Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Использование микро-КТ-сканирования для анализа паразитических взаимодействий между растением и хозяином

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63423
Automatic Translation
1,2
1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Summary

Микро-КТ - это неразрушающий инструмент, который может анализировать структуры растений в трех измерениях. В настоящем протоколе описана пробоподготовка с использованием микро-КТ для анализа структуры и функции паразитарных растений. Различные виды используются, чтобы подчеркнуть преимущества этого метода в сочетании с конкретными препаратами.

Abstract

Микро-КТ-сканирование стало признанным инструментом для исследования структуры и функции растений. Его неразрушающий характер в сочетании с возможностью трехмерной визуализации и виртуального разреза позволил по-новому и все более детально анализировать сложные органы растений. Также могут быть изучены взаимодействия между растениями, в том числе между растениями-паразитами и их хозяевами. Однако подготовка образца перед сканированием становится решающей из-за взаимодействия между этими растениями, которые часто различаются по организации и составу тканей. Кроме того, при отборе проб, обработке и подготовке материала паразита-хозяина необходимо учитывать широкое разнообразие паразитических цветковых растений, начиная от сильно редуцированных вегетативных тел и заканчивая деревьями, травами и кустарниками. Здесь описаны два различных подхода к введению контрастных растворов в растения-паразиты и/или растения-хозяева, уделяя особое внимание анализу гаустория. Этот орган способствует связи и общению между двумя растениями. Следуя простому подходу, детали организации ткани гаустория могут быть исследованы в трех измерениях, как показано здесь для видов эуфотоидов, виноградной лозы и омелы. Выбор специфических контрастных агентов и подходов к применению также позволяет детально наблюдать за распространением эндопаразита в организме хозяина и обнаруживать прямую связь между сосудами и хозяином, как показано здесь для облигатного корневого паразита. Таким образом, обсуждаемый здесь протокол может быть применен к широкому разнообразию паразитических цветковых растений для улучшения понимания их развития, структуры и функционирования.

Introduction

Рентгеновская микрокомпьютерная томография высокого разрешения (микро-КТ) представляет собой метод визуализации, при котором несколько рентгенограмм (проекций) образца записываются под разными углами обзора и в дальнейшем используются для обеспечения виртуальной реконструкции образца1. Затем этот виртуальный объект можно анализировать, манипулировать и сегментировать, что позволяет проводить неразрушающее исследование в трех измерениях2. Первоначально разработанная для медицинских анализов, а затем для промышленного применения, микро-КТ также предлагает преимущество визуализации внутренних органов и тканей без необходимости инвазивных процедур3. Как и другие формы визуализации, микро-КТ работает с компромиссом между полем зрения и размером пикселя, что означает, что визуализация больших образцов с высоким разрешением практически недостижима4. Постоянно делаются успехи в использовании высокоэнергетических источников рентгеновского излучения (например, синхротрона) и вторичного оптического увеличения, что позволяет наименьшему разрешению достигать менее 100 нм 5,6. Тем не менее, для больших образцов требуется более длительное время сканирования, что увеличивает вероятность появления артефактов из-за движения или деформации образца внутри сканера. Кроме того, микро-КТ обычно ограничена естественными изменениями плотности в образце и тем, как образец взаимодействует с рентгеновскими лучами. В то время как более высокая доза рентгеновского излучения лучше всего подходит для проникновения в более плотные образцы, она менее эффективна для улавливания изменений плотности внутри и между образцом и окружающей его средой7. С другой стороны, меньшая доза рентгеновского излучения обеспечивает меньшую проникающую способность и часто требует более длительного времени сканирования, но большей чувствительности при обнаружении плотности7.

Эти ограничения долгое время препятствовали использованию микротомографии в науках о растениях, учитывая, что большинство растительных тканей состоят из легкой (неплотной) ткани с низким поглощением рентгеновского излучения8. Первые применения микро-КТ были сосредоточены на картировании корневых сетей в почвенной матрице 9,10. Позже стали исследоваться растительные структуры с более значительными различиями в плотности тканей, такие как древесина. Это позволило исследовать функциональность ксилемы 11,12, развитие сложных тканевых организаций13,14 и взаимодействия между растениями15,16,17. Анализ мягких и однородных тканей получает широкое распространение благодаря контрастным веществам, которые в настоящее время являются стандартной процедурой при подготовке к микро-КТ-сканированию образцов растений. Однако протоколы введения контраста могут иметь разные результаты в зависимости от объема образца, структурных свойств и типа используемого раствора8. В идеале контрастное вещество должно усиливать различие между различными тканями, позволять оценивать функциональность ткани/органа и/или предоставлять биохимическую информацию о ткани18. Таким образом, адекватная обработка, подготовка и монтаж образца перед сканированием приобретают решающее значение для любого микро-КТ-анализа.

Микро-КТ паразитического растения гаустория
Паразитические цветковые растения представляют собой отдельную функциональную группу покрытосеменных растений, характеризующихся органом, известным как гаусторий19. Этот многоклеточный орган, являющийся гибридом развития между модифицированным стеблем и корнем, воздействует на прикрепление, проникновение и контакт паразита20 с хозяином. По этой причине считается, что гаусторий «воплощает саму идею паразитизма среди растений»21. Детальное понимание развития, структуры и функционирования этого органа имеет решающее значение для изучения экологии, эволюции и управления паразитическими растениями. Тем не менее, общая сложность паразитических растений и сильно измененная структура и гаустория часто препятствуют детальному анализу и сравнению. Гаусторийные связи также обычно обширны и неоднородны по распределению тканей и клеток (рис. 1). В этом контексте, хотя работа с небольшими фрагментами тканей позволяет легче манипулировать и иметь более высокое разрешение, это может привести к ошибочным выводам о трехмерной архитектуре сложных структур, таких как паразитический гаусторий растений.

Несмотря на то, что существует обширная литература по анатомии и ультраструктуре гаустория для большинства видов растений-паразитов, трехмерная организация и пространственные отношения между тканями паразита и хозяина остаются плохо изученными17. В недавней работе Masumoto et al.22 более 300 серийных полутонких срезов микротома были изображены и реконструированы в трехмерный виртуальный объект, представляющий гаусторий двух видов паразитов. Превосходный уровень детализации этого метода обеспечивает беспрецедентное понимание клеточной и анатомической 3D-структуры гаустория. Однако такой трудоемкий метод запретил бы аналогичный анализ у паразитов с более обширными гаусторийными связями. Использование микро-КТ становится отличным инструментом для трехмерного анализа сложных и часто громоздких гаусторий растений-паразитов. Несмотря на то, что результаты, полученные с помощью микро-КТ-сканирования, особенно для больших образцов, не заменяют подробное анатомическое срезирование и другие дополнительные формы микроскопического анализа17,23, они также могут служить руководством для направления субвыборки более мелких сегментов, которые затем могут быть проанализированы с использованием других инструментов, таких как конфокальная и электронная микроскопия, или повторно проанализированы с помощью систем микро-КТ с высоким разрешением.

Figure 1
Рисунок 1: Паразитические растения различных функциональных групп, используемые в этом протоколе. Эуфитоидный паразит Pyrularia pubera (A), эндопаразит Viscum minimum (B) с зелеными плодами (пунктирный черный круг), паразитическая лиана Cuscuta americana (C), омела Struthanthus martianus (D), облигатный корневой паразит Scybalium fungiforme (E). Сегменты корня хозяина (Hr) или стебля (Hs) облегчают применение контраста в гаустории паразита (P). Наличие в образце материнского корня/стебля паразита (стрелки) позволяет проанализировать организацию сосуда гаустория. Прямоугольниками обозначены сегменты образца, используемого для анализа. Масштабные линейки = 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

По мере того, как микро-КТ становится все более популярным методом в науках о растениях, существуют руководства, протоколы и литература, посвященные сканированию образцов, трехмерной реконструкции, сегментации и анализу 3,10,24. Таким образом, эти шаги здесь обсуждаться не будут. Как и в случае с любой техникой воображения, надлежащая обработка и монтаж образцов являются фундаментальной, хотя и часто упускаемой из виду процедурой. По этой причине этот протокол фокусируется на подготовке образцов гаустория для микро-КТ-сканирования. Более конкретно, этот протокол описывает два подхода к введению контрастных веществ в образцы гаустория для улучшения визуализации различных тканей и типов клеток в гаустории, для облегчения обнаружения паразитарной ткани в корне / стебле хозяина и для анализа сосудистых связей паразит-хозяин в трех измерениях. Препараты, описанные здесь, также могут быть адаптированы для анализа других структур растений.

Пять видов были использованы, чтобы лучше проиллюстрировать удобство протокола, описанного здесь. Каждый вид представляет одну из пяти функциональных групп паразитических цветковых растений, тем самым обращаясь к конкретным моментам, связанным с функциональностью каждой группы. Pyrularia pubera (Santalaceae) была выбрана для представления эуфитоидных паразитов, которые прорастают в землю и образуют множественные гаустории, которые соединяют паразита с корнями его хозяев25. Гаустории, создаваемые этими растениями, часто разрежены и легко отрываются от хозяина26 (рис. 1А), что требует более деликатного процесса обращения. Эндопаразиты представлены здесь Viscum minimum (Viscaceae). Виды этой функциональной группы видны вне тела своих хозяев только в течение коротких периодов времени (рис. 1B) и живут большую часть своих жизненных циклов в виде значительно редуцированных и мицелиальноподобных нитей клеток, встроенных в ткани хозяина25. Третья функциональная группа включает паразитические лианы, которые прорастают на земле, но образуют только рудиментарные корни, опираясь на множественные гаустории, которые прикрепляются к стеблям растений-хозяев25 (рис. 1С). Здесь эта функциональная группа представлена Cuscuta americana (Convolvulaceae). В отличие от паразитических лиан, омела прорастает непосредственно на ветвях растений-хозяев и развивает либо множественную, либо одиночную гаусторию25. Видом, выбранным для иллюстрации этой функциональной группы, является Struthanthus martianus (Loranthaceae), который образует различные связи с ветвью хозяина (рис. 1D). Анализ одиночной гаустории омелы с использованием комбинации микро-КТ и световой микроскопии можно найти в Teixeira-Costa & Ceccantini17. Наконец, облигатные корневые паразиты включают виды, которые прорастают на земле и проникают в корни растений-хозяев, от которых они полностью зависят с самых ранних стадий роста25. Эти растения представлены здесь Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), которые производят крупные клубневидные гаустории (рис. 1E).

Все образцы растений, использованные в этом протоколе, были зафиксированы в 70% спирте формалиновой уксусной кислоты (FAA 70). Фиксация при отборе проб имеет решающее значение для сохранения растительных тканей, особенно если необходимы последующие анатомические анализы. В случае паразитического гаустория растений фиксация также необходима, так как этот орган часто в основном состоит из неодревесневших клеток паренхимы20. Подробные протоколы фиксации растительной ткани, включая приготовление фиксирующих растворов, можно найти в другом месте27. С другой стороны, в большей или меньшей степени фиксаторы могут вызывать изменения физических и химических свойств образца, делая его непригодным для конкретных биомеханических и гистохимических анализов. Таким образом, свежие образцы, т.е. нефиксированный материал, собранный непосредственно перед подготовкой, также могут быть использованы с этим протоколом. Подробная информация о том, как работать со свежими образцами, и предложения по устранению неполадок с фиксированным материалом приведены в разделе обсуждения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Отбор образцов растений-паразитов

  1. Соберите весь паразитический гаусторий растения, включая прикрепленный стебель/корень хозяина и сегменты как проксимального, так и дистального концов паразитированного органа хозяина; Идеальная длина каждого сегмента эквивалентна удвоенному диаметру гаустория.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для латеральной гаустории включите часть материнского стебля/корня паразита, из которого образовался гаусторий (рис. 1A, B, D). Для эндопаразитов соберите сегмент стебля/корня хозяина, в котором видны признаки паразита (рис. 1B). В случае клеммных соединений следует собирать всю установку (рис. 1E).
  2. Погрузите весь образец в фиксирующий раствор (например, FAA) в объемной пропорции 1:10 (образец: фиксатор). Оставляют пробы в фиксаторе не менее 1 суток в зависимости от размера пробы27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в фиксаторе перед сканированием или переводить в консервирующий раствор (например, этанол 70%). Свежие образцы также могут быть использованы, если последующий анатомический анализ не оправдан (см. раздел «Обсуждение»). Если вы работаете со свежим материалом, настройте аппарат для перфузии контрастного раствора, затем соберите образец. Нельзя допускать высыхания образца.

2. Применение контрастных решений

  1. Выберите способ нанесения, который будет использоваться. Используйте вакуумный метод (этап 2.3) для небольших (рис. 1А) или недревесных (рис. 1Б) образцов. Используйте метод перфузии для более крупных образцов при условии, что он включает сегмент стебля/корня хозяина (рис. 1A, C-E).
  2. Надевайте резиновые перчатки и другие соответствующие средства индивидуальной защиты (например, лабораторный халат) при манипуляциях с образцом независимо от подхода, выбранного на следующих этапах.
    ВНИМАНИЕ: Все контрастные растворы включают в свой состав соли тяжелых металлов, и поэтому с ними нельзя обращаться без соответствующих средств индивидуальной защиты и под вытяжным шкафом.
  3. Для вакуумного метода выполните шаги, указанные ниже.
    1. Выберите подходящий флакон и промаркируйте его. Флакон должен быть достаточно большим, чтобы вместить образец и контрастный раствор, обычно в пропорции 1:10. Ознакомьтесь с инструкциями производителя, чтобы убедиться, что флакон выдерживает низкий или умеренный вакуум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не наполняйте флакон до краев, так как отрицательное давление (вакуум) может привести к разливу жидкости.
    2. Поместите образец во флакон с контрастным раствором (1% йода или 3% фосфовольфрамата, см. Таблицу материалов). Затем поместите флакон в вакуумную камеру или эксикатор, подключенный к вакуумному насосу. Снимите крышку с флакона, затем закройте вакуумную камеру или эксикатор.
    3. Убедитесь, что на вакуумной камере/эксикаторе нет трещин и достаточно масла в вакуумном насосе.
    4. Закройте выпускной клапан насоса, чтобы предотвратить утечку воздуха, и откройте выпускной клапан камеры/эксикатора, чтобы вытеснить воздух.
    5. Включите насос и подождите, пока давление не достигнет примерно 20 дюймов ртутного столба.
      ВНИМАНИЕ: Этот процесс обычно быстрый, поэтому не оставляйте вакуумную систему без присмотра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как метрической системной единицей измерения давления является Паскаль (Па), манометры в большинстве лабораторных вакуумных насосов показывают давление в дюймах ртутного столба («Hg»), фунтах на квадратный дюйм (psi) или барах. 20 дюймов ртутного столба равны ок. 67,7 Па, 10 фунтов на квадратный дюйм или 0,7 бар.
    6. Закройте выпускной клапан камеры/эксикатора, чтобы предотвратить повторный поступление воздуха, затем быстро выключите насос.
    7. Оставьте образец в вакууме не менее чем на 2 часа; Более крупным образцам требуется больше времени, чтобы контрастный раствор проник в него.
    8. По истечении нужного срока извлеките образец из контрастного раствора, чтобы подготовить его к сканированию.
    9. Медленно откройте выпускной клапан камеры/эксикатора, чтобы воздух проник в него.
    10. Подождите, пока давление в камере/эксикаторе полностью исчерпается (т. е. манометр достигнет почти 0), затем осторожно откройте его, чтобы извлечь образец.
    11. Выбросьте контрастный раствор соответствующим образом и держите образец при подготовке к сканированию.
  4. Для метода перфузии выполните шаги, указанные ниже.
    1. Выберите резервуар для подачи контрастного раствора в соответствии с размером образца. Используйте шприц объемом 50 мл (без иглы или поршня) для небольших образцов (рис. 2A) или аптечку для внутривенного введения 1 л для больших образцов (рис. 2B).
    2. Подсоедините один конец прозрачной пластиковой трубки (см. Таблицу материалов) к подающему баку, затем другой конец подсоедините к двухходовому или трехходовому клапану. Подсоедините вторую трубку к другому выходному отверстию клапана (рис. 2A, B).
    3. Закрепите резервуар подачи на возвышении, не разбирая устройство, установленное на предыдущем шаге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальное расстояние между резервуаром и образцом будет определять давление перфузии раствора (рис. 2B). Для небольших образцов достаточно расстояния в 20-50 см. Для больших образцов более адекватно расстояние в 1 м.
    4. Закройте трехходовой (рис. 2C) или двухходовой (рис. 2D) клапан, чтобы предотвратить выход жидкости из системы трубок, затем залейте контрастный раствор в подающий бак. Если вы используете внутривенную медицинскую аптечку, наполните пакет раствором и закройте клапан, прежде чем закрепить аппарат в возвышенном положении.
    5. Убедитесь, что вдоль системы трубок не образуются крупные пузырьки воздуха (рис. 2E). При необходимости дайте контрастному раствору вытечь из трубки до тех пор, пока пузырь не будет удален. Снова закройте клапан и оставьте аппарат на месте.
    6. Чтобы подготовить образец к перфузии контрастного раствора, держите его погруженным в жидкость (воду, этанол или фиксатор) и отрежьте кончик проксимального конца стебля/корня хозяина в образце (рис. 2F).
    7. Извлеките образец из жидкости, в которой он хранился, и заверните его в парафиновую пленку, чтобы избежать высыхания. Держите образец поблизости и будьте готовы к подключению к устройству.
    8. Осторожно откройте клапан, чтобы контрастный раствор протекал медленно, и заполните пластиковую трубку, соединенную с резервуаром, удерживая открытый конец системы в слегка приподнятом положении, чтобы предотвратить разлив контрастного раствора. Опять же, убедитесь, что вдоль трубки не образуются большие пузырьки воздуха.
    9. Подсоедините проксимальный конец основного стебля/корня в образце с открытым концом системы трубок (рис. 2B, увеличенная область). Избегайте попадания пузырьков воздуха в систему на этом этапе. При необходимости отсоедините образец от аппарата и удалите пузырьки воздуха из системы, позволив раствору течь.
    10. Удерживая образец подключенным к аппарату, поместите его в контейнер, чтобы избежать утечки контрастного раствора в область, где проводился эксперимент. Используйте трубки разного диаметра, пластиковые стяжки и переходники клапанов (рис. 2G), чтобы убедиться, что все соединения в аппарате хорошо подогнаны, вмещают хост-ветви различных размеров и что раствор не вытекает из системы трубок (рис. 2B, увеличенная область).
    11. Дайте раствору перфузировать образец в течение не менее 2 ч или до тех пор, пока раствор не накопится внутри контейнера.
    12. Закройте клапан и осторожно отсоедините образец от аппарата. Слейте остатки раствора в контейнер и утилизируйте его соответствующим образом.
    13. Удалите парафиновую пленку с образца при подготовке к сканированию.

Figure 2
Рисунок 2: Перфузионный подход для нанесения контраста. Малая (А) и большая (В) версии перфузионного аппарата включают в себя подающий резервуар (st) и две пластиковые трубки (t1 и t2), соединенные клапаном (va). Проксимальный конец стебля хозяина (H), несущий паразита (P), прикрепленного к нему через гаусторий (ha), соединен с открытым концом системы (B, расширенный). Трехходовой (C) или двухходовой (D) клапан используется для предотвращения образования пузырьков воздуха внутри системы трубок, которые блокируют прохождение контрастного раствора (E). Кончик проксимального конца стебля-хозяина (H) разрезают под водой, чтобы обеспечить прохождение контрастного раствора (F). Застежки-молнии, переходники клапанов и трубки разного диаметра помогают закрепить более плотные соединения и избежать утечек в системе (G). Рисунки 2B, D и F были созданы с помощью BioRender. Масштабные линейки = 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Подготовка образцов и монтаж

  1. Промойте образец, погрузив его в воду на 2 минуты.
    ВНИМАНИЕ: Не мойте образцы в раковине, так как все контрастные растворы включают в свой состав соли тяжелых металлов. Рассматривайте воду, используемую для стирки, как разбавленный контрастный раствор и утилизируйте ее соответствующим образом.
  2. Поместите образец в бумажное полотенце при комнатной температуре, чтобы лишняя вода испарилась в течение 2-5 минут в зависимости от размера образца. В качестве альтернативы слегка подсушите образец с помощью бумажного полотенца. Не допускайте полного высыхания образца.
  3. Заверните образец в парафиновую пленку, растянув ее до тонкого слоя. Не сворачивайте парафиновую пленку поверх образца.
  4. Установите обернутый образец на держатель образца, сохраняя его устойчивым и в нужном положении, пока он вращается во время сканирования. Используйте клейкую ленту, пенопласт низкой плотности, наконечники для пипеток и/или прозрачные пластиковые контейнеры, чтобы закрепить образец на месте.
  5. Отсканируйте образец и проанализируйте изображения в соответствии с конкретными протоколами и рекомендациями, установленными для доступной системы микро-КТ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Гаусторий растений-паразитов представляет собой сложный орган, состоящий из различных тканей и типов клеток, которые переплетаются и соединяются с тканями другого растения, используемого в качестве хозяина20. Микро-КТ-сканирование может быть использовано для лучшего понимания этой сложной структуры неразрушающим и трехмерным способом при анализе как малых (рис. 1A-C), так и больших (рис. 1D, E) гаусторий. Для этого контрастные растворы могут быть применены к интерфейсу паразит-хозяин, что позволяет анализировать образцы, которые в противном случае имели бы низкое и однородное поглощение рентгеновских лучей. Два простых подхода, описанных в этом протоколе, основаны на давлении контрастного раствора для ускорения проникновения через образец. Как и ожидалось, описанные здесь протоколы работают для различных систем микро-КТ. Однако настройки и параметры сканирования различаются в зависимости от системы и анализируемого образца (таблица 1).

Функциональная группа Эуфитоидный паразит Эндопаразит Паразитическая лоза Омела (контраст до/после) Облигатный корневой паразит
Виды (семейство) Pyrularia pubera Вискум минимум Кускута американская Struthanthus martianus Scybalium fungiforme
Семья Santalaceae Висковые (Viscaceae) Вьюнковые (Convolvulaceae) Loranthaceae Balanophoraceae
Контрастное решение 3% фосфовольфрамата 1% йода 1% йода 1% йода 0,2% нитрата свинца
Способ применения вакуум вакуум перфузия перфузия перфузия
Система микро-КТ Цейсс Верса 620 Nikon X-Tek HMXST225 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176
Проекции 4500 3140 610 1200 / 2400 5300
Кадров 1 1 3 (усредненный) 3 / 3 (усредненный) 3 (усредненный)
Экспозиция (мс) 5000 1000 680 1600 / 830 750
Фильтр (мм) никакой Эл 0,25 Аль 1.0 Al 1,0 / Al 1,0 никакой
Напряжение (кВ) 60 85 35 90 / 45 40
Ток (мкА) 108 80 375 180 / 390 600

Таблица 1: Настройки сканирования и параметры для анализируемых образцов.

После первого подхода для нанесения контраста (этап 2.3) вакуум использовали для перфузии гаустория эуфитоидного паразита P. pubera 3% раствором фосфовольфрамата в течение двух часов. Затем образец сканировали в системе 3D-рентгеновского микроскопа (XRM) (см. Таблицу материалов), достигая высокого разрешения изображения за счет вторичного оптического увеличения4. Было обнаружено, что изображения XRM столь же эффективны, как и анатомические срезы, проанализированные под световым микроскопом, для анализа организации и топологии тканей на границе паразит-хозяин (рис. 3). Применение фосфовольфрамата подчеркивает обилие ткани паренхимы, которая проявляется в ярко-белом тоне из-за высокого поглощения контрастного агента. Сосуды появляются в темно-сером тоне из-за низкого поглощения контраста. Исходя из этой цветовой разницы, можно наблюдать обилие паренхимы, окружающей сосудистое ядро гаусториума (рис. 3). Также наблюдаются сложные сосуды и тонкие нити паренхимы самого сосудистого ядра, особенно в продольных разрезах (рис. 3А-В). В поперечных сечениях сосудистое ядро легко наблюдать в виде двух сосудистых нитей, разделенных паренхимой (рис. 3D, E).

Figure 3
Рисунок 3: Эуфитоидный паразит гаусторий. Продольные (A-C) и поперечные (D-E) срезы через гаусторий наблюдали под световым микроскопом (A,E) и с помощью 3D-рентгеновской микроскопии после нанесения 3% раствора фосфовольфрамата с использованием вакуума (B-D). Красными контурами обозначена ткань паренхимы (par), а синими контурами – сосудистое ядро (vc). Hx: ксилема-хозяин. Hb: кора хозяина. Масштабные линейки = 500 мкм (A, E) и 2,5 см (B-D; размер вокселя = 2,8382 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Тот же подход был использован для введения контраста в стебель суккулентного растения-хозяина (Euphorbia polygona, Cactaceae), паразитирующего на V. minimum. Здесь в качестве контрастного вещества был выбран 1% раствор йода на основе предварительного гистохимического анализа, который показал, что клетки паренхимы эндопаразита хранят углеводы в виде крахмала (рис. 4А). В то же время клетки коры головного мозга хозяина не хранят обнаруживаемое количество крахмала (рис. 4B-D). После нанесения контраста образец сканировали с помощью системы микро-КТ Nikon X-Tek (см. Таблицу материалов). Разница в поглощении йода позволила обнаружить сложную сеть корковых нитей, образованных эндопаразитом в организме хозяина (рис. 4E). Следуя этой методологии, было обнаружено, что корковые нити концентрируются вокруг сосудистого центра хозяина и в конечном итоге разветвляются к периферии стебля хозяина, когда они связаны с появлением цветка-паразита (рис. 4F, G).

Figure 4
Рисунок 4: Тканевая сеть эндопаразитов. Анатомические (A) и макросрезы (B-D) показывают реакцию с 1% раствором йода, что указывает на то, что крахмал (окрашенный в черный цвет) присутствует в паренхиме (par), связанной с сосудами (ve) паразита. Поскольку крахмал отсутствует в коре головного мозга хозяина (Hc) и ксилеме (Hx), 1% растворы йода выборочно использовались для усиления контраста тканей корковой цепи паразита (фиолетовые контуры, E-G), видимых на фоне хозяина (H). Наличие цветка (Pf) подтверждает, что окрашенная ткань является частью структуры эндопаразита (A,F,G). Масштабные линейки = 0,25 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Во втором подходе, описанном здесь (этап 2.4), подающий резервуар, содержащий контрастный раствор, поднимают с уровня, в который помещен образец, таким образом, используя силу тяжести для прохождения раствора через образец. После контрастной перфузии сканирование проводилось с помощью системы микро-КТ Bruker Skycan (см. Таблицу материалов). Результаты, полученные для C. americana (рис. 5A, B) и S. martianus (рис. 5C-G), помогают проиллюстрировать удобство этого подхода как для малых, так и для больших образцов соответственно. Сравнение образцов, отсканированных до (рис. 5C, E) и после (рис. 5D, F) перфузии 1% раствора йода, подчеркивает важность нанесения контраста даже в образцах древесного гаустория. Примечательно, что в ассоциациях между C. americana и S. martianus (рис. 5) и их соответствующими хозяевами паразиты практически не содержат крахмала в своих тканях. Это объясняет различные результаты, описанные для эндопаразита V. минимум (рис. 4), в котором использовался один и тот же метод и тип контрастного раствора.

Figure 5
Рисунок 5: Паразитическая лоза и гаустория омелы. Продольные срезы через гаусторий паразитической лозы (А,В) и омелы (С-Г). Сравнение сканирования и макросреза свежего материала показывает, что сложная структура гаустория хорошо фиксируется при микро-КТ-сканировании (A, B). Сравнение фиксированных образцов до (C, E) и после (D, F) перфузии 1% раствора йода показывает, что контраст усиливается даже в одревесневших образцах, облегчая наблюдение за паразитными (P) структурами, такими как сосуды в эпикортикальном корне (розовые наконечники стрелок), сосудистые нити (синие наконечники стрелок) и грузило (желтые наконечники стрелок). Сосуды и годовые кольца ксилемы хозяина (Hx) и крахмала в коре хозяина (Hb) также легче наблюдаются. Масштабные линейки = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Конечным результатом, полученным с помощью описанного здесь протокола перфузии, является возможность обнаружения сосудистых связей между паразитами и растениями-хозяевами. Это было достигнуто путем перфузии 0,2% раствора нитрата свинца через сегмент корня-хозяина, вокруг которого развился клубень облигатного корневого паразита S. fungiforme. После применения контраста сканирование также проводилось с помощью системы микро-КТ Bruker Skyscan (см. Таблицу материалов). Последовательные проекции показывают, что сосуды в корне хозяина раздваиваются на клубень паразита (рис. 6A-C). После анализа этих результатов тот же образец был разрезан на меньшую подвыборку, подготовленную для анатомического исследования и проанализированную с помощью световой микроскопии. Серийное секционирование этого подобразца подтверждает, что непрерывность ксилемы между двумя растениями образована соединением сосуда с сосудом через перфорационные пластины (рис. 6D-F).

Figure 6
Рисунок 6: Облигатный корневой паразит гаусторий. Продольные срезы через гаусторий, наблюдаемые с помощью микро-КТ-сканирования (A-C), и анатомические срезы, наблюдаемые под световым микроскопом (D-F). Накопление 0,2% раствора нитрата свинца в сосудистой системе корня хозяина (Hr, розовый контур) позволяет наблюдать разветвление сосудов хозяина в трубке паразита (Pt) и обнаруживать прямую сосудистую связь между двумя растениями (пунктирный белый контур). Масштабные линейки = 1 см (A-C) и 500 мкм (D-F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование растворов тяжелых металлов для улучшения контраста тканей растений стало важным шагом в подготовке образцов для микро-КТ-анализа. Несколько соединений, обычно доступных в лабораториях микроморфологии растений, были протестированы Staedler et al., которые рекомендуют использовать фосфовольфрамат в качестве наиболее эффективного агента при проникновении в образцы и повышении индекса контрастности8. Результаты, полученные здесь при анализе гаустория P. pubera , подтверждают эту рекомендацию. Что касается применения контраста, Steadler et al. описывают, что контрастный раствор пассивно инфильтрировался через анализируемый материал (цветы и цветочные почки размером от 1 мм до 10 мм) в течение 1-8 дней8. Другие авторы использовали тот же протокол пассивной инфильтрации в течение длительных периодов времени (1-4 недели) при анализе более крупных образцов, таких как цветки шириной 30 см эндопаразитических видов Rafflesiaceae28. Хотя этот процесс оказался успешным, результаты, полученные с помощью описанного здесь протокола, показывают, что процесс инфильтрации может быть значительно ускорен в вакууме, тем самым улучшая ранее установленный метод. Вакуумная камера или насос заставляют воздух выходить из тканей растения, что облегчает проникновение контрастного раствора. Вакуум может быть применен даже к хрупким структурам, как показано здесь для гаустория P. pubera и мягких тканей суккулентного растения-хозяина E. polygona , паразитирующего на V. minimum. Кроме того, использование вакуумных насосов является распространенной процедурой инфильтрации фиксаторов или встраивания веществ во многие лаборатории микроморфологии растений, что делает этот протокол более доступным.

Тот же подход был использован здесь с контрастным веществом, которое избирательно окрашивает образцы, если присутствуют определенные соединения для хранения. При нанесении через вакуум или пассивную инфильтрацию селективное окрашивание может обеспечить худшее контрастное усиление всего образца по сравнению, например, с фосфовольфраматом. С другой стороны, это полезно для выделения определенных растительных структур или тканей. Как сообщалось здесь, в сочетании с предыдущим анатомическим или гистохимическим анализом использование селективных контрастных веществ, таких как йод, может помочь в дифференцировке паразитической растительной ткани в организме хозяина при условии, что либо паразит, либо хозяин (но не оба) проявляют обильные запасы крахмала. Показано, что селективное увеличение поглощения рентгеновских лучей тканями паразита особенно полезно для изучения впервые сложной трехмерной сети, образованной эндопаразитическим растением, таким как V. minimum в стебле растения-хозяина. Кроме того, следует отметить, что эндопаразитические растения и некоторые грибы демонстрируют интересную эволюционную конвергенцию, растущие «инкогнито» внутри своих хозяев на протяжении большей части своих жизненных циклов, появляясь только в течение коротких периодов29. Таким образом, потенциальное новое применение описанного здесь протокола будет заключаться в использовании флоксина B, красителя, содержащего бром30, для обнаружения эндофитных грибов в тканях растений. Было показано, что эозин, еще один раствор для окрашивания на основе брома, редко используемый для растительных тканей, усиливает контраст в образцах почек мышей, проанализированных с использованием специальной системымикро-КТ 31.

Другим подходом, описанным в этом протоколе, является перфузия контрастных агентов через сосудистую ткань стебля или корня хозяина. Этот подход, который значительно отличается от ранее описанных методов, основан на работе Sperry et al., которые перфузировали образцы древесины красителем сафранином для анализа гидравлической проводимости32. Как обсуждалось авторами и подчеркивалось здесь, критическим шагом в протоколе является настройка устройства для перфузии пятен, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в систему32. Трехходовые клапаны могут временно отклонять поток раствора и устранять пузырьки из жидкого комлюмна32. Тем не менее, эмболы могут присутствовать внутри сосудов растения-хозяина, вызванные либо искусственно во время отбора проб, либо естественным путем из-за в целом высоких скоростей транспирации паразитических растений33,34. Это может серьезно снизить эффективность перфузии, что приведет к тому, что контраст в образце не улучшится. Чтобы предотвратить эту проблему, важно применять вакуум от низкого до умеренного при фиксации образца после отбора проб. Кроме того, фиксированный образец может быть промыт под высоким давлением с использованием фиксирующего раствора, в котором хранится образец. Промывка может помочь восстановить проводимость в образце путем удаления пузырьков32 воздуха, тем самым расчищая путь для перфузии контрастного раствора. При работе со свежим материалом попадания пузырьков воздуха в установку можно избежать, погрузив образец в воду сразу после отбора проб, затем снова разрезав его под водой и сгладив торцевую поверхность острыми лезвиями35.

Следуя этому подходу, 1% раствор йода перфузировали через гаусторий C. americana и S. martianus для усиления контраста интерфейса хозяин-паразит в целом. Результаты, полученные для этих видов, показывают, что описанный здесь протокол перфузии хорошо работает как для свежих, так и для фиксированных образцов, и что введение контрастных растворов улучшает визуализацию даже в одревесневших образцах. Эти наблюдения согласуются с результатами, представленными Тейшейра-Коста иЧеккантинти 17, которые использовали тот же подход для применения 0,2% раствора нитрата свинца для визуализации конкретных аспектов структуры гаустория. При контакте с углекислым газом нитрат свинца вступает в реакцию с образованием высоконерастворимого осадка, состоящего из кристаллов карбоната свинца, которые эффективно поглощают рентгеновские лучи 8,36. После перфузии в сосудистую ткань образца этот осадок закупоривает сосудистые ямки, позволяя раствору течь только через прямые соединения сосуда с сосудом через перфорационные пластины. Следуя этому подходу, наличие прямых соединений ксилемы паразит-хозяин через перфорационные пластины показано здесь для S. fungiforme и подтверждено подробным анатомическим анализом. Эти результаты подчеркивают дальнейшее применение этого подхода для проверки функциональности гаустория. Учитывая, что инициация гаустория может не привести к развитию полностью функционального органа либо из-за несовместимости паразита-хозяина, либо из-за резистентности хозяина к паразиту, подход, описанный здесь, может быть использован для проверки того, образуются ли сосудистые связи между двумя растениями, приводящие к возникновению эффективного паразитизма. Учитывая ценность использования микро-КТ-сканирования для исследования эмболии ксилемы в более широком смысле12,37, представленный здесь протокол также может улучшить визуализацию и количественный анализ эмболии ксилемы у других видов растений, не являющихся паразитами.

В заключение, этот протокол приближается к одному из важнейших достижений, ожидаемых в микротомографии растений, который применяет контрастные агенты для дифференциации структур с низким поглощением рентгеновского излучения24. Как показано здесь, контрастные растворы могут значительно улучшить визуализацию структур гаустория на границе раздела между растениями-паразитами и их хозяевами. Различные соединения могут быть выбраны в соответствии с их специфичностью при взаимодействии с резервными соединениями, такими как крахмал, который часто по-разному распределяется между тканями паразита и хозяина. Подход к нанесению контраста в образцы гаустория также может быть выбран для исследования специфических особенностей интерфейса паразит-хозяин, таких как прямое соединение сосуда с сосудом. Кроме того, этот протокол также может быть применен к непаразитическим видам, потенциально улучшая обнаружение эндофитных грибов и количественную оценку эмболии ксилемы. В любом приложении описанный здесь протокол для улучшения микротомографического анализа может быть объединен с другими инструментами, такими как оптическая проекционная томография и автоматизированная виртуальная сегментация, чтобы обеспечить новое и захватывающее понимание трехмерного развития связи между этими растениями и их хозяевами38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автору раскрывать нечего.

Acknowledgments

Я хотел бы поблагодарить д-ра Симону Гомес Феррейру (Лаборатория микротомографии, Университет Сан-Паулу, Бразилия) и д-ра Грега Лина (Центр наноразмерных систем, Гарвардский университет, США) за их первостепенную помощь и незаменимую подготовку пользователей для работы с различными системами микротомографии и программным обеспечением для анализа данных. Я также благодарю сотрудников EEB Greenhouse в Университете Коннектикута (США), особенно Клинтона Морса и Мэтью Опеля за предоставление образцов минимума Viscum. Д-р Джон Венцель предоставил возможность и большую помощь в отборе проб Pyrularia pubera. Магистры наук Каролина Бастос, магистр наук Ясмин Хирао и Талита Мотта очень помогли с отбором проб Scybalium fungiforme. Магистр наук Ариадна Фуртадо и доктора Фернанда Оливейра и Мария Алин Невес предоставили ссылку на использование флоксина B для анализа эндофитных грибов. Видеозапись в Vrije Universiteit Brussel стала возможной благодаря помощи доктора Филиппа Клэйса, доктора Кристофа Сноука, магистра наук Джейка Гриффита, доктора Барабары Веселки и доктора Гарри Олде Вентеринка. Финансирование осуществлялось Координационным центром по совершенствованию кадров высших учебных заведений (CAPES, Бразилия) и Гербарием Гарвардского университета (США).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D X-ray microscope (XRM) system Zeiss Versa 620 used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22 Zeiss Versa 620 Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software Nikon version XT 3.1.11 Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software Bruker version 3.3.1 Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software Object Research Systems - ORS version Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials Glass Vials Inc. SE V2708C-FM-SP Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X Zeiss version XT 3.1.11 Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N WR Chemicals BDH BDH7422-1 Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g Vetec 361.08 Sold by SPLab
Microtomography scanner Bruker Skyscan1176 Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner Nikon X-Tek HMXST225 Used for scanning the species V. minimum
NRecon software Bruker version 1.0.0 Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution Electron Microscopy Sciences 101410-756 Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm) Heathrow Scientific PM996 Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL Taylor 3478 Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4'' Nalge Nunc International SC63013-164 Sold by VWR - USA
Scanning system Nikon X-Tek HMXST225 used to scan Viscum minimum
Scanning system Bruker Skyscan 1176 used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software Zeiss version 16 Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve ToToT DMTWVS-5 Sold by Amazon USA
Two-part syringe HSW Henke-Ject 4850001000 Used without the plunger
Vacuum chamber Binder 80080-434 Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software Volume Graphics version 3.0 Used for analyses and acquisition of images and videos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. The Biology of Parasitic Flowering Plants. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 179 Микротомография гаусторий голопаразит эндопаразит Cuscuta омела цитохимия
Использование микро-КТ-сканирования для анализа паразитических взаимодействий между растением и хозяином
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teixeira-Costa, L. Leveraging… More

Teixeira-Costa, L. Leveraging Micro-CT Scanning to Analyze Parasitic Plant-Host Interactions. J. Vis. Exp. (179), e63423, doi:10.3791/63423 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter