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Tirer parti de la micro-tomodensitométrie pour analyser les interactions parasites-plantes et hôtes

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63423
Automatic Translation
1,2
1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Summary

La micro-tomodensitométrie est un outil non destructif qui permet d’analyser les structures végétales en trois dimensions. Le présent protocole décrit la préparation de l’échantillon pour tirer parti de la micro-CT afin d’analyser la structure et la fonction parasitaires des plantes. Différentes espèces sont utilisées pour mettre en évidence les avantages de cette méthode lorsqu’elle est associée à des préparations spécifiques.

Abstract

La micro-tomodensitométrie est devenue un outil établi dans l’étude de la structure et de la fonction des plantes. Sa nature non destructive, combinée à la possibilité d’une visualisation tridimensionnelle et d’une section virtuelle, a permis une analyse nouvelle et de plus en plus détaillée d’organes végétaux complexes. Les interactions entre les plantes, y compris entre les plantes parasites et leurs hôtes, peuvent également être explorées. Cependant, la préparation des échantillons avant le balayage devient cruciale en raison de l’interaction entre ces plantes, qui diffèrent souvent par l’organisation et la composition des tissus. De plus, la grande diversité des plantes à fleurs parasites, allant des corps végétatifs fortement réduits aux arbres, aux herbes et aux arbustes, doit être prise en compte lors de l’échantillonnage, du traitement et de la préparation du matériel hôte-parasite. Ici, deux approches différentes sont décrites pour introduire des solutions de contraste dans le parasite et / ou les plantes hôtes, en se concentrant sur l’analyse de l’haustorium. Cet organe favorise la connexion et la communication entre les deux plantes. En suivant une approche simple, les détails de l’organisation des tissus d’haustorium peuvent être explorés en trois dimensions, comme indiqué ici pour les espèces parasites euphytoïdes, vignes et gui. La sélection d’agents contrastés spécifiques et d’approches d’application permet également une observation détaillée de la propagation de l’endoparasite dans le corps de l’hôte et la détection d’une connexion directe de vaisseau à vaisseau entre le parasite et l’hôte, comme illustré ici pour un parasite racinaire obligatoire. Ainsi, le protocole discuté ici peut être appliqué à la grande diversité des plantes à fleurs parasites pour faire progresser la compréhension de leur développement, de leur structure et de leur fonctionnement.

Introduction

La microtomodensitométrie à rayons X à haute résolution (micro-TDM) est une méthode d’imagerie dans laquelle plusieurs radiographies (projections) d’un échantillon sont enregistrées sous différents angles de vue et utilisées plus tard pour fournir une reconstruction virtuelle de l’échantillon1. Cet objet virtuel peut ensuite être analysé, manipulé et segmenté, permettant une exploration non destructive en trois dimensions2. Initialement conçu pour les analyses médicales et plus tard pour les applications industrielles, le micro-CT offre également l’avantage de visualiser les organes et tissus internes sans nécessiter de procédures invasives3. Comme d’autres formes d’imagerie, la micro-tomodensitométrie fonctionne avec un compromis entre le champ de vision et la taille des pixels, ce qui signifie que l’imagerie haute résolution de grands échantillons est presque inaccessible4. Des progrès dans l’utilisation de sources de rayons X à haute énergie (c.-à-d. synchrotron) et d’un grossissement optique secondaire sont constamment réalisés, permettant à la plus petite résolution d’atteindre moins de 100 nm 5,6. Néanmoins, des temps de numérisation plus longs sont nécessaires pour les échantillons volumineux, ce qui augmente le risque d’artefacts en raison du mouvement ou de la déformation de l’échantillon à l’intérieur du scanner. De plus, la micro-TDM est généralement limitée par les variations naturelles de densité au sein de l’échantillon et par la façon dont l’échantillon interagit avec les rayons X. Bien qu’une dose de rayons X plus élevée soit préférable pour pénétrer dans des échantillons plus denses, elle est moins efficace pour capturer les variations de densité à l’intérieur et entre l’échantillon et son milieu environnant7. D’autre part, une dose de rayons X plus faible offre moins de puissance de pénétration et nécessite souvent des temps de balayage plus longs mais plus de sensibilité dans la détection de la densité7.

Ces restrictions ont longtemps entravé l’utilisation de la microtomographie pour les sciences végétales, étant donné que la plupart des tissus végétaux sont composés de tissus légers (non denses) à faible absorption des rayons X8. Les premières applications de la micro-CT ont été axées sur la cartographie des réseaux racinaires dans la matrice du sol 9,10. Plus tard, des structures végétales présentant des différences plus significatives dans la densité des tissus, telles que le bois, ont commencé à être explorées. Cela a permis d’étudier la fonctionnalité du xylème 11,12, le développement d’organisations tissulaires complexes13,14 et les interactions entre les plantes15,16,17. L’analyse des tissus mous et homogènes se généralise en raison des agents de contraste, qui sont maintenant une procédure standard dans les préparations pour le micro-balayage CT d’échantillons de plantes. Cependant, les protocoles d’introduction du contraste peuvent avoir des résultats différents selon le volume de l’échantillon, les propriétés structurelles et le type de solution utilisée8. Idéalement, l’agent de contraste devrait améliorer la distinction entre les différents tissus, permettre l’évaluation de la fonctionnalité des tissus et des organes et/ou fournir des informations biochimiques sur un tissu18. Par conséquent, un traitement, une préparation et un montage adéquats de l’échantillon avant la numérisation deviennent cruciaux pour toute analyse micro-CT.

Micro-CT de la plante parasite haustorium
Les plantes parasites à fleurs représentent un groupe fonctionnel distinct d’angiospermes caractérisés par un organe connu sous le nom de haustorium19. Cet organe multicellulaire, hybride développemental entre une tige modifiée et une racine, agit sur l’attachement, la pénétration et le contact de l’hôte par un parasite20. Pour cette raison, l’haustorium est considéré comme « incarnant l’idée même de parasitisme chez les plantes »21. Une compréhension détaillée du développement, de la structure et du fonctionnement de cet organe est cruciale pour les études sur l’écologie des plantes parasites, l’évolution et la gestion. Néanmoins, la complexité globale des plantes parasites et leur structure et haustoria fortement modifiées entravent souvent l’analyse détaillée et la comparaison. Les connexions haustorium sont également généralement étendues et non homogènes dans la distribution des tissus et des cellules (Figure 1). Dans ce contexte, bien que le travail avec de petits fragments de tissu permette une manipulation plus facile et une résolution plus élevée, il peut conduire à des conclusions erronées sur l’architecture tridimensionnelle de structures complexes, telles que la plante parasite haustorium.

Bien qu’il existe une vaste littérature sur l’anatomie et l’ultrastructure de l’haustorium pour la plupart des espèces végétales parasites, l’organisation tridimensionnelle et la relation spatiale entre le parasite et les tissus hôtes restent peu explorées17. Dans un travail récent de Masumoto et al.22, plus de 300 sections de microtomes semi-minces en série ont été imagées et reconstruites en un objet virtuel tridimensionnel représentant l’haustorium de deux espèces de parasites. L’excellent niveau de détail de cette méthode fournit des informations sans précédent sur la structure 3D cellulaire et anatomique de l’haustorium. Cependant, une technique aussi longue interdirait une analyse similaire chez les parasites ayant des connexions haustorium plus étendues. L’utilisation de la micro-CT apparaît comme un excellent outil pour l’analyse tridimensionnelle de haustoria complexes et souvent volumineuses de plantes parasites. Bien qu’ils ne remplacent pas le sectionnement anatomique détaillé et d’autres formes complémentaires d’analyses microscopiques17,23, les résultats obtenus par micro-tomodensitométrie, en particulier pour les grands échantillons, peuvent également servir de guide pour diriger le sous-échantillonnage de segments plus petits, qui peuvent ensuite être analysés à l’aide d’autres outils, tels que la microscopie confocale et électronique, ou réanalysés avec des systèmes de micro-tomodensitométrie à haute résolution.

Figure 1
Figure 1 : Plantes parasites de différents groupes fonctionnels utilisés dans ce protocole. Pyrularia pubera (A), endoparasite Viscum minimum (B) avec fruits verts (cercle noir pointillé), vigne parasite Cuscuta americana (C), gui Struthanthus martianus (D), parasite racinaire obligatoire Scybalium fungiforme (E). Les segments de la racine hôte (Hr) ou de la tige (Hs) facilitent l’application du contraste dans le parasite haustorium (P). La présence de racine/tige mère du parasite (flèches) dans l’échantillon permet d’analyser l’organisation des vaisseaux de l’haursorium. Les rectangles indiquent les segments de l’échantillon utilisé pour l’analyse. Barres d’échelle = 2 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Alors que la micro-TDM devient une technique de plus en plus populaire en sciences végétales, il existe des guides, des protocoles et de la littérature traitant de la numérisation d’échantillons, de la reconstruction tridimensionnelle, de la segmentation et de l’analyse 3,10,24. Ainsi, ces étapes ne seront pas discutées ici. Comme pour toute technique d’imagination, le traitement et le montage appropriés des échantillons sont fondamentaux, bien qu’il s’agisse souvent d’une procédure négligée. Pour cette raison, ce protocole se concentre sur la préparation d’échantillons d’haustorium pour la micro-tomodensitométrie. Plus précisément, ce protocole décrit deux approches pour introduire des agents de contraste dans les échantillons d’haustorium afin d’améliorer la visualisation de différents tissus et types de cellules dans l’haustorium, de faciliter la détection de tissu parasite dans la racine / tige hôte et d’analyser les connexions vasculaires parasite-hôte en trois dimensions. Les préparations décrites ici peuvent également être adaptées à l’analyse d’autres structures végétales.

Cinq espèces ont été utilisées pour mieux illustrer la commodité du protocole décrit ici. Chaque espèce représente l’un des cinq groupes fonctionnels de plantes à fleurs parasites, abordant ainsi des points spécifiques liés à la fonctionnalité de chaque groupe. Pyrularia pubera (Santalaceae) a été choisi pour représenter les parasites euphytoïdes, qui germent dans le sol et forment de multiples haustoria qui relient le parasite aux racines de ses hôtes25. Les haustoria créées par ces plantes sont souvent ténues et facilement arrachées de l’hôte26 (Figure 1A), nécessitant ainsi un processus de manipulation plus délicat. Les endoparasites sont représentés ici par Viscum minimum (Viscaceae). Les espèces de ce groupe fonctionnel ne sont visibles à l’extérieur du corps de leurs hôtes que pendant de courtes périodes (Figure 1B) et vivent la plupart de leurs cycles de vie sous forme de brins de cellules significativement réduits et de type mycélial incorporés dans les tissus hôtes25. Un troisième groupe fonctionnel comprend les vignes parasites, qui germent au sol mais ne forment que des racines rudimentaires, s’appuyant sur de multiples haustoria qui s’attachent aux tiges des plantes hôtes25 (Figure 1C). Ici, ce groupe fonctionnel est représenté par Cuscuta americana (Convolvulaceae). Contrairement aux vignes parasites, les guis germent directement sur les branches de leurs plantes hôtes et développent des haustoria multiples ou solitaires25. L’espèce choisie pour illustrer ce groupe fonctionnel est Struthanthus martianus (Loranthaceae), qui forme diverses connexions avec la branche hôte (Figure 1D). L’analyse de la haustoria de gui solitaire à l’aide d’une combinaison de micro-tomodensitométrie et de microscopie optique peut être trouvée dans Teixeira-Costa & Ceccantini17. Enfin, les parasites racinaires obligatoires comprennent les espèces qui germent sur le sol et pénètrent dans les racines des plantes hôtes, dont elles dépendent entièrement dès les premiers stades de croissance25. Ces plantes sont représentées ici par Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), qui produit de grandes haustoria ressemblant à des tubercules (Figure 1E).

Tous les échantillons végétaux utilisés dans ce protocole ont été fixés dans un alcool d’acide acétique au formol à 70 % (FAA 70). La fixation lors de l’échantillonnage est cruciale pour la préservation des tissus végétaux, en particulier si des analyses anatomiques ultérieures sont nécessaires. Dans le cas de la plante parasite haustorium, la fixation est également essentielle, car cet organe est souvent principalement composé de cellules de parenchyme non lignifiées20. Des protocoles détaillés pour la fixation des tissus végétaux, y compris la préparation de solutions fixatrices, peuvent être trouvés ailleurs27. D’autre part, à un degré plus ou moins grand, les fixateurs peuvent provoquer des altérations des propriétés physiques et chimiques d’un échantillon, le rendant impropre à des analyses biomécaniques et histochimiques spécifiques. Ainsi, des échantillons frais, c’est-à-dire du matériel non fixé prélevé immédiatement avant la préparation, peuvent également être utilisés avec ce protocole. Des détails sur la façon de manipuler de nouveaux échantillons et des suggestions de dépannage pour le matériel fixe sont fournis dans la section de discussion.

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Protocol

1. Sélection d’échantillons de plantes parasites

  1. Recueillir tout l’haustorium de la plante parasite, y compris la tige/racine de l’hôte attaché et les segments des extrémités proximales et distales de l’organe hôte parasité; La longueur idéale de chaque segment équivaut au double du diamètre de l’Haustorium.
    REMARQUE : Pour les haustoria latérales, inclure une partie de la tige/racine mère du parasite à partir de laquelle l’haustorium a été formé (figure 1A, B, D). Pour les endoparasites, prélever un segment de la tige/racine de l’hôte dans lequel des signes du parasite sont visibles (figure 1B). Dans le cas des connexions terminales, l’ensemble de la plante doit être collecté (figure 1E).
  2. Immerger l’échantillon entier dans une solution fixatrice (p. ex., FAA) dans une proportion volumétrique de 1:10 (échantillon : fixateur). Laisser les échantillons dans le fixateur pendant au moins 1 jour, selon la taille de l’échantillon27.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés dans un fixateur avant le balayage ou transférés dans une solution de conservation (p. ex. éthanol à 70 %). De nouveaux échantillons peuvent également être utilisés si l’analyse anatomique ultérieure n’est pas justifiée (voir la section Discussion). Si vous travaillez avec un matériau frais, configurez l’appareil de perfusion de la solution de contraste, puis prélevez l’échantillon. L’échantillon ne doit pas sécher.

2. Application de solutions contrastées

  1. Choisissez la méthode d’application à utiliser. Utiliser la méthode du vide (étape 2.3) pour les petits échantillons (figure 1A) ou non ligneux (figure 1B). Utiliser la méthode de perfusion pour les échantillons plus grands, à condition qu’elle comprenne un segment de la tige/racine hôte (Figure 1A,C-E).
  2. Porter des gants de caoutchouc et tout autre équipement de protection individuelle approprié (p. ex. sarrau de laboratoire) lors de la manipulation de l’échantillon, quelle que soit l’approche choisie aux étapes suivantes.
    ATTENTION: Toutes les solutions contrastées contiennent des sels de métaux lourds dans leur composition et ne doivent donc pas être manipulées sans un équipement de protection individuelle adéquat et sous une hotte.
  3. Pour la méthode du vide, suivez les étapes mentionnées ci-dessous.
    1. Choisissez un flacon approprié et étiquetez-le. Le flacon doit être suffisamment grand pour accueillir l’échantillon et la solution contrastante, généralement dans une proportion de 1:10. Vérifiez les instructions du fabricant pour vous assurer que le flacon peut résister à un vide faible à modéré.
      REMARQUE: Ne remplissez pas le flacon à ras bord, car la pression négative (vide) peut provoquer le déversement du liquide.
    2. Placer l’échantillon dans le flacon avec la solution contrastante (1 % d’iode ou 3 % de phosphotungstate, voir le tableau des matières). Placez ensuite le flacon dans une chambre à vide ou un dessiccateur relié à une pompe à vide. Retirez le couvercle du flacon, puis fermez la chambre à vide ou le dessiccateur.
    3. Vérifiez qu’il n’y a pas de fissures sur la chambre à vide/dessiccateur et que la pompe à vide contient suffisamment d’huile.
    4. Fermez la soupape d’échappement de la pompe pour empêcher l’air de s’accumuler et ouvrez la soupape d’échappement de la chambre/dessiccateur pour forcer l’air à sortir.
    5. Allumez la pompe et attendez que la pression atteigne environ 20 pouces Hg.
      ATTENTION: Ce processus est généralement rapide, alors ne laissez pas le système de vide sans surveillance.
      REMARQUE: Alors que l’unité du système métrique pour la pression est Pascal (Pa), les manomètres de la plupart des pompes à vide de laboratoire affichent la pression en pouces de mercure (« Hg), livre par pouce carré (psi) ou bars. 20 » Hg équivaut à environ 67,7 Pa, 10 psi ou 0,7 bar.
    6. Fermez la soupape d’échappement de la chambre ou du dessiccateur pour empêcher l’air de rentrer, puis éteignez rapidement la pompe.
    7. Laisser l’échantillon sous vide pendant au moins 2 h; Les échantillons plus grands nécessitent plus de temps pour que la solution contrastante puisse y pénétrer.
    8. Après la période souhaitée, retirez l’échantillon de la solution contrastante pour le préparer à la numérisation.
    9. Ouvrez lentement la soupape d’évacuation de la chambre ou du dessiccateur pour permettre à l’air d’y pénétrer.
    10. Attendez que la pression dans la chambre/le dessiccateur soit complètement épuisée (c.-à-d. que le manomètre atteint près de 0), puis ouvrez-le soigneusement pour récupérer l’échantillon.
    11. Jeter la solution contrastante de manière appropriée et conserver l’échantillon en vue de la numérisation.
  4. Pour la méthode de perfusion, suivez les étapes mentionnées ci-dessous.
    1. Sélectionnez un réservoir d’alimentation pour la solution contrastante en fonction de la taille de l’échantillon. Utiliser une seringue de 50 ml (sans aiguille ni piston) pour les petits échantillons (figure 2A) ou une trousse médicale intraveineuse de 1 l pour les gros échantillons (figure 2B).
    2. Connectez une extrémité d’un tube en plastique transparent (voir le tableau des matériaux) au réservoir d’alimentation, puis connectez l’autre extrémité à une vanne bidirectionnelle ou tridirectionnelle. Raccordez un deuxième tuyau à une autre sortie de la vanne (Figure 2A,B).
    3. Fixez le réservoir d’alimentation en position élevée sans démonter l’appareil installé à l’étape précédente.
      NOTE: La distance verticale entre le réservoir et l’échantillon dictera la pression de perfusion de la solution (Figure 2B). Une distance de 20 à 50 cm est suffisante pour les petits échantillons. Pour les grands échantillons, une distance de 1 m est plus adéquate.
    4. Fermez la vanne à trois voies (figure 2C) ou bidirectionnelle (figure 2D) pour empêcher le liquide de sortir du système de tuyauterie, puis versez la solution contrastante dans le réservoir d’alimentation. Si vous utilisez une trousse médicale intraveineuse, remplissez le sac avec la solution et fermez la valve avant de fixer l’appareil à une position élevée.
    5. S’assurer qu’aucune grosse bulle d’air ne se forme le long du système de tubes (figure 2E). Si nécessaire, laissez la solution de contraste s’écouler hors du tube jusqu’à ce que la bulle soit retirée. Fermez à nouveau la vanne et laissez l’appareil en place.
    6. Pour préparer l’échantillon à la perfusion de la solution de contraste, maintenez-le immergé dans un liquide (eau, éthanol ou fixateur) et coupez l’extrémité de l’extrémité proximale de la tige/racine de l’hôte dans l’échantillon (Figure 2F).
    7. Retirez l’échantillon du liquide dans lequel il a été stocké et enveloppez-le dans un film de paraffine pour éviter la dessiccation. Gardez l’échantillon à proximité et prêt à être connecté à l’appareil.
    8. Ouvrez soigneusement la vanne pour permettre à la solution contrastante de s’écouler lentement et remplissez le tube en plastique connecté au réservoir tout en maintenant l’extrémité ouverte du système dans une position légèrement surélevée pour empêcher la solution contrastante de se renverser. Encore une fois, assurez-vous qu’aucune grosse bulle d’air ne se forme le long du tube.
    9. Relier l’extrémité proximale de la tige/racine hôte de l’échantillon à l’extrémité ouverte du système de tubes (figure 2B, région agrandie). Évitez d’introduire des bulles d’air dans le système au cours de cette étape. Si nécessaire, débranchez l’échantillon de l’appareil et éliminez les bulles d’air du système en laissant la solution s’écouler.
    10. Tout en gardant l’échantillon connecté à l’appareil, placez-le à l’intérieur d’un récipient pour éviter les fuites de la solution contrastante dans la zone où l’expérience a été mise en place. Utiliser des tubes de différents diamètres, des attaches à glissière en plastique et des adaptateurs de vannes (figure 2G) pour s’assurer que tous les raccords de l’appareil sont bien ajustés, qu’ils s’adaptent aux branches hôtes de différentes tailles et que la solution ne fuit pas du système de tubes (figure 2B, région agrandie).
    11. Laisser la solution perfuser l’échantillon pendant au moins 2 h ou jusqu’à ce que la solution s’accumule à l’intérieur du récipient.
    12. Fermez la vanne et débranchez délicatement l’échantillon de l’appareil. Égoutter le reste de la solution dans le récipient et l’éliminer de manière appropriée.
    13. Retirez le film de paraffine de l’échantillon en vue de la numérisation.

Figure 2
Figure 2 : Approche de perfusion pour l’application de contraste. Les versions petites (A) et grandes (B) de l’appareil de perfusion comprennent un réservoir d’alimentation (st) et deux tubes en plastique (t1 et t2) reliés par une vanne (va). L’extrémité proximale de la tige hôte (H) portant un parasite (P) qui lui est attaché via l’haustorium (ha) est reliée à l’extrémité ouverte du système (B, élargie). Une vanne à trois voies (C) ou bidirectionnelle (D) est utilisée pour aider à prévenir la formation de bulles d’air à l’intérieur du système de tuyauterie, qui bloquent le passage de la solution contrastante (E). L’extrémité de l’extrémité proximale de la tige hôte (H) est coupée sous l’eau pour permettre le passage de la solution de contraste (F). Les attaches à glissière, les adaptateurs de vannes et les tubes de différents diamètres aident à sécuriser les connexions plus serrées et à éviter les fuites dans le système (G). Les figures 2B, D et F ont été créées avec BioRender. Barres d’échelle = 2 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation et montage des échantillons

  1. Lavez l’échantillon en le plongeant dans l’eau pendant 2 min.
    ATTENTION : Ne pas laver les échantillons dans l’évier, car toutes les solutions contrastantes contiennent des sels de métaux lourds dans leur composition. Considérez l’eau utilisée pour le lavage comme une solution contrastante diluée et éliminez-la de manière appropriée.
  2. Placez l’échantillon dans une serviette en papier à température ambiante pour permettre à l’excès d’eau de s’évaporer pendant 2 à 5 minutes selon la taille de l’échantillon. Sinon, séchez légèrement l’échantillon à l’aide d’une serviette en papier. Ne laissez pas l’échantillon sécher complètement.
  3. Enveloppez l’échantillon dans un film de paraffine en l’étirant en une fine couche. Évitez de plier le film de paraffine sur l’échantillon.
  4. Montez l’échantillon enveloppé sur un porte-échantillon, en le maintenant stable et en position pendant qu’il tourne pendant la numérisation. Utilisez du ruban adhésif, de la mousse basse densité, des embouts de pipette et/ou des contenants en plastique transparent pour fixer l’échantillon en place.
  5. Numériser l’échantillon et analyser les images en suivant les protocoles et directives spécifiques établis pour le système micro-CT disponible.

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Representative Results

L’haustorium des plantes parasites est un organe complexe comprenant différents tissus et types de cellules qui s’entrelacent et se connectent avec les tissus d’une autre plante, utilisée comme hôte20. Le micro-scanner peut être utilisé pour mieux comprendre cette structure complexe de manière non destructive et tridimensionnelle lors de l’analyse à la fois de petites (Figure 1A-C) et de grandes (Figure 1D,E) haustoria. Pour ce faire, des solutions contrastées peuvent être appliquées dans l’interface parasite-hôte, permettant ainsi d’analyser des échantillons qui auraient autrement une absorption faible et homogène des rayons X. Les deux approches simples décrites dans ce protocole reposent sur la pression de la solution contrastante pour accélérer la pénétration à travers l’échantillon. Comme prévu, les protocoles décrits ici fonctionnent pour différents systèmes micro-CT. Cependant, les paramètres et les paramètres de numérisation diffèrent selon le système et l’échantillon analysé (Tableau 1).

Groupe fonctionnel Parasite euphytoïde Endoparasite Vigne parasite Gui (avant/après le contraste) Parasite racinaire obligatoire
Espèce (famille) Pyrularia pubera Viscum minimum Cuscuta americana Struthanthus martianus Scybalium fungiforme
Famille Santalaceae Viscacées Convolvulaceae Loranthaceae Balanophoraceae
Solution de contraste 3% phosphotungstate 1% d’iode 1% d’iode 1% d’iode 0,2 % de nitrate de plomb
Méthode d’application vide vide perfusion perfusion perfusion
Système Micro-CT Zeiss Versa 620 Nikon X-Tek HMXST225 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176
Projections 4500 3140 610 1200 / 2400 5300
Cadres 1 1 3 (moyenne) 3 / 3 (moyenne) 3 (moyenne)
Exposition (ms) 5000 1000 680 1600 / 830 750
Filtre (mm) aucun Al 0,25 Al 1,0 Al 1.0 / Al 1.0 aucun
Tension (kV) 60 85 35 90 / 45 40
Courant (μA) 108 80 375 180 / 390 600

Tableau 1 : Paramètres de numérisation et paramètres des échantillons analysés.

Après la première approche pour l’application de contraste (étape 2.3), le vide a été utilisé pour perfuser l’haustorium du parasite euphytoïde P. pubera avec une solution de phosphotungstate à 3% pendant deux heures. L’échantillon a ensuite été scanné dans un système de microscope X 3D (XRM) (voir Tableau des matériaux), obtenant une résolution d’image élevée par grossissement optique secondaire4. Les images XRM se sont avérées aussi efficaces que les coupes anatomiques analysées au microscope optique pour analyser l’organisation et la topologie des tissus à l’interface parasite-hôte (Figure 3). L’utilisation de phosphotungstate met en évidence l’abondance du tissu du parenchyme, qui apparaît dans un ton blanc vif en raison de la forte absorption de l’agent contrastant. Les vaisseaux apparaissent dans un ton gris foncé en raison de la faible absorption du contraste. Sur la base de cette différence de couleur, il est possible d’observer l’abondance du parenchyme entourant le noyau vasculaire de l’haustorium (Figure 3). Les vaisseaux complexes et les minces brins de parenchyme du noyau vasculaire lui-même sont également observés, en particulier dans les coupes longitudinales (figures 3A-C). En coupe transversale, le noyau vasculaire est facilement observé sous la forme de deux brins vasculaires séparés par un parenchyme (figures 3D, E).

Figure 3
Figure 3 : Euphytoid parasite haustorium. Des coupes longitudinales (A-C) et transversales (D-E) à travers l’haustorium ont été observées au microscope optique (A,E) et par microscopie 3D à rayons X après application d’une solution de phosphotungstate à 3% sous vide (B-D). Les contours rouges indiquent le tissu du parenchyme (par) et les contours bleus indiquent le noyau vasculaire (vc). Hx : xylème hôte. Hb : écorce de l’hôte. Barres d’échelle = 500 μm (A, E) et 2,5 cm (B-D; taille du voxel = 2,8382 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La même approche a été utilisée pour introduire du contraste dans la tige d’une plante hôte succulente (Euphorbia polygona, Cactaceae) parasitée par V. minimum. Ici, une solution d’iode à 1% a été choisie comme agent de contraste sur la base d’une analyse histochimique préliminaire, qui a montré que les cellules du parenchyme de l’endoparasite stockent les glucides sous forme d’amidon (Figure 4A). Dans le même temps, les cellules du cortex hôte ne stockent pas une quantité détectable d’amidon (Figure 4B-D). Après l’application du contraste, l’échantillon a ensuite été scanné à l’aide d’un système micro-CT Nikon X-Tek (voir le tableau des matériaux). La différence d’absorption de l’iode a permis de détecter le réseau complexe de brins corticaux formés par l’endoparasite dans le corps hôte (Figure 4E). En suivant cette méthodologie, on a observé que les brins corticaux se concentraient autour du centre vasculaire de l’hôte et se ramifiaient éventuellement vers la périphérie de la tige de l’hôte lorsqu’ils étaient associés à l’émersion d’une fleur parasitaire (figures 4F, G).

Figure 4
Figure 4 : Réseau tissulaire endoparasitaire. Les sections anatomiques (A) et macro (B-D) montrent une réaction avec une solution d’iode à 1%, ce qui indique que de l’amidon (coloré en noir) est présent dans le parenchyme (par) associé aux vaisseaux (ve) du parasite. Étant donné que l’amidon est absent dans le cortex hôte (Hc) et le xylème (Hx), des solutions d’iode à 1% ont été utilisées sélectivement pour améliorer le contraste des tissus corticaux du parasite (contours violets, E-G), observés sur le fond de l’hôte (H). La présence d’une fleur (Pf) confirme que le tissu coloré fait partie de la structure endoparasitaire (A, F, G). Barres d’échelle = 0,25 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans la deuxième approche décrite ici (étape 2.4), un réservoir d’alimentation contenant la solution contrastante est élevé par rapport au niveau dans lequel l’échantillon est placé, utilisant ainsi la gravité pour entraîner le passage de la solution à travers l’échantillon. Après perfusion de contraste, le balayage a été effectué à l’aide d’un système micro-CT Bruker Skycan (voir Tableau des matériaux). Les résultats obtenus pour C. americana (figures 5A, B) et S. martianus (figures 5C-G) aident à illustrer la commodité de cette approche pour les petits et les grands échantillons, respectivement. La comparaison d’échantillons scannés avant (Figure 5C,E) et après (Figure 5D,F) perfusion d’une solution d’iode à 1% souligne l’importance de l’application de contraste, même dans des échantillons ligneux d’haustorium. Il convient de noter que dans les associations entre C. americana et S. martianus (figure 5) et leurs hôtes respectifs, les parasites ont peu ou pas d’amidon dans leurs tissus. Ceci explique les différents résultats décrits pour l’endoparasite V. minimum (Figure 4), dans lequel la même méthode et le même type de solution de contraste ont été utilisés.

Figure 5
Figure 5 : Vigne parasite et gui haustorium. Coupes longitudinales à travers l’haustorium d’une vigne parasite (A,B) et d’un gui (C-G). La comparaison entre la scintigraphie et la macro-section de matériel frais montre que la structure complexe de l’haustorium est bien capturée dans les micro-tomodensitogrammes (A, B). La comparaison entre les échantillons fixés avant (C,E) et après (D,F) la perfusion de la solution d’iode à 1% montre que le contraste est amélioré même dans les échantillons lignifiés, facilitant l’observation des structures parasites (P) telles que les vaisseaux dans la racine épicorticale (pointes de flèches roses), les brins vasculaires (pointes de flèches bleues) et le plomb (pointe de flèche jaune). Les vaisseaux et les anneaux annuels du xylème hôte (Hx) et l’amidon dans l’écorce de l’hôte (Hb) sont également plus faciles à observer. Barres d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un résultat final obtenu avec le protocole de perfusion décrit ici est la possibilité de détecter les connexions vasculaires entre les parasites et les plantes hôtes. Ceci a été réalisé en perfusant une solution de nitrate de plomb à 0,2% à travers un segment de la racine hôte autour duquel le tubercule du parasite obligatoire de la racine S. fungiforme s’était développé. Après l’application du produit de contraste, le balayage a également été effectué à l’aide d’un système micro-CT Bruker Skyscan (voir le tableau des matériaux). Les projections séquentielles montrent que les vaisseaux de la racine de l’hôte bifurquent en tubercule du parasite (figure 6A-C). Après l’analyse de ces résultats, le même échantillon a été découpé en un sous-échantillon plus petit, préparé pour l’étude anatomique et analysé par microscopie optique. La coupe en série de ce sous-échantillon confirme que la continuité du xylème entre les deux plantes est formée par une connexion récipient à récipient via des plaques de perforation (figure 6D-F).

Figure 6
Figure 6 : Obligatoire du parasite racinaire haustorium. Coupes longitudinales à travers l’haustorium observées par micro-tomodensitométrie (A-C) et coupes anatomiques observées au microscope optique (D-F). L’accumulation de solution de nitrate de plomb à 0,2% dans le système vasculaire de la racine hôte (Hr, contour rose) permet l’observation des vaisseaux hôtes se ramifiant dans le tube parasitaire (Pt) et la détection d’une connexion vasculaire directe entre les deux plantes (contour blanc pointillé). Barres d’échelle = 1 cm (A-C) et 500 μm (D-F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’utilisation de solutions de métaux lourds pour améliorer le contraste des tissus végétaux est devenue une étape cruciale dans la préparation des échantillons pour l’analyse micro-CT. Plusieurs composés couramment disponibles dans les laboratoires de micromorphologie végétale ont été testés par Staedler et al., qui recommandent d’utiliser le phosphotungstate comme agent le plus efficace pour pénétrer les échantillons et augmenter l’indicede contraste 8. Les résultats obtenus ici dans l’analyse de l’haustorium de P. pubera corroborent cette recommandation. En termes d’application de contraste, Steadler et al. décrivent que la solution de contraste a été infiltrée passivement à travers le matériau analysé (fleurs et boutons floraux allant de 1 mm à 10 mm) pendant 1 à 8 jours8. D’autres auteurs ont utilisé le même protocole d’infiltration passive sur de longues périodes (1 à 4 semaines) lors de l’analyse d’échantillons plus importants, tels que les fleurs de 30 cm de large de l’espèce endoparasite Rafflesiaceae28. Bien que ce procédé se soit avéré fructueux, les résultats obtenus avec le protocole décrit ici montrent que le processus d’infiltration peut être considérablement accéléré sous vide, améliorant ainsi la méthode précédemment établie. Une chambre à vide ou une pompe force l’air à s’échapper des tissus végétaux, permettant ainsi une infiltration plus facile de la solution de contraste. Le vide peut être appliqué même sur des structures fragiles, comme le montre ici pour l’haustorium de P. pubera et les tissus mous de la plante hôte succulente E. polygona parasité par V. minimum. De plus, l’utilisation de pompes à vide est une procédure courante pour l’infiltration de fixateurs ou d’encastrements de substances dans de nombreux laboratoires de micromorphologie végétale, rendant ainsi ce protocole plus accessible.

La même approche a été utilisée ici avec un agent de contraste qui colore sélectivement les échantillons si des composés de stockage spécifiques sont présents. Lorsqu’elle est appliquée par vide ou infiltration passive, la coloration sélective peut améliorer le contraste d’un échantillon entier par rapport au phosphotungstate, par exemple. D’autre part, il est bénéfique pour mettre en évidence des structures ou des tissus végétaux spécifiques. Comme indiqué ici, lorsqu’elle est combinée à une analyse anatomique ou histochimique antérieure, l’utilisation d’agents de contraste sélectifs tels que l’iode peut aider à différencier les tissus végétaux parasites dans le corps de l’hôte, à condition que le parasite ou l’hôte (mais pas les deux) présentent des réserves abondantes d’amidon. L’augmentation sélective de l’absorption des rayons X des tissus parasitaires s’avère particulièrement utile pour explorer, pour la première fois, le réseau tridimensionnel complexe formé par une plante endoparasite telle que V. minimum dans la tige de sa plante hôte. De plus, il convient de noter que les plantes endoparasites et certains champignons présentent une convergence évolutive intéressante, tous deux poussant « incognito » à l’intérieur de leurs hôtes pendant une grande partie de leur cycle de vie, n’émergeant que pendant de brèves périodes29. Ainsi, une nouvelle application potentielle du protocole décrit ici serait d’utiliser la phloxine B, une coloration contenant du brome30, pour détecter les champignons endophytes dans les tissus végétaux. Il a été démontré que l’éosine, une autre solution de coloration à base de brome rarement utilisée pour les tissus végétaux, améliore le contraste dans les échantillons de reins de souris analysés à l’aide d’un système micro-CT spécifique31.

Une autre approche décrite dans ce protocole est la perfusion d’agents contrastés à travers le tissu vasculaire de la tige ou de la racine hôte. Cette approche, qui diffère considérablement des méthodes précédemment rapportées, est basée sur les travaux de Sperry et al., qui ont perfusé des échantillons de bois avec du colorant safranine pour analyser la conductivité hydraulique32. Comme discuté par les auteurs et souligné ici, une étape critique du protocole consiste à mettre en place l’appareil de perfusion de taches pour éviter l’introduction de bulles d’air dans le système32. Les vannes à trois voies peuvent diverger temporairement du flux de solution et éliminer les bulles du liquidecomlumn 32. Néanmoins, des emboles peuvent être présents à l’intérieur des vaisseaux de la plante hôte, causés soit artificiellement lors de l’échantillonnage, soit naturellement en raison des taux de transpiration généralement élevés des plantes parasites33,34. Cela peut diminuer considérablement l’efficacité de la perfusion, ce qui empêche le contraste d’être amélioré dans l’échantillon. Il est essentiel d’appliquer un vide faible à modéré lors de la fixation de l’échantillon après l’échantillonnage pour éviter ce problème. De manière complémentaire, l’échantillon fixé peut être rincé sous haute pression à l’aide de la solution fixatrice dans laquelle l’échantillon est stocké. Le rinçage peut aider à restaurer la conductivité dans l’échantillon en éliminant les bulles d’air32, dégageant ainsi le chemin de perfusion de la solution de contraste. Si vous travaillez avec du matériel frais, l’introduction de bulles d’air dans la plante peut être évitée en immergeant l’échantillon dans l’eau immédiatement après l’échantillonnage, puis en le coupant à nouveau sous l’eau et en lissant la surface finale avec des lames tranchantes35.

Suivant cette approche, une solution d’iode à 1% a été perfusée à travers l’haustorium de C. americana et de S. martianus pour améliorer le contraste de l’interface hôte-parasite dans son ensemble. Les résultats obtenus pour ces espèces montrent que le protocole de perfusion décrit ici fonctionne bien pour les échantillons frais et fixés, et que l’introduction de solutions de contraste améliore la visualisation même dans les échantillons lignifiés. Ces observations concordent avec les résultats rapportés par Teixeira-Costa & Ceccantinti17, qui ont utilisé la même approche pour appliquer une solution de nitrate de plomb à 0,2% afin de visualiser des aspects spécifiques de la structure de l’haustorium. Au contact du dioxyde de carbone, le nitrate de plomb réagit pour former un précipité hautement insoluble composé de cristaux de carbonate de plomb, qui absorbent efficacement les rayons X 8,36. Une fois perfusé dans le tissu vasculaire de l’échantillon, ce précipité obstrue les connexions de fosse vasculaire, permettant à la solution de circuler uniquement à travers des connexions directes, vaisseau à vaisseau, via des plaques de perforation. En suivant cette approche, la présence de connexions directes du xylème parasite-hôte à travers des plaques de perforation est montrée ici pour S. fungiforme et confirmée par une analyse anatomique détaillée. Ces résultats mettent en évidence une application supplémentaire de cette approche pour tester la fonctionnalité de l’haustorium. Étant donné que l’initiation de l’haustorium pourrait ne pas aboutir au développement d’un organe pleinement fonctionnel en raison de l’incompatibilité parasite-hôte ou de la résistance de l’hôte contre le parasite, l’approche décrite ici peut être utilisée pour tester si des connexions vasculaires sont formées entre les deux plantes, conduisant à l’apparition d’un parasitisme efficace. Compte tenu de l’intérêt d’utiliser la micro-tomodensitométrie pour étudier les embolies xylomiques plus largement12,37, le protocole présenté ici peut également améliorer la visualisation et l’analyse quantitative de l’embolie xylée chez d’autres espèces de plantes non parasites.

En conclusion, ce protocole se rapproche de l’une des avancées critiques attendues en microtomographie végétale, qui consiste à appliquer des agents contrastés pour aider à différencier les structures à faible absorption des rayons X24. Comme indiqué ici, les solutions de contraste peuvent améliorer considérablement la visualisation des structures haustorium à l’interface entre les plantes parasites et leurs hôtes. Différents composés peuvent être choisis en fonction de leur spécificité à réagir avec les composés de réserve, tels que l’amidon, qui est souvent réparti différemment entre les tissus parasites et hôtes. L’approche de l’application de contraste dans des échantillons d’haustorium peut également être choisie pour étudier des caractéristiques spécifiques de l’interface parasite-hôte, telles que la connexion directe de vaisseau à vaisseau. En outre, ce protocole peut également être appliqué à des espèces non parasites, améliorant potentiellement la détection des champignons endophytes et la quantification de l’embolie xylétique. Dans n’importe quelle application, le protocole décrit ici pour améliorer l’analyse microtomographique peut être combiné avec d’autres outils, tels que la tomographie par projection optique et la segmentation virtuelle automatisée, pour fournir des informations nouvelles et passionnantes sur le développement tridimensionnel de la connexion entre ces plantes et leurs hôtes38,39.

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Disclosures

L’auteur n’a rien à divulguer.

Acknowledgments

Je tiens à remercier le Dr Simone Gomes Ferreira (Laboratoire de microtomographie, Université de Sao Paulo, Brésil) et le Dr Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Université Harvard, États-Unis) pour leur aide primordiale et leur formation indispensable aux différents systèmes de microtomographie et logiciels d’analyse de données. Je remercie également le personnel de la serre EEB de l’Université du Connecticut (États-Unis), en particulier Clinton Morse et Matthew Opel pour avoir fourni les spécimens de Viscum minimum. Le Dr John Wenzel a fourni l’opportunité et une grande aide pour l’échantillonnage de Pyrularia pubera. MSc. Carolina Bastos, MSc. Yasmin Hirao et Talitha Motta ont grandement aidé à l’échantillonnage de Scybalium fungiforme. Mme Ariadne Furtado et les Dres Fernanda Oliveira et Maria Aline Neves ont fourni la référence pour l’utilisation de la phloxine B pour l’analyse des champignons endophytes. L’enregistrement vidéo à la Vrije Universiteit Brussel a été rendu possible grâce à l’aide du Dr Philippe Claeys, du Dr Christophe Snoeck, du MSc. Jake Griffith, du Dr Barabara Veselka et du Dr Harry Olde Venterink. Le financement a été fourni par la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES, Brésil) et les herbiers de l’Université Harvard (États-Unis).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D X-ray microscope (XRM) system Zeiss Versa 620 used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22 Zeiss Versa 620 Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software Nikon version XT 3.1.11 Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software Bruker version 3.3.1 Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software Object Research Systems - ORS version Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials Glass Vials Inc. SE V2708C-FM-SP Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X Zeiss version XT 3.1.11 Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N WR Chemicals BDH BDH7422-1 Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g Vetec 361.08 Sold by SPLab
Microtomography scanner Bruker Skyscan1176 Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner Nikon X-Tek HMXST225 Used for scanning the species V. minimum
NRecon software Bruker version 1.0.0 Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution Electron Microscopy Sciences 101410-756 Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm) Heathrow Scientific PM996 Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL Taylor 3478 Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4'' Nalge Nunc International SC63013-164 Sold by VWR - USA
Scanning system Nikon X-Tek HMXST225 used to scan Viscum minimum
Scanning system Bruker Skyscan 1176 used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software Zeiss version 16 Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve ToToT DMTWVS-5 Sold by Amazon USA
Two-part syringe HSW Henke-Ject 4850001000 Used without the plunger
Vacuum chamber Binder 80080-434 Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software Volume Graphics version 3.0 Used for analyses and acquisition of images and videos

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