (Figur 5D,E). De gule, blå og blå celler var inden for smagsløget (Figur 5D-F). Individuelle smagstransfremerende celler kan rekonstrueres ved hjælp af pixelbaseret billedbehandlingssoftware af enten Car4-mærkning (Figur 6A-C) eller PLCβ2-mærkning (Figur 6D-F). En pixelbaseret billedbehandlingssoftware blev brugt til at måle den nærmeste nærhed mellem celler viste, at en Car4+-celle (samme celle som vist i figur 6B)var inden for 200 nm af en enkelt PLCβ2+-celle (Figur 6G, grøn). Det område, hvor cellerne var inden for 200 nm fra hinanden, vises i hvidt (Figur 6G) og angives med hvide pile. Den nærmeste celle var mere end 200 nm væk og er vist med gult i figur 6H, I i to forskellige retninger. Figur 7 viser isolationen og analysen af innervationen, der slutter inden for papillen (men uden for smagsløget) og omfatter dens fordeling omkring smagsløget og dens afstand fra epitelet.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling af lingual epitel til fungiform smagsløg farvning. (A) Udsigt over den afskårne tunge med epitel og muskel mærket før dissektion. (B) Når nok muskler er blevet fjernet, er der kun en lille mængde resterende muskler på undersiden af epitelet. Ud over at evaluere dissektionens fremskridt ved at se den afskårne side af epitelet, (C) om epitelet fladt på et glas dias under dissekeringsområdet afslører, at nogle dele af vævet er jævnt gennemsigtigt (lilla rektangel); nok muskler er blevet fjernet fra dette område. I modsætning hertil angiver de lilla pile områder til venstre, hvor der er flere muskler, der skal fjernes. Når hele undersiden af epitelet ligner området i det lilla rektangel, fortsæt til næste trin. (D) Efter at dele af epitelet er blevet frosset med muskelsiden nedad, fjernes yderligere muskler og lamina propria som tynde sektioner ved hjælp af kryostat. Når afsnittet er færdigt, er det resterende epitel tyndt og gennemsigtigt. (E-F) Serielle sektioner (20 μm) blev indsamlet på et glas dias, og hver sektion blev set under et fluorescerende mikroskop, før du skærer den næste sektion. Et godt stykke under epitelet er muskelfibre orienteret i flere retninger, så muskelfibre er til stede både i tværsnit og langs muskelfibrene (E, rødt rektangel). De serielle sektioner i E-F demonstrere overgangen fra muskelfibre orienteret i flere retninger (E, rødt rektangel) til muskelfibre, der orienteres mest i en retning (F, rødt rektangel), hvilket er tegn på muskel-lamina propria grænsen. Et andet område af det samme stykke væv (gule rektangler) viser, at når muskelfibrene er orienteret i én retning, vil det næste afsnit sandsynligvis give bindevæv, fordi alle muskler er blevet fjernet fra denne region. De blå rektangler repræsenterer begge undersiden af epitelet. Hvis der findes smagsløg på afsnittet(G, røde pile), er der fjernet for meget væv. Ideelt set er afsnittene komplette, når undersiden af epitelet (men ingen smagsløg) er synligt i de fjernede sektioner (F, gult rektangel). Selvom områder med muskelfibre orienteret i samme retning (E, gult rektangel og F, rødt rektangel) også er egnede til sektion, bør områder, hvor muskelfibrene er orienteret i flere retninger (E, rødt rektangel), undgås. (G) Når sektionerne omfatter undersiden af epitel/lamina propria, er det kun muligt at skære et par ekstra sektioner, før for meget af epitelet er fjernet, og sektionerne omfatter smagsløg. (H) Den mest almindelige fejl er afsløret af kryostat sektioner, hvor epitel ses på kanten af vævet, muskel ses inde i epitel, og OTC / sparsomme muskler er til stede i midten. Dette skyldes oftest ikke at lægge vævet fladt på bunden af vævsformen før frysning eller utilstrækkelig udfladning med stumpe sammentrækninger. Skalastænger i A-C = 1 mm; skalastænger i E, F, H = 100 μm; skalalinje i G = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dissektion af gane til farvning. (A) Ganen blev dissekeret først ved hjælp af tynd knivsaks til at skære den hårde gane, (B), og derefter bruge den samme saks til at adskille den bløde gane fra det underliggende bindevæv. Efter fjernelse af vævet fra mundhulen blev det resterende væv fjernet med saksen. På dette tidspunkt er alt, hvad der kan være tilbage, kirtler på bagsiden af den bløde gane. Et barberblad blev brugt til forsigtigt at skrabe disse kirtler væk. Den (C) ryg og(D)epiteloverflade af den færdige dissektion af ganen er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Målevolumen i hele monteringssmageløg. (A) Hele monteringsmageløgene blev afbildet fra smags poren til bunden af smagsløget, så flyet med højeste opløsning er x-y-flyet. Hver optisk skive blev set i pixel-baseret billedanalyse software, og konturfunktionen blev brugt til manuelt at skitsere periferien af smagsløget plettet med keratin-8. (B) Der findes et eksempel på én optisk skive. (C) Placeringen af denne repræsentative sektion langs smagsløgets lange akse vises af den gule linje. Efter hver optisk sektion blev skitseret, blev der skabt en overflade, der repræsenterer mængden af smagsløget (hvid). Maskering eller duplikering af den fluorescerende kanal, der svarer til smagsløget (keratin-8 i D) eller den tdTomato-mærkede innervation (pseudofarvet blå i E) inden for det volumen, der repræsenterer smagsløget. Fluorescensen i smagsløget i (E) blev brugt til at generere en overflade, der repræsenterer mængden af innervation i smagsløget (F, blå). (G) En lignende fremgangsmåde blev anvendt på hele mount circumvallate smagsløg afbildet i samme retning som fungiform smagsløg i A. (H) Måling af mængden af fungiforme og circumvallate smagsløg og deres respektive mængde innervation viste, at der ikke er nogen sammenhæng mellem smagsløg og innervation volumen for smagsløg udtaget til begge regioner. Skalastænger i A-D, F = 4 μm; vægtstang i G = 5 μm. Dette tal er blevet ændret fra Ohman-Gault et al.50. Forkortelser: FF = fungiform; CV = omkreds. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative terminale arbors i fungiforme smagsløg ved hjælp af sparsom cellegenetisk mærkning. (A) Helmonteret smagsløg farves med smagstransducing-cellemarkører Car4 (hvid) og PLCβ2 (grøn). (B) Denne smagsløg har to mærkede terminal arbors, som vises med smagsløget fjernet efter rekonstruering af fibrene. (C) Den blå arbor har 6 grenender og en ortogonal højde i smagsløget på 33,4 μm og (D) den grønne arbor har 7 grenender. (E) Dendrogram svarende til den grønne arbor er forsynet med hvert segment længde i mikrometer. (F-H) Afstanden mellem strukturerne blev målt. (F-G) Den blå sporing i C blev segmenteret og vises med rødt. (G) De områder, hvor terminalen er inden for 200 nm fra den lyseblå Car4+-celle, er angivet med hvide pile. (F, H) Terminalen arbor repræsenteret ved den grønne genopbygning er vist i magenta. (H) Magenta arbor (forbundet med den grønne sporing i 4B, D) er inden for 200 nm fra både de mørke og lyseblå Car4+ celler. Skalastang i A, B = 4 μm; skalastænger i F-H = 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Helmonterede kan bruges til at spore inkorporering af nye smagsløgsceller. Mus blev injiceret med EdU for at mærke dividere forfædre på dag 0, 1 og 3 og ofret på dag 4. (A, B) Celler mærket med EdU (grøn) kan identificeres både omkring og inden for smagsløget, som er mærket med keratin-8 (A, hvid, B, grå). (B, C) Individuelle EdU-mærkede, keratin-8+ celler inde i smagsløget og keratin-8-, EdU-mærket kerner er segmenteret uden for smagsløget. (D-F) Fluorescensen inden for hver struktur segmenteret i A-B var maskeret og kan ses i tværsnit. Omkredsen af smagsløget er skitseret med en hvid prikket linje (D-F). (D) Den gule celle er inden for smagsløget og er både EdU-mærket og keratin-8+. Magentakernen er uden for smagsløget og er keratin-8-. (E) Den blågrønne celle er inde i smagsløget og både EdU-mærket og keratin-8 +. Den lilla EdU-mærkede kerne er keratin-8- og uden for smagsløget (hvid pil). (F) Den blå celle er keratin-8+ og langstrakt, i overensstemmelse med modne smagstransducingerende celler. Skalastænger i A-C =3 μm; skalastænger i D = 2 μm skalastænger i E, F = 4 μm. Forkortelse: EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Former af hele smagsløg celler kan analyseres sammen med deres relationer med andre smagsløg celler. (A-F). Segmentering af individuelle smagsløgsceller for at skabe overflader isolerer individuelle smagsløgsceller, hvilket letter klar visualisering. Individuelle (A-C) Car4+ og (D-F) PLCβ2+ celler viser variationen i de enkelte celleformer. (G) Den nærmeste PLCβ2+-celle på Car4+-cellen i B blev bestemt til at være inden for 200 nm (ved en enkelt lille 0,5 μm2 placering angivet med pil). Den næste nærmeste celle var større end 300 nm væk og kan skelnes som en separat struktur fra den segmenterede Car4 + celle. (H, I) Den næste nærmeste celle blev segmenteret. og den maskerede fluorescens er vist med gult. De tre nærmeste punkter for den nærmeste celle (gul)er angivet med pilespidser i H, I. Skalastænger i A-C = 3 μm; skalastænger i D, E = 4 μm; skalastang i F = 2 μm skalastænger i G-I = 3 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Kvantificere innervation til papilla. (A) Nogle etiketter til smagsnuroner mærker også innervation til papillen. B) Inderen i smagsløget adskilles fra inderen uden for smagsløget ved at segmentere smagsløget (som beskrevet for figur 3), (C) maskere innervation inde i smagsløget (rød) og derefter maskere innervationen uden for smagsløget (mørkeblå). Mængden af innervation til smagsløg (rød) var 1649,6 μm3. Innervationen uden for smagsløget vil omfatte smagsfibre under papillen, der ikke bør indgå i kvantificeringen af innervation til papillen. (D) Fluorescensen af innervation til papillen var maskeret (lyseblå). Mængden af innervation til papillen var 121,8 μm3. Skalastænger i A-D = 4 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udviklingen af en tilgang til konsekvent at indsamle og plette hele smagsløg fra tre mundhule smag regioner (fungiform, circumvallate, og ganen) giver betydelige forbedringer til analyse af smag-transducing celler, sporing nyligt indarbejdet celler, innervation, og relationer mellem disse strukturer. Derudover letter det lokaliseringen af en potentiel sekundær neuronmarkør både inden for eller uden for en mærket population50. Dette er især relevant i betragtning af, at gustatory papillae også modtager robust somatosensorisk innervation52,53, som også kan mærke nogle smag neuroner. De papillae hus smagsløg kan også afbildes ved hjælp af en lavere forstørrelse. Dette gør det muligt at visualisere innervation til hele papillaen såvel som til smagsløgene og muliggør uafhængige analyser af innervationen, der trænger ind i smagsløget og de omkringliggende nervefibre.

Somatosensoriske nerveender i huden kan skelnes baseret på deres organisation omkring hårsække og deres forhold til andre komponenter i epitelet; parallelle analyser i gustatory papillae kan give lignende karakteriseringer54,55. Etablering af et normalt grundlag for forholdet inden for, og sammensætningen af, smagsløg og papillae vil tjene som udgangspunkt for fastsættelsen af de mekanismer, der ligger til grund for underskud i perifere smagsfunktioner56,57. Smagsløget er et dynamisk sensorisk end-orgel, hvor celleomsætning og terminal arbor remodeling koordineres af en række faktorer58. Undersøgelser af de potentielle kredsløb i smagsløg59, sygdomsprocesser57, og kemoterapier, der forstyrrer normal smagsfunktion58 kunne forbedres ved denne metode, som fastholder hele smagsløg og nervefibre intakt. Hele monteringsmetoden, der er beskrevet her, udvider både mulighederne for analyse og forfiner de målinger, der er mulige.

I betragtning af at tungen er et tæt og heterogent væv, og at smagsløget selv indeholder mange celle-til-celle-kryds, der begrænser permeabilitet27, udgjorde udviklingen af en tilgang til at udføre hele mount farvning af smagsløg en betydelig udfordring. Tidligere metoder omfattede repræsentative afsnit60 eller skæring af tykkere sektioner, som derefter begrænsede antistofindtrængning32,33,34. Derudover forudindtagede udvælgelsen af hele smagsløg fra disse tykkere sektioner dataene mod mindre smagsløg. Alternativt, peeling epitel er tilbøjelige til at forstyrre smag bud nervefibre; disse er ikke specifikt mærket, når denne fremgangsmåde anvendes39,40. Nerve arbors danner en stor plexus i en smagsløg26,50,61, så det er uklart, om arbor fjernelse forstyrrer de normale relationer mellem andre celler i smagsløget. I modsætning hertil gør den nuværende hele smagsløgsmetode det muligt at kvantificere absolutte tal og målinger. Denne farvning gør det muligt at bevare og analysere mange transfremkaldende cellefunktioner (type, form og placering) og terminalborene (samt forholdet mellem dem).

Der er flere begrænsninger i denne tilgang. Især virker nogle antistoffer, der er blevet brugt i tynde sektioner62, ikke i hele mounts, hvilket vil begrænse de typer strukturer, der kan undersøges. Da konfokal mikroskopiopløsning er begrænset, vil de strukturelle data analyseres fra individuelle celler og fra forholdet mellem celler også være begrænset24. For eksempel kan celler bestemmes at være inden for 200 nm af hinanden, men specialiserede strukturer mellem celler (f.eks. synapser)63 kan ikke undersøges. Endelig kan ikke alle celletyper mærkes ved hjælp af denne fremgangsmåde. For eksempel har det vist sig at være svært at specifikt mærke celler, der transduce salt i dette præparat. Disse celler kan være et undersæt af en kombination af cellerne Type 1, Type II og Type III14,15,16,17,18,19,64. Type I-celler, som primært understøtter celler, kan ikke undersøges i helmonteringer, fordi de ser ud til at ombrydes omkring andre celler, hvilket gør dem vanskelige at skelne som separate objekter65. Hvis man har en pålidelig markør for salttransucerende celler , vil det give mulighed for mere omfattende analyser14,66. Ligeledes, som PLCβ2 farvning repræsenterer smagsceller i stand til at transducing flere typer af stimuli, en etiket, der tillod yderligere adskillelse af denne celletype ville også være en forbedring.

Følgende er vigtige forberedende skridt, der kræver pleje. Først skal du sikre, at muskellaget, der er tilbage efter dissektion, er jævnt og så tyndt som muligt. Hvis dette lag ikke engang er, vil antistofindtrængning i sidste ende ikke være ensartet. For det andet er det afgørende, at stykkerne af epitel lå fladt i bunden af vævsformen før frysning, og at stumpe sammentrækninger bruges til let at trykke på vævet, indtil det er frosset. Når den minimale mængde muskler (i et jævnt lag) forbliver på undersiden af epitelet, vil så få som tre kryostatsektioner nå undersiden af epitelet. Placering af vævet i en kryostat, således at sektioner tages på tværs af hele vævsfladen, resulterer nogle gange i, at dele af vævet fjernes ujævnt. Af disse grunde anbefales det kraftigt at undgå yderligere optøning, yderligere dissektion og genfrysning af vævet. I stedet bør man være forsigtig med at evaluere væv dissektion før frysning af vævet.

Samlet set kan metoden til helmonteret vævspræparat, der præsenteres her, bruges til opsamling af hele smagsløg samt den omgivende papilla fra tre smagsløgsregioner: fungiform, circumvallate og ganen. Selv om en række sygdomstilstande56,57 og kemoterapier56 er kendt for at forstyrre smagsfunktionen, forbliver de mekanismer, der ligger til grund for disse ændringer, ukendte. Ved hjælp af hele mount farvning tilgang til smagsløg præsenteret her repræsenterer en robust eksperimentel design, hvor både smag-transducing celler og deres nervefibre kunne mærkes til at afgøre, om et underskud skyldes tab af en bestemt celletype, kompromitteret terminal arbor morfologier, forstyrret relationer mellem smag-transducing celler, eller forstyrret relationer mellem transducing celler og deres nervefibre. Derudover vil det være muligt ikke blot at kvantificere det absolutte antal mærkede nye celler i smagsløg, men også at kvantificere antallet af nye smagstransducingerende celler (EdU-mærket) af en defineret type (dvs. PLCβ2+ eller Car4+). Hvorvidt disse nye celler udvikler normale former og normalt indarbejdes i smagsløget (dvs. flytte ind i smagsløget efter behandling) kunne også undersøges. Mange af disse foranstaltninger, sammen med smagsløg nummer, kan alle være lavet af det samme væv, hvilket begrænser antallet af forskellige dyr, der er nødvendige for et eksperiment. Disse muligheder kan lette strømliningen af eksperimentelle metoder til at tilvejebringe kliniske interventioner for smagsunderskud samt give indsigt i de normale mekanismer, der ligger til grund for smagsfunktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Kavisca Kuruparanantha for hendes bidrag til væv farvning og billeddannelse af circumvallate smagsløg, Jennifer Xu for farvning og billeddannelse af innervation til papilla, Kaytee Horn for dyrepleje og genotyping, og Liqun Ma for hendes væv farvning af blød-gane smagsløg. Dette projekt blev støttet af R21 DC014857 og R01 DC007176 til R.F.K og F31 DC017660 til L.O.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Tags

Neurovidenskab smagsløg hele mount innervation afferent tunge smag
Hele Mount farvning, visualisering og analyse af fungiform, circumvallate og gane smagsløg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohman, L. C., Krimm, R. F.… More

Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter