Summary
マイクロCTは、植物の構造を3次元で解析できる非破壊ツールです。本プロトコルは、寄生植物の構造と機能を分析するためにマイクロCTを活用するためのサンプル調製について説明しています。特定の調製物と組み合わせた場合のこの方法の利点を強調するために、異なる種が使用される。
Abstract
マイクロCTスキャンは、植物の構造と機能を調査するための確立されたツールになりました。その非破壊的な性質は、3次元の視覚化と仮想セクショニングの可能性と相まって、複雑な植物器官の斬新でますます詳細な分析を可能にしました。寄生植物とその宿主の間を含む植物間の相互作用も調査できます。ただし、スキャン前のサンプル調製は、組織組織や組成が異なることが多いこれらの植物間の相互作用のために重要になります。さらに、高度に減少した栄養体から樹木、ハーブ、低木に至るまで、寄生顕花植物の幅広い多様性は、寄生虫宿主材料のサンプリング、処理、および調製中に考慮する必要があります。ここでは、寄生虫および/または宿主植物にコントラスト溶液を導入するための2つの異なるアプローチが、吸器の分析に焦点を当てて説明されています。この器官は、2つの植物間のつながりとコミュニケーションを促進します。簡単なアプローチに従って、ユーストリウム組織組織の詳細を、真正植物、つる、ヤドリギの寄生種についてここに示すように、3次元で探索することができます。特定の造影剤と適用アプローチを選択することで、宿主体内での内部寄生虫の広がりを詳細に観察し、寄生生物と宿主の間の直接的な血管間接続を検出することもできます。したがって、ここで説明するプロトコルは、寄生顕花植物の幅広い多様性に適用して、それらの発達、構造、および機能の理解を進めることができます。
Introduction
高解像度X線マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)は、サンプルの複数のX線写真(投影)を異なる視野角から記録し、後でサンプル1の仮想再構成を提供するイメージング方法です。この仮想オブジェクトは、分析、操作、およびセグメント化できるため、3次元での非破壊的な探索が可能になります2。当初は医療分析用に設計され、後に産業用途向けに設計されたマイクロCTは、侵襲的な手順を必要とせずに内臓や組織を視覚化できるという利点も提供します3。他の形式のイメージングと同様に、マイクロCTは視野とピクセルサイズのトレードオフを伴うため、大きなサンプルの高解像度イメージングはほとんど達成できません4。高エネルギーX線源(すなわち、シンクロトロン)および二次光学倍率の使用の進歩は絶えず行われており、最小分解能は100nm未満に達することができる5,6。それにもかかわらず、大きなサンプルではより長いスキャン時間が必要であり、サンプルの移動やスキャナー内の変形によるアーチファクトの可能性が高まります。さらに、マイクロCTは一般に、サンプル内の自然な密度変動と、サンプルがX線とどのように相互作用するかによって制限されます。密度の高いサンプルを透過するには、より高いX線量が最適ですが、サンプルとその周囲の媒体の内部および間の密度の変動をキャプチャするには効率が低くなります7。一方、X線量が少ないほど浸透力が低くなり、多くの場合、スキャン時間が長くなりますが、密度検出の感度が高くなります7。
これらの制限は、ほとんどの植物組織がX線吸収の低い軽い(非高密度)組織で構成されていることを考えると、植物科学のためのマイクロトモグラフィーの使用を長い間妨げてきました8。マイクロCTの最初のアプリケーションは、土壌マトリックス内の根のネットワークのマッピングに焦点を当てていました9,10。その後、木材など、組織密度により大きな違いがある植物の構造が調査され始めました。これにより、木部機能11,12、複雑な組織組織の開発13、14、および植物間の相互作用15、16、17の調査が可能になりました。植物サンプルのマイクロCTスキャンの準備における標準的な手順である造影剤により、柔らかく均質な組織の分析が普及しています。ただし、コントラスト導入のプロトコルは、サンプル量、構造特性、および使用する溶液の種類に応じて異なる結果をもたらす可能性があります8。理想的には、造影剤は、異なる組織間の区別を強化し、組織/臓器の機能評価を可能にし、および/または組織に関する生化学的情報を提供するべきである18。したがって、スキャン前の適切なサンプル処理、準備、および取り付けは、マイクロCT分析にとって重要になります。
寄生植物吸器のマイクロCT
寄生顕花植物は、 ハウストリウム19として知られる器官によって特徴付けられる被子植物の明確な官能基を表す。この多細胞器官は、改変された茎と根との間の発生ハイブリッドであり、宿主の付着、侵入、および寄生虫による接触に作用する20。このため、ハウストリアムは「植物間の寄生のアイデアそのものを体現している」と考えられています21。この器官の発達、構造、および機能の詳細な理解は、寄生植物の生態学、進化、および管理研究にとって非常に重要です。それにもかかわらず、寄生植物の全体的な複雑さと高度に変更された構造と吸器は、詳細な分析と比較を妨げることがよくあります。また、ハウストリウムの接続は通常広範囲に及び、組織や細胞の分布が均一ではありません(図1)。これに関連して、小さな組織片を扱うことはより簡単な操作およびより高い解像度を可能にするが、寄生植物吸器のような複雑な構造の三次元構造についての誤った結論につながる可能性がある。
ほとんどの寄生植物種の吸器の解剖学と超微細構造に関する膨大な文献がありますが、寄生虫と宿主組織の間の3次元構成と空間的関係は十分に調査されていません17。増本らによる最近の研究では、300を超える連続した半薄ミクロトーム切片が画像化され、2つの寄生虫種の吸器を表す3次元仮想オブジェクトに再構築されました。この方法の優れた詳細レベルは、吸器の細胞および解剖学的3D構造に関する前例のない洞察を提供します。しかしながら、そのような時間のかかる技術は、より広範な吸器接続を有する寄生虫における同様の分析を禁じるであろう。マイクロCTの使用は、寄生植物の複雑でしばしばかさばる吸器の三次元分析のための優れたツールとして浮上しています。詳細な解剖学的切片やその他の補完的な形式の顕微鏡分析17,23に代わるものではありませんが、マイクロCTスキャン、特に大きなサンプルで得られた結果は、共焦点顕微鏡や電子顕微鏡などの他のツールを使用して分析したり、高解像度マイクロCTシステムで再分析したりできる、より小さなセグメントのサブサンプリングを指示するためのガイドとしても役立ちます。
図1:このプロトコルで使用される異なる官能基の寄生植物。 真正虫寄生虫 Pyrularia pubera (A)、緑色の果実(破線の黒い円)を持つ内部寄生虫 Viscum minimum (B)、寄生つる Cuscuta americana (C)、ヤドリギ Struthanthus martianus (D)、偏性根寄生虫 Scybalium fungiforme (E)。宿主根(Hr)または茎(Hs)のセグメントは、寄生虫吸器(P)への造影剤の適用を容易にする。サンプル中に寄生虫の母根/茎(矢印)が存在するため、ハウストリウム血管の構成を分析できます。長方形は、分析に使用されるサンプルのセグメントを示します。スケールバー = 2 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
マイクロCTが植物科学でますます普及する技術になるにつれて、サンプルスキャン、3次元再構成、セグメンテーション、および分析を扱うガイド、プロトコル、および文献があります3,10,24。したがって、これらの手順についてはここでは説明しません。他の想像技術と同様に、サンプルの適切な処理とマウントは基本ですが、見過ごされがちな手順です。このため、このプロトコルは、マイクロCTスキャン用のハウストリウムサンプルの調製に焦点を当てています。より具体的には、このプロトコルは、吸器サンプルに造影剤を導入して、吸器内のさまざまな組織および細胞タイプの視覚化を改善し、宿主の根/茎内の寄生組織の検出を容易にし、寄生虫と宿主の血管接続を3次元で分析するための2つのアプローチについて説明します。ここに記載されている調製物は、他の植物構造の分析にも適合させることができる。
ここで説明するプロトコルの利便性をよりよく説明するために、5つの種が使用されました。それぞれの種は寄生顕花植物の5つの機能グループの1つを表し、したがって各グループの機能に関連する特定のポイントに対処します。 Pyrularia pubera (サンタラ科)は、地面で発芽し、寄生虫を宿主の根に接続する複数の吸器を形成する真正寄生虫を表すために選択されました25。これらの植物によって作られた吸器は、しばしば希薄であり、宿主26 から容易に引き裂かれ(図1A)、したがって、より繊細な取り扱いプロセスを必要とする。内部寄生虫は、ここではビス カムミニマム(ビス カ科)で表されます。この機能群の種は、宿主の体外で短期間しか見えず(図1B)、宿主組織内に埋め込まれた細胞の有意に減少した菌糸様鎖としてライフサイクルのほとんどを生きる25。第3の機能群は寄生ブドウ植物を含み、これは地上で発芽するが、宿主植物の茎 に付着する複数の吸器に依存して、初歩的な根のみを形成する(図1C)。ここで、この官能基は クスクタアメリカーナ (コンボルブラ科)によって表される。寄生するブドウの木とは対照的に、ヤドリギは宿主植物の枝に直接発芽し、複数または孤立した吸器を発達させます25。この機能グループを説明するために選択された種は、宿主枝とさまざまな接続を形成する Struthanthus martianus (ロランサス科)です(図1D)。マイクロCTと光学顕微鏡の組み合わせを用いた孤立性ヤドリギ・ハウストリアの分析は、Teixeira-Costa & Ceccantini17で見ることができる。最後に、絶対根寄生生物は、地上で発芽し、宿主植物の根を貫通する種で構成され、最も初期の成長段階から完全に依存しています25。これらの植物は、ここでは大きな塊茎のような吸器を生成する Scybalium fungiforme (バラノフォラ科)によって表されます(図1E)。
このプロトコルで使用された全ての植物試料を、70%ホルマリン酢酸アルコール(FAA 70)中で固定した。サンプリング時の固定は、特にその後の解剖学的分析が必要な場合に、植物組織を保存するために重要です。寄生植物吸器の場合、この器官は主に木化していない実質細胞20で構成されることが多いため、固定も不可欠です。固定液の調製を含む植物組織固定の詳細なプロトコルは、他の場所27で見つけることができます。一方、多かれ少なかれ、固定剤はサンプルの物理的および化学的特性の変化を引き起こす可能性があり、特定の生体力学的および組織化学的分析には適していません。したがって、新鮮なサンプル、すなわち調製直前に収集された非固定材料も、このプロトコルと共に使用することができる。新鮮なサンプルの取り扱い方法の詳細と、固定された材料のトラブルシューティングの提案は、ディスカッションセクションに記載されています。
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Protocol
1.寄生植物のサンプル選択
- 付着した宿主の茎/根、および寄生した宿主器官の近位端と遠位端の両方のセグメントを含む、寄生植物吸器全体を収集します。各セグメントの理想的な長さは、ハウストリアムの直径の2倍に相当します。
注:外側吸器の場合は、吸器が形成された寄生虫の母茎/根の一部を含めます(図1A、B、D)。内部寄生虫の場合は、寄生虫の兆候が見られる宿主の茎/根のセグメントを収集します(図1B)。ターミナル接続の場合は、プラント全体を収集する必要があります(図1E)。 - サンプル全体を1:10の体積比で固定液(FAAなど)に浸します(サンプル:固定液)。サンプル27のサイズに応じて、サンプルを少なくとも1日間固定液に入れておく。
注:サンプルは、スキャン前に固定液に保存するか、保存溶液(エタノール70%など)に移すことができます。その後の解剖学的分析が保証されない場合、新鮮なサンプルも使用できます(ディスカッションセクションを参照)。新鮮な材料を扱う場合は、造影剤溶液を灌流するように装置をセットアップしてから、サンプルを収集します。サンプルを乾燥させないでください。
2.対照的なソリューションの適用
- 使用する申請方法を選択します。真空法(ステップ2.3)は、小さなサンプル(図1A)または非木質(図1B)のサンプルに使用します。より大きなサンプルには、宿主の幹/根のセグメントが含まれている場合に灌流法を使用します(図1A、C-E)。
- 次の手順で選択したアプローチに関係なく、サンプルを操作するときは、ゴム手袋やその他の適切な個人用保護具(白衣など)を着用してください。
注意: すべての対照的な溶液には、組成に重金属塩が含まれているため、適切な個人用保護具なしで、ドラフトの下で取り扱わないでください。 - 真空法の場合は、以下の手順に従ってください。
- 適切なバイアルを選択し、ラベルを付けます。バイアルは、サンプルと対照溶液を収容するのに十分な大きさでなければならず、通常は1:10の割合でなければなりません。製造元の指示に従って、バイアルが低真空から中程度の真空に耐えられることを確認してください。
注意: 負圧(真空)によって液体がこぼれる可能性があるため、バイアルを縁まで満たさないでください。 - 対照溶液(1%ヨウ素または3%リンタングステン酸、 材料表を参照)とともにサンプルをバイアルに入れます。次に、バイアルを真空チャンバーまたは真空ポンプに接続されたデシケーターに入れます。バイアルから蓋を外し、真空チャンバーまたはデシケーターを閉じます。
- 真空チャンバー/デシケーターに亀裂がないこと、および真空ポンプに十分なオイルがあることを確認してください。
- ポンプの排気バルブを閉じて空気がスケープするのを防ぎ、チャンバー/デシケーターの排気バルブを開いて空気を押し出します。
- ポンプの電源を入れ、圧力が約20インチHgに達するまで待ちます。
注意: このプロセスは通常高速であるため、真空システムを放置しないでください。
注意: 圧力のメートル法の単位はパスカル(Pa)ですが、ほとんどの実験室用真空ポンプの圧力計は、水銀柱インチ(「Hg」)、ポンド/平方インチ(psi)、またはバーで圧力を表示します。20インチHgは約67.7 Pa、10 psi、または0.7バールに相当します。 - チャンバー/デシケーター排気バルブを閉じて空気が再侵入しないようにしてから、ポンプをすばやくオフにします。
- サンプルを真空下に少なくとも2時間放置します。サンプルが大きいほど、対照的な溶液が浸透するのに時間がかかります。
- 所望の期間の後、対照溶液からサンプルを取り出し、スキャン用に準備する。
- チャンバー/デシケーター排気バルブをゆっくりと開いて、空気が入るようにします。
- チャンバー/デシケーター内の圧力が完全になくなるのを待って(つまり、圧力計が0近くに達する)、慎重に開いてサンプルを取り出します。
- 造影剤を適切に廃棄し、スキャンの準備としてサンプルを保管してください。
- 適切なバイアルを選択し、ラベルを付けます。バイアルは、サンプルと対照溶液を収容するのに十分な大きさでなければならず、通常は1:10の割合でなければなりません。製造元の指示に従って、バイアルが低真空から中程度の真空に耐えられることを確認してください。
- 灌流法については、以下の手順に従ってください。
- サンプルのサイズに応じて、コントラスト溶液の供給タンクを選択します。少量のサンプルには50 mLシリンジ(針やプランジャーなし)を使用し(図2A)、大きなサンプルには1 Lの静脈内医療キットを使用します(図2B)。
- 透明なプラスチックチューブ( 材料表を参照)の一方の端を供給タンクに接続し、もう一方の端を双方向または三方バルブに接続します。2番目のチューブをバルブの別の出口に接続します(図2A、B)。
- 前の手順でセットアップした装置を分解せずに、供給タンクを高い位置に固定します。
注意: タンクとサンプルの間の垂直距離によって、溶液灌流圧力が決まります(図2B)。小さなサンプルには20〜50 cmの距離で十分です。大きなサンプルの場合は、1 mの距離がより適切です。 - 三方弁(図2C)または二方弁(図2D)を閉じて、液体がチューブシステムから出ないようにしてから、対照的な溶液を供給タンクに注ぎます。静脈内医療キットを使用する場合は、バッグに溶液を入れ、バルブを閉じてから、装置を高い位置に固定してください。
- チューブシステムに沿って大きな気泡が形成されていないことを確認します(図2E)。必要に応じて、気泡が除去されるまで造影剤溶液をチューブから流出させます。バルブを再度閉じ、装置をそのままにしておきます。
- 造影剤溶液を灌流するためのサンプルを準備するには、それを液体(水、エタノール、または固定液)に浸したままにし、サンプルの宿主の幹/根の近位端の先端を切り取ります(図2F)。
- 保存した液体からサンプルを取り出し、乾燥を避けるためにパラフィンフィルムで包みます。サンプルを近くに置き、装置に接続できるようにしてください。
- バルブを慎重に開いて、対照的な溶液がゆっくりと流れるようにし、対照的な溶液がこぼれないようにシステムの開放端をわずかに高い位置に保持しながら、タンクに接続されているプラスチックチューブを満たします。繰り返しになりますが、チューブに沿って大きな気泡が発生しないようにしてください。
- サンプルの宿主ステム/根の近位端をチューブシステムの開放端に接続します(図2B、拡大領域)。このステップでは、システムに気泡を持ち込まないでください。必要に応じて、サンプルを装置から切り離し、溶液を流してシステムから気泡を取り除きます。
- サンプルを装置に接続したまま、実験を設定した領域に対照溶液が漏れないように容器に入れます。さまざまな直径のチューブ、プラスチック製のジップタイ、およびバルブアダプター(図2G)を使用して、装置内のすべての接続が適切に適合し、さまざまなサイズのホストブランチに対応し、溶液がチューブシステムから漏れていないことを確認します(図2B、拡大領域)。
- 溶液にサンプルを少なくとも2時間、または溶液が容器内に蓄積するまで灌流させます。
- バルブを閉じ、サンプルを装置から慎重に外します。残りの溶液を容器に排出し、適切に廃棄します。
- スキャンの準備として、サンプルからパラフィンフィルムを取り除きます。
図2:造影剤塗布のための灌流アプローチ。 灌流装置の小型(A)および大型(B)バージョンは、供給タンク(st)およびバルブ(va)によって接続された2つのプラスチックチューブ(t1およびt2)を含む。吸器(ha) を介して それに付着した寄生虫(P)を有する宿主ステム(H)の近位端は、系の開放端(B、拡張)に接続されている。三方(C)または二方(D)バルブは、対照的な溶液(E)の通過を妨げるチューブシステム内の気泡の形成を防ぐために使用されます。宿主ステム(H)の近位端の先端は、造影剤溶液(F)の通過を可能にするために水中で切断される。ジップタイ、バルブアダプター、およびさまざまな直径のチューブは、より緊密な接続を確保し、システム内の漏れを防ぐのに役立ちます(G)。図2B、D、FはBioRenderで作成されたものです。スケールバー = 2 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. サンプルの調製と埋込
- サンプルを水に2分間浸して洗浄します。
注意: すべての対照的な溶液には組成に重金属塩が含まれているため、シンクでサンプルを洗わないでください。洗浄に使用する水は希釈した対照液と考え、適切に廃棄してください。 - サンプルを室温のペーパータオルに入れて、サンプルのサイズに応じて2〜5分間余分な水分を蒸発させます。または、ペーパータオルを使用してサンプルをわずかに乾燥させます。サンプルを完全に乾かさないでください。
- サンプルを薄層に伸ばしてパラフィンフィルムで包みます。サンプルの上にパラフィンフィルムを折りたたむことは避けてください。
- 包まれたサンプルをサンプルホルダーに取り付け、スキャン中に回転している間、サンプルを安定させて所定の位置に保ちます。粘着テープ、低密度フォーム、ピペットチップ、および/または透明なプラスチック容器を使用して、サンプルを所定の位置に固定します。
- サンプルをスキャンし、利用可能なマイクロCTシステム用に確立された特定のプロトコルとガイドラインに従って画像を分析します。
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Representative Results
寄生植物の吸器は、宿主20として使用される、別の植物の組織と絡み合って接続する異なる組織および細胞型を含む複雑な器官である。マイクロCTスキャンは、小さな(図1A-C)と大きな(図1D、E)の吸器の両方を分析する際に、この複雑な構造を非破壊的かつ3次元的な方法でよりよく理解するために活用できます。これを行うために、対照的な溶液を寄生虫-宿主界面に適用することができ、したがって、そうでなければ低く均質なX線吸収を有するサンプルを分析することを可能にする。このプロトコルで説明されている2つの簡単なアプローチは、サンプルへの浸透を促進するために対照的な溶液を加圧することに依存しています。予想通り、ここで説明するプロトコルは、さまざまなマイクロCTシステムで機能します。ただし、スキャン設定とパラメータは、システムと分析サンプルによって異なります(表1)。
| 官能基 | 真正虫寄生虫 | 内部寄生虫 | 寄生つる | ヤドリギ(コントラストの前/後) | 絶対根寄生虫 |
| 種(家族) | ピラリア・プベラ | 最小ビスカム | クスクタアメリカーナ | ストルタンサス・マルティアヌス | シバリウム菌目 |
| 家族 | ビャクダン科 | ビスカ科 | ヒルガオ科 | ロランサス科 | ツチトリモチ科 |
| コントラストソリューション | 3%ホスホタングステン酸塩 | 1%ヨウ素 | 1%ヨウ素 | 1%ヨウ素 | 0.2%硝酸鉛 |
| 応募方法 | 真空 | 真空 | 灌 流 | 灌 流 | 灌 流 |
| マイクロCTシステム | ツァイスヴァーサ620 | ニコンX-テックHMXST225 | ブルカースカイスキャン1176 | ブルカースカイスキャン1176 | ブルカースカイスキャン1176 |
| 予測 | 4500 | 3140 | 610 | 1200 / 2400 | 5300 |
| フレーム | 1 | 1 | 3 (平均) | 3 / 3 (平均) | 3 (平均) |
| ばく露(ミリ秒) | 5000 | 1000 | 680 | 1600 / 830 | 750 |
| フィルター(ミリメートル) | 何一つ | アル0.25 | アル1.0 | アル 1.0 / アル 1.0 | 何一つ |
| 電圧(kV) | 60 | 85 | 35 | 90 / 45 | 40 |
| 電流 (μA) | 108 | 80 | 375 | 180 / 390 | 600 |
表1:分析されたサンプルのスキャン設定とパラメータ。
造影剤適用のための最初のアプローチ(ステップ2.3)に続いて、真空を使用して、真正寄生虫P.puberaの吸器を3%リンタングステン酸溶液で2時間灌流しました。次に、サンプルを3D X線顕微鏡(XRM)システム(材料表を参照)でスキャンし、二次光学倍率4を介して高い画像解像度を達成しました。XRM画像は、寄生虫-宿主界面での組織組織とトポロジーを分析するために光学顕微鏡で分析された解剖学的切片と同じくらい効果的であることが観察されました(図3)。リンタングステン酸塩の使用は、造影剤の高い吸収のために明るい白色の色調で現れる豊富な実質組織を強調する。血管はコントラストの吸収が低いため、濃い灰色の色調で表示されます。この色の違いに基づいて、吸器の血管コアを取り巻く実質の存在量を観察することができます(図3)。血管コア自体の複雑な血管および細い実質ストランドも、特に縦断面で観察される(図3A〜C)。断面では、血管コアは実質によって分離された2本の血管鎖として容易に観察されます(図3D、E)。
図3:真正寄生虫ハウストリウム。ハウストリウムを通る縦方向(A-C)および横方向(D-E)切片を光学顕微鏡(A、E)および真空(B-D)を使用して3%リンタングステン酸溶液を塗布した後の3D X線顕微鏡で観察しました。赤い輪郭は実質組織(par)を示し、青い輪郭は血管コア(vc)を示します。Hx:ホスト木部。Hb:宿主の樹皮。スケールバー = 500 μm (A, E) および 2.5 cm (B-D; ボクセル サイズ = 2.8382 μm)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
同じアプローチを使用して、V. minimumによって寄生された多肉植物(ユーフォルビアポリゴナ、サボテン科)の茎にコントラストを導入しました。ここでは、予備的な組織化学的分析に基づいて造影剤として1%ヨウ素溶液が選択され、これは、内部寄生虫の実質細胞がデンプンの形で炭水化物を貯蔵することを示した(図4A)。同時に、宿主皮質の細胞は、検出可能な量のデンプンを貯蔵しない(図4B−D)。造影剤塗布後、ニコンX-TekマイクロCTシステムを使用してサンプルをスキャンしました(材料表を参照)。ヨウ素吸収の違いにより、宿主体内の内部寄生虫によって形成された皮質鎖の複雑なウェブの検出が可能になりました(図4E)。この方法論に従うと、皮質鎖は宿主の血管中心の周りに集中し、寄生虫の花の放出に関連する場合、最終的には宿主の茎の周辺に向かって分岐することが観察されました(図4F、G)。
図4:内部寄生虫組織ネットワーク。解剖学的(A)およびマクロ(B-D)切片は、1%ヨウ素溶液との反応を示し、デンプン(黒く染色)が寄生虫の血管(ve)に関連する実質(par)に存在することを示しています。デンプンは宿主皮質(Hc)および木部(Hx)に存在しないため、1%ヨウ素溶液を選択的に使用して、宿主の背景(H)に対して見られる寄生虫皮質鎖組織(紫色の輪郭、E-G)のコントラストを強調しました。花(Pf)の存在は、染色された組織が内部寄生虫構造(A、F、G)の一部であることを確認します。スケールバー = 0.25 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ここで説明する2番目のアプローチ(ステップ2.4)では、対照的な溶液を含む供給タンクをサンプルが配置されているレベルから持ち上げ、重力を使用してサンプルを通る溶液の通過を駆動します。造影剤灌流後、スキャニングはブルカースカイカンマイクロCTシステムを用いて行った(材料表参照)。C. americana(図5A、B)およびS. martianus(図5C-G)について得られた結果は、それぞれ、小規模サンプルと大規模サンプルの両方に対するこのアプローチの利便性を説明するのに役立ちます。1%ヨウ素溶液の灌流前(図5C、E)と後(図5D、F)でスキャンしたサンプルを比較すると、木質吸器サンプルでも造影剤塗布の重要性が強調されます。C. americanaとS. martianusの両方(図5)とそれぞれの宿主との関連において、寄生虫はそれらの組織中にデンプン含有量をほとんどまたはまったく持たないことは注目に値する。これは、同じ方法およびタイプの造影剤溶液を使用したエンド寄生虫V.最小値(図4)について記載された異なる結果を説明する。
図5:寄生ツルとヤドリギの吸器。 寄生つる(A、B)とヤドリギ(C-G)の吸器を通る縦断面。新鮮な材料のスキャンとマクロ切片を比較すると、複雑な吸器構造がマイクロCTスキャン(A、B)でよく捉えられていることがわかります。1%ヨウ素溶液灌流前(C,E)と後(D,F)の固定試料を比較すると、木質化した試料でもコントラストが強くなり、皮質上皮根の血管(ピンクの矢じり)、血管鎖(青い矢じり)、シンカー(黄色の矢じり)などの寄生虫(P)構造の観察が容易になりました。宿主木部の血管および年輪(Hx)および宿主樹皮中のデンプン(Hb)もまたより容易に観察される。スケールバー = 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ここに記載されている灌流プロトコルで得られる最終結果は、寄生虫と宿主植物との間の血管接続を検出する可能性です。これは、偏性根寄生虫S. fungiformeの塊茎が発達した宿主根のセグメントを通して0.2%硝酸鉛溶液を灌流することによって達成された。造影剤塗布後、ブルカースカイスキャンマイクロCTシステム(材料表参照)を用いてスキャンも行った。逐次投影は、宿主根の血管が寄生虫塊茎に分岐することを示しています(図6A-C)。これらの結果の分析に続いて、同じサンプルをより小さなサブサンプルに切断し、解剖学的研究のために準備し、光学顕微鏡を使用して分析しました。このサブサンプルの連続切片作成により、2つのプラント間の木部連続性が、穿孔プレートを介した容器間接続によって形成されることが確認されます(図6D-F)。
図6:絶対根寄生虫吸器。マイクロCTスキャンで観察されたハウストリアムを通る縦切片(A-C)と光学顕微鏡で観察される解剖学的切片(D-F)。宿主根の血管系内に0.2%硝酸鉛溶液が蓄積(Hr、ピンクの輪郭)することで、寄生虫管(Pt)内で分岐する宿主血管の観察と、2つの植物間の直接的な血管接続の検出(白い破線の輪郭)が可能になります。スケールバー= 1センチメートル(A-C)および500μm(D-F)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
植物組織のコントラストを改善するための重金属溶液の使用は、マイクロCT分析のためのサンプル調製における重要なステップとなっています。植物のマイクロ形態学研究所で一般的に入手可能ないくつかの化合物がStaedlerらによってテストされており、サンプルの浸透とコントラスト指数の増加に最も効果的な薬剤としてリンタングステン酸を使用することを推奨しています8。P. puberaの吸器の分析でここで得られた結果は、この勧告を裏付けています。造影剤の適用に関して、Steadlerらは、造影剤溶液が1〜8日間、分析された材料(1mmから10mmの範囲の花および花芽)を通して受動的に浸潤したと説明している8。他の著者は、内部寄生性のラフレシア科種の幅30 cmの花など、より大きなサンプルを分析するときに、長期間(1〜4週間)にわたる受動的浸潤の同じプロトコルを使用しています28。このプロセスは成功していることが証明されていますが、ここで説明するプロトコルで得られた結果は、浸透プロセスが真空下で大幅に加速され、以前に確立された方法が改善されることを示しています。真空チャンバーまたはポンプは、空気を植物組織から強制的に逃がし、造影剤溶液の浸透を容易にします。真空は、P. puberaの吸器およびV. minimumによって寄生された多肉植物E. polygonaの軟組織についてここに示されているように、脆弱な構造にも適用することができる。さらに、真空ポンプの使用は、植物のマイクロ形態学の多くの実験室における固定剤の浸透または埋め込み物質の一般的な手順であり、したがってこのプロトコルをより利用しやすくする。
ここでは、特定の保存化合物が存在する場合にサンプルを選択的に染色する造影剤を使用して、同じアプローチを使用しました。真空または受動浸潤によって適用された場合、選択的染色は、例えば、リンタングステン酸塩と比較して、サンプル全体のコントラスト増強が不十分である可能性があります。一方、特定の植物の構造や組織を強調するのに有益です。ここで報告されているように、以前の解剖学的または組織化学的分析と組み合わせると、ヨウ素などの選択的造影剤の使用は、寄生虫または宿主のいずれか(両方ではない)が豊富なデンプン埋蔵量を示す場合、宿主の体内の寄生植物組織の分化を助けることができる。寄生虫組織のX線吸収を選択的に増加させることは、宿主植物の茎内で V. miniom などの内部寄生植物によって形成される複雑な3次元ネットワークを探索するのに初めて有用であることが示されています。さらに、内部寄生植物と特定の真菌が興味深い進化的収束を示し、どちらもライフサイクルの大部分で宿主内で「シークレット」で成長し、短期間にのみ出現することは注目に値します29。したがって、ここで説明するプロトコルの潜在的な新しいアプリケーションは、植物組織内の内生真菌を検出するために、臭素30を含む染色剤であるフロキシンBを使用することです。植物組織にはほとんど使用されない別の臭素ベースの染色液であるエオシンは、特定のマイクロCTシステム31を使用して分析されたマウス腎臓サンプルのコントラストを高めることが示されています。
このプロトコルに記載される別のアプローチは、宿主の幹または根の血管組織を通る造影剤の灌流である。このアプローチは、以前に報告された方法とは大きく異なり、木材サンプルにサフラニン染料を灌流して透水係数を分析したSperryらの研究に基づいています32。著者らによって論じられ、ここで強調されているように、プロトコルにおける重要なステップは、システム32への気泡の導入を避けるために染色灌流装置をセットアップすることである。三方弁は、溶液フラックスを一時的に発散させ、液体コンラム32から気泡を除去することができる。それにもかかわらず、塞栓は、寄生植物の一般的に高い蒸散速度のために、サンプリング中に人為的に、または自然に生じる宿主植物の血管の内部に存在することができる33、34。これにより、灌流効率が大幅に低下し、サンプルのコントラストが改善されなくなる可能性があります。この問題を防ぐために、サンプリング後に試料を固定するときは、低真空から中程度の真空を適用することが不可欠です。相補的に、固定された標本は、サンプルが保存されている固定液を使用して高圧下で洗い流すことができます。フラッシングは、気泡32を除去することによって試料中の導電性を回復するのを助け、したがって造影剤溶液の灌流のための経路をクリアすることができる。新鮮な材料を扱う場合、サンプリング直後に標本を水に浸し、次にそれを水中で再び切断し、鋭利なブレード35で端面を滑らかにすることによって、植物への気泡の導入を回避できます。
このアプローチに続いて、1%ヨウ素溶液をC.アメリカーナとS.マルティアヌスの吸器に灌流して、宿主-寄生虫界面全体のコントラストを高めました。これらの種について得られた結果は、ここで説明する灌流プロトコルが新鮮なサンプルと固定されたサンプルの両方でうまく機能し、造影剤ソリューションの導入が木質化されたサンプルでも視覚化を改善することを示しています。これらの観察結果は、Haustorium構造の特定の側面を視覚化するために0.2%硝酸鉛溶液を適用するために同じアプローチを使用したTeixeira-Costa & Ceccantinti17によって報告された結果と一致します。二酸化炭素と接触すると、硝酸鉛が反応して炭酸鉛結晶からなる非常に不溶性の沈殿物を形成し、X線を効率的に吸収します8,36。サンプルの血管組織に灌流されると、この沈殿物は血管ピット接続を詰まらせ、溶液が穿孔プレートを介した直接の血管間接続を介してのみ流れることを可能にします。このアプローチに続いて、穿孔プレートを介した直接的な寄生虫-宿主木部接続の存在がS. fungiformeについてここに示され、詳細な解剖学的分析によって確認されます。これらの結果は、ハウストリアムの機能をテストするためのこのアプローチのさらなる適用を強調しています。ハウストリウムの開始は、寄生虫と宿主の不適合性または寄生虫に対する宿主抵抗のいずれかのために完全に機能する器官の発達に至らない可能性があることを考えると、ここで説明するアプローチを使用して、2つの植物間に血管接続が形成され、効果的な寄生が発生するかどうかをテストできます。マイクロCTスキャンを使用して木部塞栓症をより広く調査することの価値を考慮すると12,37、ここで提示されたプロトコルは、他の非寄生植物種における木部塞栓症の視覚化と定量分析を改善することもできます。
結論として、このプロトコルは、低X線吸収24で構造を区別するのに役立つ対照剤を適用するという、植物マイクロトモグラフィーで期待される重要な進歩の1つに近づいています。ここに示すように、造影剤ソリューションは、寄生植物とその宿主の間の界面における吸器構造の視覚化を大幅に改善することができます。異なる化合物は、寄生虫組織および宿主組織間でしばしば異なって分布するデンプンなどの予備化合物と反応する際のそれらの特異性に従って選択することができる。ハウストリウムサンプルへのコントラスト適用へのアプローチは、血管間直接接続など、寄生虫-宿主界面の特定の特徴を調査するために選択することもできます。さらに、このプロトコルは非寄生種にも適用でき、内生真菌の検出と木部塞栓症の定量化を改善する可能性があります。いずれの用途においても、マイクロトモグラフィー分析を改善するための本明細書に記載されるプロトコルは、光投影断層撮影および自動仮想セグメンテーションなどの他のツールと組み合わせて、これらの植物とその宿主との間の接続の三次元発達に対する新しく刺激的な洞察を提供することができる38、39。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
シモーネ・ゴメス・フェレイラ博士(ブラジル、サンパウロ大学マイクロトモグラフィー研究所)とグレッグ・リン博士(ハーバード大学ナノスケールシステムセンター、米国)には、さまざまなマイクロトモグラフィーシステムとデータ解析ソフトウェアに関する最も重要な支援と不可欠なユーザートレーニングに感謝します。また、コネチカット大学(米国)のEEB温室のスタッフ、特に ビスカムミニマムの標本を提供してくれたクリントンモースとマシューオペルにも感謝します。ジョン・ウェンツェル博士は、 Pyrularia puberaのサンプリングの機会と大きな助けを提供しました。Carolina Bastos修士、Yasmin Hirao修士、Talitha Mottaは、 Scybalium fungiformeのサンプリングに大いに役立ちました。アリアドネ・フルタド博士、フェルナンダ・オリベイラ博士、マリア・アリーン・ネベス博士は、内生性真菌の分析にフロキシンBを使用するためのリファレンスを提供しました。ブリュッセル自由大学でのビデオ録画は、フィリップ・クレイス博士、クリストフ・スヌーク博士、ジェイク・グリフィス修士、バラバラ・ヴェセルカ博士、ハリー・オールド・ヴェンテリンク博士の助けを借りて可能になりました。資金は、高等教育要員の改善のための調整(CAPES、ブラジル)とハーバード大学ハーバリア(米国)によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems - ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR - USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR - USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR - USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR - USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
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