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परजीवी पौधे-मेजबान इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए माइक्रो-सीटी स्कैनिंग का लाभ उठाना

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63423
Automatic Translation
1,2
1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Summary

माइक्रो-सीटी एक गैर-विनाशकारी उपकरण है जो तीन आयामों में पौधों की संरचनाओं का विश्लेषण कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल परजीवी पौधे संरचना और कार्य का विश्लेषण करने के लिए माइक्रो-सीटी का लाभ उठाने के लिए नमूना तैयारी का वर्णन करता है। विशिष्ट तैयारी के साथ युग्मित होने पर इस विधि के फायदों को उजागर करने के लिए विभिन्न प्रजातियों का उपयोग किया जाता है।

Abstract

माइक्रो-सीटी स्कैनिंग संयंत्र संरचना और कार्य की जांच में एक स्थापित उपकरण बन गया है। इसकी गैर-विनाशकारी प्रकृति, त्रि-आयामी विज़ुअलाइज़ेशन और वर्चुअल सेक्शनिंग की संभावना के साथ मिलकर, जटिल पौधों के अंगों के नए और तेजी से विस्तृत विश्लेषण की अनुमति दी है। परजीवी पौधों और उनके मेजबानों के बीच सहित पौधों के बीच बातचीत का भी पता लगाया जा सकता है। हालांकि, स्कैनिंग से पहले नमूना तैयार करना इन पौधों के बीच बातचीत के कारण महत्वपूर्ण हो जाता है, जो अक्सर ऊतक संगठन और संरचना में भिन्न होते हैं। इसके अलावा, परजीवी फूलों के पौधों की व्यापक विविधता, अत्यधिक कम वनस्पति निकायों से लेकर पेड़ों, जड़ी-बूटियों और झाड़ियों तक, परजीवी-मेजबान सामग्री के नमूनाकरण, उपचार और तैयारी के दौरान विचार किया जाना चाहिए। यहां परजीवी और / या मेजबान पौधों में विपरीत समाधान पेश करने के लिए दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का वर्णन किया गया है, जो हौस्टोरियम का विश्लेषण करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। यह अंग दो पौधों के बीच संबंध और संचार को बढ़ावा देता है। एक सरल दृष्टिकोण के बाद, हौस्टोरियम ऊतक संगठन के विवरण को तीन-आयामी रूप से खोजा जा सकता है, जैसा कि यूफाइटोइड, बेल और मिस्टलेटो परजीवी प्रजातियों के लिए यहां दिखाया गया है। विशिष्ट विपरीत एजेंटों और अनुप्रयोग दृष्टिकोणों का चयन करने से मेजबान शरीर के भीतर फैले एंडोपारासाइट के विस्तृत अवलोकन और परजीवी और मेजबान के बीच प्रत्यक्ष पोत-से-पोत कनेक्शन का पता लगाने की अनुमति मिलती है, जैसा कि एक बाध्यकारी जड़ परजीवी के लिए यहां दिखाया गया है। इस प्रकार, यहां चर्चा किए गए प्रोटोकॉल को परजीवी फूलों के पौधों की व्यापक विविधता पर लागू किया जा सकता है ताकि उनके विकास, संरचना और कामकाज की समझ को आगे बढ़ाया जा सके।

Introduction

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) एक इमेजिंग विधि है जिसमें एक नमूने के कई रेडियोग्राफ (अनुमान) को विभिन्न देखने के कोणों से रिकॉर्ड किया जाता है और बाद में नमूना1 के आभासी पुनर्निर्माण प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस आभासी वस्तु का विश्लेषण, हेरफेर और खंडित किया जा सकता है, जिससे तीन आयामों में गैर-विनाशकारी अन्वेषण की अनुमति मिलतीहै। प्रारंभ में चिकित्सा विश्लेषण के लिए और बाद में औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किया गया, माइक्रो-सीटीआक्रामक प्रक्रियाओं की आवश्यकता के बिना आंतरिक अंगों और ऊतकों की कल्पना करने का लाभ भी प्रदान करता है। इमेजिंग के अन्य रूपों की तरह, माइक्रो-सीटी दृश्य के क्षेत्र और पिक्सेल आकार के बीच एक व्यापार-बंद के साथ काम करता है, जिसका अर्थ है कि बड़े नमूनों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग लगभग अप्राप्यहै। उच्च ऊर्जा एक्स-रे स्रोतों (यानी, सिंक्रोट्रॉन) और माध्यमिक ऑप्टिकल आवर्धन का उपयोग करने में प्रगति लगातार की जा रही है, जिससे सबसे छोटा रिज़ॉल्यूशन 100 एनएम 5,6 से नीचे पहुंच सकता है। फिर भी, बड़े नमूनों के लिए लंबे समय तक स्कैनिंग समय आवश्यक है, जिससे स्कैनर के अंदर नमूना आंदोलन या विरूपण के कारण कलाकृतियों की संभावना बढ़ जाती है। इसके अलावा, माइक्रो-सीटी आम तौर पर नमूने के भीतर प्राकृतिक घनत्व भिन्नताओं द्वारा सीमित होता है और नमूना एक्स-रे के साथ कैसे बातचीत करता है। जबकि एक उच्च एक्स-रे खुराक सघन नमूनों को भेदने के लिए सबसे अच्छा है, यह नमूने और उसके आसपास के माध्यम7 के भीतर और बीच घनत्व में भिन्नता को पकड़ने में कम कुशल है। दूसरी ओर, एक कम एक्स-रे खुराक कम प्रवेश शक्ति प्रदान करती है और अक्सर लंबे समय तक स्कैनिंग समय की आवश्यकता होती है लेकिन घनत्व का पता लगाने में अधिक संवेदनशीलताहोती है।

इन प्रतिबंधों ने लंबे समय से पौधे विज्ञान के लिए माइक्रोटोमोग्राफी के उपयोग में बाधा डाली है, यह देखते हुए कि अधिकांश पौधे के ऊतक कम एक्स-रे अवशोषण8 के साथ प्रकाश (गैर-घने) ऊतक से बने होते हैं। माइक्रो-सीटी के पहले अनुप्रयोग मिट्टी मैट्रिक्स 9,10 के भीतर रूट नेटवर्क के मानचित्रण पर केंद्रित थे। बाद में, ऊतक घनत्व में अधिक महत्वपूर्ण अंतर वाले पौधों की संरचनाओं, जैसे कि लकड़ी, का पता लगाया जाने लगा। इसने जाइलम कार्यक्षमता 11,12 की जांच, जटिल ऊतक संगठनों के विकास13,14, और पौधों के बीचबातचीत 15,16,17 की अनुमति दी है। कंट्रास्ट एजेंटों के कारण नरम और सजातीय ऊतक का विश्लेषण व्यापक हो रहा है, जो अब पौधे के नमूनों के माइक्रो-सीटी स्कैनिंग की तैयारी में मानक प्रक्रिया है। हालांकि, कंट्रास्ट परिचय के लिए प्रोटोकॉल में नमूना मात्रा, संरचनात्मक गुणोंऔर उपयोग किए गए समाधान के प्रकार के आधार पर अलग-अलग परिणाम हो सकते हैं। आदर्श रूप से, कंट्रास्ट एजेंट को विभिन्न ऊतकों के बीच भेद को बढ़ाना चाहिए, ऊतक / अंग कार्यक्षमता मूल्यांकन को सक्षम करना चाहिए, और / या ऊतक18 के बारे में जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करनी चाहिए। इसलिए, किसी भी माइक्रो-सीटी विश्लेषण के लिए स्कैनिंग से पहले पर्याप्त नमूना उपचार, तैयारी और माउंटिंग महत्वपूर्ण हो जाती है।

परजीवी पौधे हॉस्टोरियम का माइक्रो-सीटी
परजीवी फूल वाले पौधे एंजियोस्पर्म के एक अलग कार्यात्मक समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं जो एक अंग की विशेषता है जिसे हौस्टोरियम19 के रूप में जाना जाता है। यह बहुकोशिकीय अंग, एक संशोधित स्टेम और एक जड़ के बीच एक विकासात्मक संकर, एक परजीवी20 द्वारा मेजबान के लगाव, प्रवेश और संपर्क पर कार्य करता है। इस कारण से, हौस्टोरियम को "पौधों के बीच परजीवीवाद के विचार को मूर्त रूप देने" के लिए माना जाता है। परजीवी पौधों की पारिस्थितिकी, विकास और प्रबंधन अध्ययन के लिए इस अंग के विकास, संरचना और कार्यप्रणाली की विस्तृत समझ महत्वपूर्ण है। फिर भी, परजीवी पौधों की समग्र जटिलता और अत्यधिक संशोधित संरचना और हौस्टोरिया अक्सर विस्तृत विश्लेषण और तुलना में बाधा डालते हैं। हौस्टोरियम कनेक्शन भी आमतौर पर व्यापक होते हैं और ऊतक और कोशिका वितरण में समरूप नहीं होते हैं (चित्रा 1)। इस संदर्भ में, जबकि छोटे ऊतक के टुकड़ों के साथ काम करना आसान हेरफेर और उच्च रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देता है, यह जटिल संरचनाओं के त्रि-आयामी वास्तुकला के बारे में गलत निष्कर्ष निकाल सकता है, जैसे कि परजीवी पौधे हौस्टोरियम।

यद्यपि अधिकांश परजीवी पौधों की प्रजातियों के लिए हौस्टोरियम शरीर रचना विज्ञान और अल्ट्रास्ट्रक्चर पर एक विशाल साहित्य है, त्रि-आयामी संगठन और परजीवी और मेजबान ऊतकों के बीच स्थानिक संबंध खराब रूप से खोजा गयाहै। मासुमोटो एट अल.22 द्वारा हाल ही में किए गए एक काम में, 300 से अधिक सीरियल अर्ध-पतले माइक्रोटोम वर्गों को चित्रित किया गया और दो परजीवी प्रजातियों के हौस्टोरियम का प्रतिनिधित्व करने वाली तीन-आयामी आभासी वस्तु में पुनर्निर्मित किया गया। इस विधि के विस्तार का उत्कृष्ट स्तर हौस्टोरियम की सेलुलर और शारीरिक 3-डी संरचना में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हालांकि, इस तरह की समय लेने वाली तकनीक अधिक व्यापक हॉस्टोरियम कनेक्शन वाले परजीवियों में इसी तरह के विश्लेषण को मना करेगी। माइक्रो-सीटी का उपयोग परजीवी पौधों के जटिल और अक्सर भारी हौस्टोरिया के त्रि-आयामी विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में उभरता है। यद्यपि विस्तृत शारीरिक अनुभागन और माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के अन्य पूरक रूपों के लिए एक विकल्प नहीं है, माइक्रो-सीटी स्कैनिंग के माध्यम से प्राप्त परिणाम, विशेष रूप से बड़े नमूनों के लिए, छोटे खंडों के उप-नमूने को निर्देशित करने के लिए एक गाइड के रूप में भी काम कर सकते हैं, जिसे तब अन्य उपकरणों, जैसे कॉन्फोकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है, या उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रो-सीटी सिस्टम के साथ फिर से विश्लेषण किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न कार्यात्मक समूहों के परजीवी पौधे। यूफाइटोइड परजीवी पाइरुलेरिया प्यूबेरा (ए), एंडोपारासाइट विस्कम मिनिमम (बी) हरे फलों के साथ (डैश्ड ब्लैक सर्कल), परजीवी बेल कुस्कुटा अमेरिकाना (सी), मिस्टलेटो स्ट्रूथंथस मार्टियनस (डी), जड़ परजीवी साइबेलियम फंगीफॉर्म (ई)। मेजबान जड़ (एचआर) या स्टेम (एचएस) के खंड परजीवी हौस्टोरियम (पी) में कंट्रास्ट के आवेदन की सुविधा प्रदान करते हैं। नमूने में परजीवी मां जड़ / स्टेम (तीर) की उपस्थिति हौस्टोरियम पोत संगठन के विश्लेषण की अनुमति देती है। आयताकार विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूने के खंडों को इंगित करते हैं। स्केल बार = 2 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चूंकि माइक्रो-सीटी प्लांट साइंसेज में एक तेजी से लोकप्रिय तकनीक बन जाती है, इसलिए नमूना स्कैनिंग, त्रि-आयामी पुनर्निर्माण, विभाजन और विश्लेषण 3,10,24 से निपटने वाले गाइड, प्रोटोकॉल और साहित्य हैं। इस प्रकार, इन चरणों पर यहां चर्चा नहीं की जाएगी। किसी भी कल्पना तकनीक के साथ, उचित उपचार और नमूनों का बढ़ना एक मौलिक है, हालांकि अक्सर एक अनदेखी प्रक्रिया होती है। इस कारण से, यह प्रोटोकॉल माइक्रो-सीटी स्कैनिंग के लिए हॉस्टोरियम नमूने की तैयारी पर केंद्रित है। अधिक विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल हौस्टोरियम नमूनों में कंट्रास्ट एजेंटों को पेश करने के लिए दो दृष्टिकोणों का वर्णन करता है ताकि हौस्टोरियम में विभिन्न ऊतकों और सेल प्रकारों के विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार हो सके, मेजबान जड़ / स्टेम के भीतर परजीवी ऊतक का पता लगाने की सुविधा मिल सके, और तीन आयामों में परजीवी-मेजबान संवहनी कनेक्शन का विश्लेषण किया जा सके। यहां वर्णित तैयारी को अन्य पौधों की संरचनाओं के विश्लेषण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल की सुविधा को बेहतर ढंग से चित्रित करने के लिए पांच प्रजातियों का उपयोग किया गया था। प्रत्येक प्रजाति परजीवी फूलों के पौधों के पांच कार्यात्मक समूहों में से एक का प्रतिनिधित्व करती है, इस प्रकार प्रत्येक समूह की कार्यक्षमता से संबंधित विशिष्ट बिंदुओं को संबोधित करती है। पाइरुलारिया पुबेरा (सांतालेसी) को यूफाइटोइड परजीवी का प्रतिनिधित्व करने के लिए चुना गया था, जो जमीन में अंकुरित होते हैं और कई हौस्टोरिया बनाते हैं जो परजीवी को अपने मेजबान25 की जड़ों से जोड़ते हैं। इन पौधों द्वारा बनाए गए हौस्टोरिया अक्सर मेजबान26 (चित्रा 1 ए) से कमजोर और आसानी से फट जाते हैं, इस प्रकार अधिक नाजुक हैंडलिंग प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। एंडोपारासाइट्स को यहां विस्कम मिनिमम (विस्कासी ) द्वारा दर्शाया गया है। इस कार्यात्मक समूह में प्रजातियां केवल छोटी अवधि के लिए अपने मेजबानों के शरीर के बाहर दिखाई देती हैं (चित्रा 1 बी) और अपने अधिकांश जीवन चक्र ों को काफी कम और मेजबान ऊतकों के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं के माइसेलियन जैसी किस्में केरूप में जीते हैं। एक तीसरे कार्यात्मक समूह में परजीवी बेलें शामिल हैं, जो जमीन पर अंकुरित होती हैं, लेकिन केवल अल्पविकसित जड़ें बनाती हैं, जो कई हौस्टोरिया पर निर्भर करती हैं जो मेजबान पौधों के तनों से जुड़ती हैं25 (चित्रा 1 सी)। यहां, इस कार्यात्मक समूह का प्रतिनिधित्व कुस्कुटा अमेरिकाना (कॉन्वोल्वुलेसी) द्वारा किया जाता है। परजीवी बेलों के विपरीत, मिस्टलेटो सीधे अपने मेजबान पौधों की शाखाओं पर अंकुरित होते हैं और या तो कई या एकान्त हौस्टोरियाविकसित करते हैं। इस कार्यात्मक समूह को चित्रित करने के लिए चुनी गई प्रजाति है स्ट्रूथंथस मार्टियनस (लोरेंथेसी), जो मेजबान शाखा (चित्रा 1 डी) के साथ विभिन्न कनेक्शन बनाता है। माइक्रो-सीटी और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संयोजन का उपयोग करके एकान्त मिस्टलेटो हॉस्टोरिया का विश्लेषण टेक्सीरा-कोस्टा और सेकेंटिनी17 में पाया जा सकता है। अंत में, जड़ परजीवी में ऐसी प्रजातियां शामिल होती हैं जो जमीन पर अंकुरित होती हैं और मेजबान पौधों की जड़ों में प्रवेश करती हैं, जिस पर वे शुरुआती विकास चरणों25 से पूरी तरह से निर्भर होते हैं। इन पौधों को यहां साइबलियम फंगीफोर्म (बालानोफोरेसी) द्वारा दर्शाया गया है, जो बड़े कंद जैसे हौस्टोरिया का उत्पादन करते हैं (चित्रा 1 ई)।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी पौधों के नमूने 70% फॉर्मलिन एसिटिक एसिड अल्कोहल (एफएए 70) में तय किए गए थे। पौधे के ऊतकों को संरक्षित करने के लिए नमूनाकरण पर निर्धारण महत्वपूर्ण है, खासकर अगर बाद में शारीरिक विश्लेषण की आवश्यकता होती है। परजीवी पौधे हौस्टोरियम के मामले में, निर्धारण भी आवश्यक है, क्योंकि यह अंग अक्सर मुख्य रूप से गैर-लिग्निफाइड पैरेन्काइमा कोशिकाओं20 से बना होता है। पौधे के ऊतक निर्धारण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, जिसमें फिक्सेटिव समाधान तैयार करना शामिल है, कहीं और पाया जा सकताहै। दूसरी ओर, अधिक या कम डिग्री तक, फिक्सेटिव एक नमूने के भौतिक और रासायनिक गुणों में परिवर्तन का कारण बन सकते हैं, जिससे यह विशिष्ट बायोमैकेनिकल और हिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हो जाता है। इस प्रकार, ताजा नमूने, यानी, तैयारी से तुरंत पहले एकत्र की गई गैर-केंद्रित सामग्री, का उपयोग इस प्रोटोकॉल के साथ भी किया जा सकता है। ताजा नमूने को संभालने के तरीके और केंद्रित सामग्री के लिए समस्या निवारण सुझावों के बारे में विवरण चर्चा अनुभाग में प्रदान किए गए हैं।

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Protocol

1. परजीवी पौधे नमूना चयन

  1. पूरे परजीवी पौधे हौस्टोरियम को इकट्ठा करें, जिसमें संलग्न मेजबान स्टेम / जड़ और परजीवी मेजबान अंग के समीपस्थ और डिस्टल दोनों सिरों के खंड शामिल हैं; प्रत्येक खंड की आदर्श लंबाई हौस्टोरियम के व्यास के दोगुने के बराबर है।
    नोट: पार्श्व हौस्टोरिया के लिए, परजीवी मां स्टेम / जड़ का हिस्सा शामिल करें जिसमें से हौस्टोरियम का गठन किया गया था (चित्रा 1 ए, बी, डी)। एंडोपारासाइट्स के लिए, मेजबान स्टेम / जड़ का एक खंड एकत्र करें जिसमें परजीवी के संकेत दिखाई देते हैं (चित्रा 1 बी)। टर्मिनल कनेक्शन के मामले में, पूरे संयंत्र को एकत्र किया जाना चाहिए (चित्रा 1 ई)।
  2. पूरे नमूने को 1: 10 (नमूना: फिक्सेटिव) के वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में फिक्सेटिव समाधान (जैसे, एफएए) में डुबोएं। नमूने27 के आकार के आधार पर नमूने को कम से कम 1 दिन के लिए फिक्सेटिव में छोड़ दें।
    नोट: नमूने स्कैनिंग से पहले फिक्सेटिव में संग्रहीत किए जा सकते हैं या एक संरक्षण समाधान (जैसे, इथेनॉल 70%) में स्थानांतरित किए जा सकते हैं। ताजा नमूने का उपयोग भी किया जा सकता है यदि बाद में शारीरिक विश्लेषण की आवश्यकता नहीं है (चर्चा अनुभाग देखें)। यदि ताजा सामग्री के साथ काम कर रहे हैं, तो कंट्रास्ट समाधान के छिड़काव के लिए उपकरण स्थापित करें, फिर नमूना एकत्र करें। नमूने को सूखने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।

2. विपरीत समाधानों का अनुप्रयोग

  1. उपयोग की जाने वाली अनुप्रयोग विधि चुनें. छोटे (चित्रा 1 ए) या गैर-वुडी (चित्रा 1 बी) नमूने के लिए वैक्यूम विधि (चरण 2.3) का उपयोग करें। बड़े नमूनों के लिए छिड़काव विधि का उपयोग करें, बशर्ते इसमें मेजबान स्टेम / रूट का एक खंड शामिल हो (चित्रा 1 ए, सी-ई)।
  2. निम्नलिखित चरणों में चुने गए दृष्टिकोण की परवाह किए बिना नमूने में हेरफेर करते समय रबर दस्ताने और अन्य उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (जैसे, प्रयोगशाला कोट) पहनें।
    सावधानी: सभी विपरीत समाधानों में उनकी संरचना में भारी धातु लवण शामिल होते हैं, और इसलिए पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के बिना और फ्यूम हुड के तहत नियंत्रित नहीं किया जाना चाहिए।
  3. वैक्यूम विधि के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. एक उपयुक्त शीशी चुनें और इसे लेबल करें। शीशी नमूना और विपरीत समाधान को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बड़ी होनी चाहिए, आमतौर पर 1: 10 के अनुपात में। यह सुनिश्चित करने के लिए निर्माता से निर्देशों की जांच करें कि शीशी कम से मध्यम वैक्यूम का सामना कर सकती है।
      नोट: शीशी को ब्रिम में न भरें, क्योंकि नकारात्मक दबाव (वैक्यूम) तरल को फैलने का कारण बन सकता है।
    2. नमूने को शीशी में विपरीत समाधान के साथ रखें (1% आयोडीन या 3% फॉस्फोटुंगस्टेट, सामग्री की तालिका देखें)। फिर शीशी को वैक्यूम पंप से जुड़े वैक्यूम चैंबर या डेसिकेटर में रखें। शीशी से ढक्कन निकालें, फिर वैक्यूम चैंबर या डिस्सिकेटर को बंद करें।
    3. जांचें कि वैक्यूम चैंबर / डेसिकेटर पर कोई दरारें नहीं हैं और वैक्यूम पंप में पर्याप्त तेल है।
    4. हवा को स्केपिंग से रोकने के लिए पंप के थकावट वाल्व को बंद करें और हवा को बाहर निकालने के लिए कक्ष / डेसिकेटर के थकावट वाल्व को खोलें।
    5. पंप चालू करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि दबाव लगभग 20 "एचजी तक न पहुंच जाए।
      सावधानी: यह प्रक्रिया आमतौर पर तेज होती है, इसलिए वैक्यूम सिस्टम को अनदेखा न करें।
      नोट: जबकि दबाव के लिए मीट्रिक प्रणाली इकाई पास्कल (पीए) है, अधिकांश प्रयोगशाला वैक्यूम पंपों में दबाव गेज पारा ("एचजी), पाउंड प्रति वर्ग इंच (पीएसआई), या सलाखों के इंच में दबाव प्रदर्शित करते हैं। 20 "एचजी सीए 67.7 पीए, 10 पीएसआई, या 0.7 बार के बराबर होता है।
    6. हवा को फिर से प्रवेश करने से रोकने के लिए चैंबर / डेसिकेटर निकास वाल्व को बंद करें, फिर जल्दी से पंप बंद कर दें।
    7. नमूने को कम से कम 2 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत छोड़ दें; बड़े नमूनों को इसे भेदने के लिए विपरीत समाधान के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है।
    8. वांछित अवधि के बाद, नमूने को स्कैनिंग के लिए तैयार करने के लिए विपरीत समाधान से हटा दें।
    9. धीरे-धीरे कक्ष / डेसिकेटर थकावट वाल्व खोलें ताकि हवा इसमें प्रवेश कर सके।
    10. कक्ष / डेसिकेटर में दबाव पूरी तरह से समाप्त होने की प्रतीक्षा करें (यानी, दबाव गेज 0 के पास पहुंच जाता है), फिर नमूने को पुनः प्राप्त करने के लिए इसे सावधानीपूर्वक खोलें।
    11. विपरीत समाधान को उचित रूप से त्याग दें और नमूने को स्कैनिंग की तैयारी में रखें।
  4. छिड़काव विधि के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. नमूने के आकार के अनुसार विपरीत समाधान के लिए एक आपूर्ति टैंक का चयन करें। छोटे नमूनों के लिए 50 एमएल सिरिंज (बिना सुई या प्लंजर के) या बड़े नमूनों के लिए 1 एल अंतःशिरा चिकित्सा किट (चित्रा 2 बी) का उपयोग करें।
    2. एक पारदर्शी प्लास्टिक टयूबिंग के एक छोर ( सामग्री की तालिका देखें) को आपूर्ति टैंक से कनेक्ट करें, फिर दूसरे छोर को दो-तरफा या तीन-तरफा वाल्व से कनेक्ट करें। वाल्व में एक अलग आउटलेट के लिए एक दूसरी ट्यूबिंग कनेक्ट करें (चित्रा 2 ए, बी)।
    3. पिछले चरण में स्थापित उपकरण को अलग किए बिना एक ऊंची स्थिति में आपूर्ति टैंक को सुरक्षित करें।
      नोट: टैंक और नमूने के बीच ऊर्ध्वाधर दूरी समाधान छिड़काव दबाव (चित्रा 2 बी) को निर्धारित करेगी। छोटे नमूनों के लिए 20-50 सेमी की दूरी पर्याप्त है। बड़े नमूनों के लिए, 1 मीटर की दूरी अधिक पर्याप्त है।
    4. तरल को ट्यूबिंग सिस्टम से बाहर निकलने से रोकने के लिए तीन-तरफा (चित्रा 2 सी) या दो-तरफा (चित्रा 2 डी) वाल्व बंद करें, फिर आपूर्ति टैंक में विपरीत समाधान डालें। यदि अंतःशिरा चिकित्सा किट का उपयोग कर रहे हैं, तो बैग को घोल से भरें और उपकरण को एक ऊंची स्थिति में सुरक्षित करने से पहले वाल्व को बंद कर दें।
    5. सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग सिस्टम के साथ कोई बड़ा हवा का बुलबुला नहीं बनता है (चित्रा 2 ई)। यदि आवश्यक हो, तो कंट्रास्ट समाधान को ट्यूबिंग से बाहर बहने दें जब तक कि बुलबुला हटा न दिया जाए। वाल्व को फिर से बंद करें और उपकरण को जगह पर छोड़ दें।
    6. कंट्रास्ट समाधान के छिड़काव के लिए नमूना तैयार करने के लिए, इसे तरल (पानी, इथेनॉल, या फिक्सेटिव) में डुबोकर रखें और नमूने में मेजबान स्टेम / जड़ के समीपस्थ छोर की नोक को काट दें (चित्रा 2 एफ)।
    7. उस तरल से नमूना निकालें जिसमें इसे संग्रहीत किया गया था और निर्जलीकरण से बचने के लिए इसे पैराफिन फिल्म में लपेटें। नमूने को पास रखें और उपकरण से जुड़े होने के लिए तैयार रहें।
    8. विपरीत समाधान को धीरे-धीरे बहने की अनुमति देने के लिए वाल्व को सावधानीपूर्वक खोलें और विपरीत समाधान को फैलने से रोकने के लिए सिस्टम के खुले छोर को थोड़ा ऊंचा स्थिति में रखते हुए टैंक से जुड़े प्लास्टिक टयूबिंग को भरें। फिर, सुनिश्चित करें कि ट्यूब के साथ कोई बड़ा हवा का बुलबुला नहीं बनता है।
    9. नमूने में मेजबान स्टेम / जड़ के समीपस्थ छोर को ट्यूबिंग सिस्टम के खुले छोर से कनेक्ट करें (चित्रा 2 बी, आवर्धित क्षेत्र)। इस चरण के दौरान सिस्टम में हवा के बुलबुले पेश करने से बचें। यदि आवश्यक हो, तो उपकरण से नमूने को डिस्कनेक्ट करें और समाधान को बहने की अनुमति देकर सिस्टम से हवा के बुलबुले हटा दें।
    10. नमूने को उपकरण से जुड़े रखते समय, इसे एक कंटेनर के अंदर रखें ताकि उस क्षेत्र में विपरीत समाधान के रिसाव से बचा जा सके जहां प्रयोग स्थापित किया गया था। विभिन्न व्यास, प्लास्टिक ज़िप-टाई और वाल्व एडाप्टर (चित्रा 2 जी) के ट्यूबों का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए करें कि उपकरण में सभी कनेक्शन अच्छी तरह से फिट हैं, विभिन्न आकारों की मेजबान शाखाओं को समायोजित करते हैं, और यह कि समाधान ट्यूबिंग सिस्टम से लीक नहीं हो रहा है (चित्रा 2 बी, आवर्धित क्षेत्र)।
    11. समाधान को कम से कम 2 घंटे के लिए नमूने को गर्म करने दें, या जब तक कि समाधान कंटेनर के अंदर जमा न हो जाए।
    12. वाल्व बंद करें और उपकरण से नमूने को सावधानीपूर्वक डिस्कनेक्ट करें। शेष घोल को कंटेनर में सूखा लें और इसे उचित रूप से निपटाएं।
    13. स्कैनिंग की तैयारी में नमूने से पैराफिन फिल्म को हटा दें।

Figure 2
चित्रा 2: कंट्रास्ट अनुप्रयोग के लिए छिड़काव दृष्टिकोण। छिड़काव तंत्र के छोटे (ए) और बड़े (बी) संस्करणों में एक आपूर्ति टैंक (एसटी) और दो प्लास्टिक ट्यूब (टी 1 और टी 2) शामिल हैं जो एक वाल्व (वीए) से जुड़े हैं। मेजबान स्टेम (एच) का समीपस्थ छोर जिसमें एक परजीवी (पी) होता है, जो हौस्टोरियम (एचए) के माध्यम से जुड़ा होता है, सिस्टम के खुले छोर (बी, विस्तारित) से जुड़ा होता है। टयूबिंग सिस्टम के अंदर हवा के बुलबुले के गठन को रोकने में मदद करने के लिए एक तीन-तरफा (सी) या दो-तरफा (डी) वाल्व का उपयोग किया जाता है, जो विपरीत समाधान (ई) के पारित होने को अवरुद्ध करता है। मेजबान स्टेम (एच) के समीपस्थ छोर की नोक को पानी के नीचे काट दिया जाता है ताकि कंट्रास्ट समाधान (एफ) पारित हो सके। ज़िप-टाई, वाल्व एडाप्टर, और विभिन्न व्यास के टयूबिंग सख्त कनेक्शन को सुरक्षित करने और सिस्टम (जी) में रिसाव से बचने में मदद करते हैं। आंकड़े 2 बी, डी और एफ बायोरेंडर के साथ बनाए गए थे। स्केल बार = 2 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. नमूना तैयारी और माउंटिंग

  1. नमूने को 2 मिनट के लिए पानी में डुबोकर धो लें।
    सावधानी: सिंक में नमूने न धोएं, क्योंकि सभी विपरीत समाधानों में उनकी संरचना में भारी धातु लवण शामिल हैं। धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले पानी को एक पतला विपरीत घोल के रूप में मानें और इसे उचित रूप से निपटाएं।
  2. नमूने के आकार के आधार पर अतिरिक्त पानी को 2-5 मिनट के लिए वाष्पित करने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर एक पेपर तौलिया में नमूना रखें। वैकल्पिक रूप से, एक पेपर तौलिया की सहायता से नमूने को थोड़ा सूखा लें। नमूने को पूरी तरह से सूखने न दें।
  3. नमूने को एक पतली परत तक खींचकर पैराफिन फिल्म में लपेटें। नमूने के शीर्ष पर पैराफिन फिल्म को मोड़ने से बचें।
  4. लपेटे गए नमूने को एक नमूना धारक पर माउंट करें, स्कैनिंग के दौरान घूमने के दौरान इसे स्थिर और स्थिति में रखें। जगह में नमूने को सुरक्षित करने के लिए चिपकने वाला टेप, कम घनत्व वाले फोम, पिपेट टिप्स और / या स्पष्ट प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग करें।
  5. नमूने को स्कैन करें और उपलब्ध माइक्रो-सीटी सिस्टम के लिए स्थापित विशिष्ट प्रोटोकॉल और दिशानिर्देशों का पालन करते हुए छवियों का विश्लेषण करें।

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Representative Results

परजीवी पौधों का हौस्टोरियम एक जटिल अंग है जिसमें विभिन्न ऊतक और सेल प्रकार शामिल होते हैं जो दूसरे पौधे के ऊतकों के साथ जुड़ते हैं और जुड़ते हैं, जिसका उपयोग मेजबान20 के रूप में किया जाता है। माइक्रो-सीटी स्कैनिंग का लाभ इस जटिल संरचना को गैर-विनाशकारी और त्रि-आयामी तरीके से बेहतर ढंग से समझने के लिए उठाया जा सकता है, जब छोटे (चित्रा 1 ए-सी) और बड़े (चित्रा 1 डी, ई) हॉस्टोरिया दोनों का विश्लेषण किया जाता है। ऐसा करने के लिए, परजीवी-मेजबान इंटरफ़ेस में विपरीत समाधान लागू किए जा सकते हैं, इस प्रकार उन नमूनों का विश्लेषण करना संभव हो जाता है जिनमें अन्यथा कम और समरूप एक्स-रे अवशोषण होता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित दो सरल दृष्टिकोण नमूने के माध्यम से प्रवेश में तेजी लाने के लिए विपरीत समाधान पर दबाव डालने पर भरोसा करते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, यहां वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न माइक्रो-सीटी सिस्टम के लिए काम करते हैं। हालांकि, सिस्टम और विश्लेषण किए गए नमूने (तालिका 1) के आधार पर स्कैनिंग सेटिंग्स और पैरामीटर भिन्न होते हैं।

कार्यात्मक समूह यूफाइटोइड परजीवी एंडोपारासाइट परजीवी बेल मिस्टलेटो (इसके पहले / बाद में) जड़ परजीवी
प्रजाति (परिवार) Pyrularia pubera Viscum minimum अमेरिका के बारे में Struthanthus Martianus साइबेलियम कवक।
परिवार Santalaceae Viscaceae Convolvulaceae लोरांथासी बालानोफोरेसी
कंट्रास्ट समाधान 3% फॉस्फोटुंगस्टेट 1% आयोडीन 1% आयोडीन 1% आयोडीन 0.2% सीसा नाइट्रेट
आवेदन विधि निर्वात निर्वात छिड़काव छिड़काव छिड़काव
माइक्रो-सीटी प्रणाली Zeiss Versa 620 निकॉन एक्स-टेक HMXST225 ब्रुकर स्काईस्कैन 1176 ब्रुकर स्काईस्कैन 1176 ब्रुकर स्काईस्कैन 1176
अनुमानों 4500 3140 610 1200 / 2400 5300
फ्रेम 1 1 3 (औसत) 3 / 3 (औसत) 3 (औसत)
एक्सपोजर (एमएस) 5000 1000 680 1600 / 830 750
फ़िल्टर (मिमी) कोई नहीं अल 0.25 अल 1.0 अल 1.0 / कोई नहीं
वोल्टेज (kV) 60 85 35 90 / 45 40
Current (μA) 108 80 375 180 / 390 600

तालिका 1: विश्लेषण किए गए नमूनों के लिए स्कैनिंग सेटिंग्स और पैरामीटर।

कंट्रास्ट एप्लिकेशन (चरण 2.3) के लिए पहले दृष्टिकोण के बाद, वैक्यूम का उपयोग दो घंटे के लिए 3% फॉस्फोटुंगस्टेट समाधान के साथ यूफाइटोइड परजीवी पी. प्यूबेरा के हौस्टोरियम को भरने के लिए किया गया था। नमूना तब 3 डी एक्स-रे माइक्रोस्कोप (एक्सआरएम) प्रणाली (सामग्री की तालिका देखें) में स्कैन किया गया था, माध्यमिक ऑप्टिकल आवर्धन4 के माध्यम से उच्च छवि रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया गया था। एक्सआरएम छवियों को परजीवी-होस्ट इंटरफ़ेस (चित्रा 3) में ऊतक संगठन और टोपोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण किए गए शारीरिक वर्गों के रूप में प्रभावी पाया गया। फॉस्फोटुंगस्टेट का उपयोग पैरेन्काइमा ऊतक की प्रचुरता पर प्रकाश डालता है, जो विपरीत एजेंट के उच्च अवशोषण के कारण एक उज्ज्वल सफेद टोन में दिखाई देता है। कंट्रास्ट के कम अवशोषण के कारण वाहिकाएं गहरे भूरे रंग की टोन में दिखाई देती हैं। इस रंग अंतर के आधार पर, हौस्टोरियम के संवहनी कोर के आसपास पैरेन्काइमा की बहुतायत का निरीक्षण करना संभव है (चित्रा 3)। संवहनी कोर के जटिल वाहिकाओं और पतले पैरेन्काइमा किस्में भी देखी जाती हैं, विशेष रूप से अनुदैर्ध्य वर्गों में (आंकड़े 3 ए-सी)। क्रॉस-सेक्शन में, संवहनी कोर को आसानी से पैरेन्काइमा (आंकड़े 3 डी, ई) द्वारा अलग किए गए दो संवहनी किस्में के रूप में देखा जाता है।

Figure 3
चित्र 3: यूफाइटोइड परजीवी हौस्टोरियम। वैक्यूम (बी-डी) का उपयोग करके 3% फॉस्फोटंगस्टेट समाधान के आवेदन के बाद हौस्टोरियम के माध्यम से अनुदैर्ध्य (ए-सी) और ट्रांसवर्सल (डी-ई) खंडों को प्रकाश माइक्रोस्कोप (ए, ई) के तहत और 3 डी एक्स-रे माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा गया था। लाल रूपरेखा पैरेन्काइमा ऊतक (पार) को इंगित करती है, और नीली रूपरेखा संवहनी कोर (वीसी) को इंगित करती है। एचएक्स: मेजबान जाइलम। एचबी: मेजबान छाल। स्केल बार = 500 μm (A, E) और 2.5 सेमी (B-D; Voxel आकार = 2.8382 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसी दृष्टिकोण का उपयोग एक रसीले मेजबान पौधे (यूफोरबिया पॉलीगोना, कैक्टेसी) के तने में कंट्रास्ट पेश करने के लिए किया गया था। यहां, प्रारंभिक हिस्टोकेमिकल विश्लेषण के आधार पर 1% आयोडीन समाधान को एक विपरीत एजेंट के रूप में चुना गया था, जिससे पता चला कि एंडोपारासाइट की पैरेन्काइमा कोशिकाएं स्टार्च के रूप में कार्बोहाइड्रेट स्टोर करती हैं (चित्रा 4 ए)। इसी समय, मेजबान कॉर्टेक्स में कोशिकाएं स्टार्च की पता लगाने योग्य मात्रा को संग्रहीत नहीं करती हैं (चित्रा 4 बी-डी)। कंट्रास्ट एप्लिकेशन के बाद, नमूना तब एक निकॉन एक्स-टेक माइक्रो-सीटी सिस्टम का उपयोग करके स्कैन किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)। आयोडीन अवशोषण में अंतर ने मेजबान शरीर के भीतर एंडोपारासाइट द्वारा गठित कॉर्टिकल स्ट्रैंड के जटिल जाल का पता लगाने की अनुमति दी (चित्रा 4 ई)। इस पद्धति के बाद, कॉर्टिकल स्ट्रैंड को मेजबान संवहनी केंद्र के चारों ओर ध्यान केंद्रित करने के लिए देखा गया और अंततः एक परजीवी फूल (आंकड़े 4 एफ, जी) के उत्सर्जन से जुड़े होने पर मेजबान स्टेम की परिधि की ओर शाखा की गई।

Figure 4
चित्रा 4: एंडोपारासाइट ऊतक नेटवर्क। शारीरिक (ए) और मैक्रो (बी-डी) खंड 1% आयोडीन समाधान के साथ प्रतिक्रिया दिखाते हैं जो दर्शाता है कि स्टार्च (काले रंग में सना हुआ) परजीवी के वाहिकाओं (वीई) से जुड़े पैरेन्काइमा (पार) में मौजूद है। चूंकि स्टार्च मेजबान कॉर्टेक्स (एचसी) और जाइलम (एचएक्स) में अनुपस्थित है, इसलिए मेजबान पृष्ठभूमि (एच) के खिलाफ देखे गए परजीवी कॉर्टिकल स्ट्रैंड ऊतकों (बैंगनी रूपरेखा, ई-जी) के विपरीत को बढ़ाने के लिए 1% आयोडीन समाधान का चुनिंदा रूप से उपयोग किया गया था। एक फूल (पीएफ) की उपस्थिति पुष्टि करती है कि सना हुआ ऊतक एंडोपारासाइट संरचना (ए, एफ, जी) का हिस्सा है। स्केल बार = 0.25 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यहां वर्णित दूसरे दृष्टिकोण (चरण 2.4) में, विपरीत समाधान वाले एक आपूर्ति टैंक को उस स्तर से उठाया जाता है जिसमें नमूना रखा जाता है, इस प्रकार नमूने के माध्यम से समाधान के पारित होने को चलाने के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग किया जाता है। कंट्रास्ट छिड़काव के बाद, स्कैनिंग एक ब्रुकर स्काईकेन माइक्रो-सीटी सिस्टम का उपयोग करके की गई थी (सामग्री की तालिका देखें)। सी. अमेरिकाना (आंकड़े 5ए, बी) और एस. मार्टियनस (आंकड़े 5सी-जी) के लिए प्राप्त परिणाम क्रमशः छोटे और बड़े दोनों नमूनों के लिए इस दृष्टिकोण की सुविधा को स्पष्ट करने में मदद करते हैं। 1% आयोडीन समाधान के पहले (चित्रा 5 सी, ई) और बाद में (चित्रा 5 डी, एफ) स्कैन किए गए नमूनों की तुलना करने से वुडी हॉस्टोरियम नमूनों में भी कंट्रास्ट एप्लिकेशन के महत्व पर जोर दिया जाता है। यह उल्लेखनीय है कि सी. अमेरिकाना और एस. मार्टियनस (चित्रा 5) और उनके संबंधित मेजबानों दोनों के बीच संबंधों में, परजीवियों के ऊतकों में स्टार्च की मात्रा बहुत कम होती है। यह एंडोपारासाइट वी न्यूनतम (चित्रा 4) के लिए वर्णित विभिन्न परिणामों की व्याख्या करता है, जिसमें एक ही विधि और प्रकार के कंट्रास्ट समाधान का उपयोग किया गया था।

Figure 5
चित्र 5: परजीवी बेल और मिस्टलेटो हौस्टोरियम। एक परजीवी बेल (ए, बी) और एक मिस्टलेटो (सी-जी) के हौस्टोरियम के माध्यम से अनुदैर्ध्य खंड। ताजा सामग्री के स्कैन और मैक्रो सेक्शन के बीच तुलना से पता चलता है कि जटिल हौस्टोरियम संरचना को माइक्रो-सीटी स्कैन (ए, बी) में अच्छी तरह से कैप्चर किया गया है। 1% आयोडीन समाधान के छिड़काव से पहले (सी, ई) और बाद (डी, एफ) के बीच लगाए गए नमूनों के बीच तुलना से पता चलता है कि लिग्निफाइड नमूनों में भी कंट्रास्ट बढ़ाया जाता है, जिससे परजीवी (पी) संरचनाओं जैसे एपिकॉर्टिकल रूट (गुलाबी तीर), संवहनी किस्में (नीले तीर), और सिंकर (पीले तीर) में वाहिकाओं के अवलोकन की सुविधा मिलती है। मेजबान जाइलम (एचएक्स) के वाहिकाओं और वार्षिक छल्ले और मेजबान छाल (एचबी) में स्टार्च भी अधिक आसानी से देखे जाते हैं। स्केल बार = 1 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यहां वर्णित छिड़काव प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त एक अंतिम परिणाम परजीवी और मेजबान पौधों के बीच संवहनी कनेक्शन का पता लगाने की संभावना है। यह मेजबान जड़ के एक खंड के माध्यम से 0.2% लीड नाइट्रेट समाधान को प्रतिस्थापित करके प्राप्त किया गया था, जिसके चारों ओर जड़ परजीवी एस फंगीफॉर्म का कंद विकसित हुआ था। कंट्रास्ट एप्लिकेशन के बाद, एक ब्रुकर स्काईस्कैन माइक्रो-सीटी सिस्टम का उपयोग करके स्कैनिंग भी की गई थी (सामग्री की तालिका देखें)। अनुक्रमिक अनुमानों से पता चलता है कि मेजबान जड़ में वाहिकाएं परजीवी कंद में विभाजित होती हैं (चित्रा 6 ए-सी)। इन परिणामों के विश्लेषण के बाद, उसी नमूने को एक छोटे उप-नमूने में काट दिया गया, शारीरिक अध्ययन के लिए तैयार किया गया, और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। इस उप-नमूने का सीरियल सेक्शनिंग पुष्टि करता है कि दो पौधों के बीच जाइलम निरंतरता छिद्र प्लेटों (चित्रा 6 डी-एफ) के माध्यम से पोत-से-पोत कनेक्शन द्वारा बनाई गई है।

Figure 6
चित्र 6: जड़ परजीवी हौस्टोरियम को बाध्य करना। माइक्रो-सीटी स्कैनिंग (ए-सी) और प्रकाश माइक्रोस्कोप (डी-एफ) के तहत देखे गए शारीरिक वर्गों के माध्यम से हॉस्टोरियम के माध्यम से अनुदैर्ध्य खंड। मेजबान जड़ (एचआर, गुलाबी रूपरेखा) की संवहनी प्रणाली के भीतर 0.2% लीड नाइट्रेट समाधान का संचय परजीवी ट्यूब (पीटी) के भीतर शाखाओं वाले मेजबान वाहिकाओं के अवलोकन और दो पौधों के बीच प्रत्यक्ष संवहनी संबंध का पता लगाने की अनुमति देता है (धराशायी सफेद रूपरेखा)। स्केल सलाखों = 1 सेमी (ए-सी) और 500 μm (डी-एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पौधे के ऊतक कंट्रास्ट में सुधार के लिए भारी धातु समाधान का उपयोग माइक्रो-सीटी विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करने में एक महत्वपूर्ण कदम बन गया है। पौधों की सूक्ष्म-आकृति विज्ञान प्रयोगशालाओं में आमतौर पर उपलब्ध कई यौगिकों का परीक्षण स्टैडलर एट अल द्वारा किया गया है, जो नमूनों को भेदने और कंट्रास्ट इंडेक्स8 को बढ़ाने में सबसे प्रभावी एजेंट के रूप में फॉस्फोटंगस्टेट का उपयोग करने की सलाह देते हैं। प्यूबेरा के हौस्टोरियम के विश्लेषण में यहां प्राप्त परिणाम इस सिफारिश की पुष्टि करते हैं। कंट्रास्ट एप्लिकेशन के संदर्भ में, स्टीडलर एट अल का वर्णन है कि कंट्रास्ट समाधान को 1 से8 दिनों के दौरान विश्लेषण की गई सामग्री (1 मिमी से 10 मिमी तक के फूल और फूलों की कलियों) के माध्यम से निष्क्रिय रूप से घुसपैठ की गई थी। अन्य लेखकों ने बड़े नमूनों का विश्लेषण करते समय विस्तारित अवधि (1-4 सप्ताह) में निष्क्रिय घुसपैठ के एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग किया है, जैसे कि एंडोपैरासिटिक रैफलेसिसी प्रजाति28 के 30 सेमी चौड़े फूल। हालांकि यह प्रक्रिया सफल साबित हुई है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिणाम बताते हैं कि घुसपैठ की प्रक्रिया को वैक्यूम के तहत काफी तेज किया जा सकता है, इस प्रकार पहले से स्थापित विधि में सुधार होता है। एक वैक्यूम चैंबर या पंप हवा को पौधे के ऊतकों से भागने के लिए मजबूर करता है, इस प्रकार विपरीत समाधान की आसान घुसपैठ की अनुमति देता है। वैक्यूम को नाजुक संरचनाओं पर भी लागू किया जा सकता है, जैसा कि यहां पी. प्यूबेरा के हौस्टोरियम और रसीले मेजबान पौधे ई. पॉलीगोना के नरम ऊतकों के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, वैक्यूम पंप का उपयोग प्लांट माइक्रो-आकृति विज्ञान की कई प्रयोगशालाओं में फिक्सेटिव की घुसपैठ या पदार्थों को एम्बेड करने के लिए एक सामान्य प्रक्रिया है, इस प्रकार इस प्रोटोकॉल को अधिक सुलभ बनाता है।

एक ही दृष्टिकोण का उपयोग यहां एक विपरीत एजेंट के साथ किया गया था जो विशिष्ट भंडारण यौगिकों के मौजूद होने पर चुनिंदा नमूनों को दाग देता है। जब वैक्यूम या निष्क्रिय घुसपैठ के माध्यम से लागू किया जाता है, तो उदाहरण के लिए, फॉस्फोटुंगस्टेट की तुलना में चयनात्मक धुंधलापन पूरे नमूने को खराब विपरीत वृद्धि प्रदान कर सकता है। दूसरी ओर, यह विशिष्ट पौधों की संरचनाओं या ऊतकों को उजागर करने के लिए फायदेमंद है। जैसा कि यहां बताया गया है, जब पिछले शारीरिक या हिस्टोकेमिकल विश्लेषण के साथ जोड़ा जाता है, तो आयोडीन जैसे चयनात्मक कंट्रास्ट एजेंटों का उपयोग मेजबान के शरीर के भीतर परजीवी पौधे के ऊतकों के भेदभाव में सहायता कर सकता है, बशर्ते कि परजीवी या मेजबान (लेकिन दोनों नहीं) प्रचुर मात्रा में स्टार्च भंडार दिखाते हैं। परजीवी ऊतकों के चुनिंदा एक्स-रे अवशोषण को विशेष रूप से उपयोगी दिखाया गया है, पहली बार, एक एंडोपैरासिटिक पौधे द्वारा गठित जटिल त्रि-आयामी नेटवर्क जैसे कि वी अपने मेजबान पौधे के तने के भीतर न्यूनतम । इसके अलावा, यह उल्लेखनीय है कि एंडोपैरासिटिक पौधे और कुछ कवक एक दिलचस्प विकासवादी अभिसरण दिखाते हैं, दोनों अपने जीवन चक्र के अधिकांश के लिए अपने मेजबानों के अंदर "गुप्त" बढ़ते हैं, केवल संक्षिप्त अवधिके दौरान उभरते हैं। इस प्रकार, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक संभावित नया अनुप्रयोग पौधे के ऊतकों के भीतर एंडोफाइटिक कवक का पता लगाने के लिए ब्रोमीन30 युक्त एक दाग फ्लोक्सिन बी का उपयोग करना होगा। ईओसिन, एक अन्य ब्रोमीन-आधारित धुंधला समाधान जो केवल पौधे के ऊतकों के लिए शायद ही कभी उपयोग किया जाता है, को एक विशिष्ट माइक्रो-सीटी सिस्टम31 का उपयोग करके विश्लेषण किए गए माउस किडनी के नमूनों में विरोधाभास को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक अन्य दृष्टिकोण मेजबान स्टेम या जड़ के संवहनी ऊतक के माध्यम से विपरीत एजेंटों का छिड़काव है। यह दृष्टिकोण, जो पहले रिपोर्ट किए गए तरीकों से काफी भिन्न है, स्पेरी एट अल के काम पर आधारित है, जिन्होंने हाइड्रोलिक चालकता32 का विश्लेषण करने के लिए सैफ्रानिन डाई के साथ लकड़ी के नमूनों को संक्रमित किया। जैसा कि लेखकों द्वारा चर्चा की गई है और यहां हाइलाइट किया गया है, प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम सिस्टम32 में हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए दाग-परफ्यूजिंग उपकरण स्थापित कर रहा है। तीन-तरफा वाल्व अस्थायी रूप से समाधान प्रवाह को अलग कर सकते हैं और तरल समूह32 से बुलबुले को खत्म कर सकते हैं। फिर भी, एम्बोली मेजबान पौधे के जहाजों के अंदर मौजूद हो सकती है, जो या तो नमूने के दौरान कृत्रिम रूप से या स्वाभाविक रूप से परजीवी पौधों की आम तौर पर उच्च वाष्पोत्सर्जन दर33,34 के कारण होती है। यह छिड़काव दक्षता को गंभीर रूप से कम कर सकता है, जिससे नमूने में विपरीत सुधार नहीं हो रहा है। इस समस्या को रोकने के लिए नमूने के बाद नमूना को ठीक करते समय कम से मध्यम वैक्यूम लागू करना आवश्यक है। पूरक रूप से, फ़िक्सेटिव समाधान का उपयोग करके उच्च दबाव में फ़िक्टेड नमूना फ्लश किया जा सकता है जिसमें नमूना संग्रहीत किया जाता है। फ्लशिंग हवा के बुलबुले32 को हटाकर नमूने में चालकता को बहाल करने में मदद कर सकता है, इस प्रकार कंट्रास्ट समाधान के छिड़काव के लिए मार्ग साफ हो सकता है। यदि ताजा सामग्री के साथ काम कर रहे हैं, तो नमूने के तुरंत बाद नमूने को पानी में डुबोकर, फिर इसे फिर से पानी के नीचे काटकर और तेज ब्लेड के साथ अंतिम सतह को चिकना करके पौधे में हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचा जा सकताहै।

इस दृष्टिकोण के बाद, मेजबान-परजीवी इंटरफ़ेस के अंतर को बढ़ाने के लिए सी अमेरिकाना और एस मार्टियनस के हौस्टोरियम के माध्यम से 1% आयोडीन समाधान को इंजेक्ट किया गया था। इन प्रजातियों के लिए प्राप्त परिणाम बताते हैं कि यहां वर्णित छिड़काव प्रोटोकॉल ताजा और स्थिर नमूने दोनों के लिए अच्छी तरह से काम करता है, और कंट्रास्ट समाधानों की शुरूआत लिग्निफाइड नमूनों में भी विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार करती है। ये अवलोकन टेक्सीरा-कोस्टा और सेकेन्टिंटी17 द्वारा रिपोर्ट किए गए परिणामों से सहमत हैं, जिन्होंने हौस्टोरियम संरचना के विशिष्ट पहलुओं की कल्पना करने के लिए 0.2% लीड नाइट्रेट समाधान लागू करने के लिए एक ही दृष्टिकोण का उपयोग किया। कार्बन डाइऑक्साइड के संपर्क में, लीड नाइट्रेट लीड कार्बोनेट क्रिस्टल से बना एक अत्यधिक अघुलनशील अवक्षेप बनाने के लिए प्रतिक्रिया करता है, जो कुशलतापूर्वक एक्स-रे 8,36 को अवशोषित करता है। एक बार नमूना संवहनी ऊतक में संक्रमित होने के बाद, यह अवक्षेप संवहनी गड्ढे कनेक्शन को बंद कर देता है, जिससे समाधान केवल छिद्र प्लेटों के माध्यम से प्रत्यक्ष, पोत-से-पोत कनेक्शन के माध्यम से प्रवाहित होता है। इस दृष्टिकोण के बाद, छिद्र प्लेटों के माध्यम से प्रत्यक्ष परजीवी-मेजबान जाइलम कनेक्शन की उपस्थिति को यहां एस फंगीफोरम के लिए दिखाया गया है और विस्तृत शारीरिक विश्लेषण के साथ पुष्टि की गई है। ये परिणाम हौस्टोरियम कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए इस दृष्टिकोण के एक और अनुप्रयोग को उजागर करते हैं। यह देखते हुए कि परजीवी-मेजबान असंगति या परजीवी के खिलाफ मेजबान प्रतिरोध के कारण हौस्टोरियम दीक्षा पूरी तरह कार्यात्मक अंग के विकास में समाप्त नहीं हो सकती है, यहां वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि क्या दो पौधों के बीच संवहनी कनेक्शन बनते हैं जिससे प्रभावी परजीवीवाद की घटना होती है। जाइलम एम्बोलिज्म की अधिक व्यापक रूप सेजांच करने के लिए माइक्रो-सीटी स्कैनिंग का उपयोग करने के मूल्य को ध्यान में रखते हुए, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल अन्य गैर-परजीवी पौधों की प्रजातियों में जाइलम एम्बोलिज्म के विज़ुअलाइज़ेशन और मात्रात्मक विश्लेषण में भी सुधार कर सकता है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल प्लांट माइक्रोटोमोग्राफी में अपेक्षित महत्वपूर्ण प्रगति में से एक तक पहुंचता है, जो कम एक्स-रे एब्सोर्पियन24 के साथ संरचनाओं को अलग करने में मदद करने के लिए विपरीत एजेंटों को लागू कर रहा है। जैसा कि यहां दिखाया गया है, कंट्रास्ट समाधान परजीवी पौधों और उनके मेजबानों के बीच इंटरफ़ेस पर हॉस्टोरियम संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन में काफी सुधार कर सकते हैं। स्टार्च जैसे आरक्षित यौगिकों के साथ प्रतिक्रिया करने में उनकी विशिष्टता के अनुसार विभिन्न यौगिकों को चुना जा सकता है, जो अक्सर परजीवी और मेजबान ऊतकों के बीच अलग-अलग वितरित होता है। हौस्टोरियम नमूनों में विपरीत आवेदन के दृष्टिकोण को परजीवी-होस्ट इंटरफ़ेस की विशिष्ट विशेषताओं की जांच करने के लिए भी चुना जा सकता है, जैसे कि प्रत्यक्ष पोत-से-पोत कनेक्शन। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को गैर-परजीवी प्रजातियों पर भी लागू किया जा सकता है, संभावित रूप से एंडोफाइटिक कवक का पता लगाने और जाइलम एम्बोलिज्म की मात्रा का ठहराव करने में सुधार हो सकता है। किसी भी आवेदन में, माइक्रोटोमोग्राफी विश्लेषण में सुधार के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल को अन्य उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी और स्वचालित आभासी विभाजन, इन पौधों और उनके मेजबानों के बीच संबंधके त्रि-आयामी विकास में नई और रोमांचक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

सिमोन गोम्स फरेरा (माइक्रोटोमोग्राफी प्रयोगशाला, साओ पाउलो विश्वविद्यालय, ब्राजील) और डॉ ग्रेग लिन (सेंटर फॉर नैनोस्केल सिस्टम, हार्वर्ड यूनिवर्सिटी, यूएसए) को विभिन्न माइक्रोटोमोग्राफी सिस्टम और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए उनकी सर्वोपरि सहायता और अपरिहार्य उपयोगकर्ता प्रशिक्षण के लिए धन्यवाद देना चाहता हूं। मैं कनेक्टिकट विश्वविद्यालय (यूएसए) में ईईबी ग्रीनहाउस के कर्मचारियों को भी धन्यवाद देता हूं, विशेष रूप से क्लिंटन मोर्स और मैथ्यू ओपेल को विस्कम न्यूनतम के नमूने प्रदान करने के लिए। जॉन वेनज़ेल ने पायरुलारिया पुबेरा के नमूने के लिए अवसर और बड़ी मदद प्रदान की। एमएससी कैरोलिना बास्टोस, एमएससी यास्मीन हिराओ, और तलिथा मोट्टा ने साइबलियम फंगीफॉर्म के नमूने के साथ बहुत मदद की। फर्नांडा ओलिवेरा और मारिया एलाइन नेवेस ने एंडोफाइटिक कवक के विश्लेषण के लिए फ्लोक्सिन बी के उपयोग के लिए संदर्भ प्रदान किया। व्रिजे यूनिवर्सिटी ब्रुसेल में वीडियो रिकॉर्डिंग डॉ फिलिप क्लेयस, डॉ क्रिस्टोफ स्नोएक, एमएससी जेक ग्रिफिथ, डॉ बाराबारा वेसेलका और डॉ हैरी ओल्ड वेंटरिंक की मदद से संभव हुई थी। उच्च शिक्षा कर्मियों के सुधार के लिए समन्वय (सीएपीएस, ब्राजील) और हार्वर्ड यूनिवर्सिटी हर्बरिया (यूएसए) द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D X-ray microscope (XRM) system Zeiss Versa 620 used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22 Zeiss Versa 620 Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software Nikon version XT 3.1.11 Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software Bruker version 3.3.1 Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software Object Research Systems - ORS version Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials Glass Vials Inc. SE V2708C-FM-SP Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X Zeiss version XT 3.1.11 Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N WR Chemicals BDH BDH7422-1 Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g Vetec 361.08 Sold by SPLab
Microtomography scanner Bruker Skyscan1176 Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner Nikon X-Tek HMXST225 Used for scanning the species V. minimum
NRecon software Bruker version 1.0.0 Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution Electron Microscopy Sciences 101410-756 Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm) Heathrow Scientific PM996 Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL Taylor 3478 Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4'' Nalge Nunc International SC63013-164 Sold by VWR - USA
Scanning system Nikon X-Tek HMXST225 used to scan Viscum minimum
Scanning system Bruker Skyscan 1176 used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software Zeiss version 16 Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve ToToT DMTWVS-5 Sold by Amazon USA
Two-part syringe HSW Henke-Ject 4850001000 Used without the plunger
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Teixeira-Costa, L. Leveraging Micro-CT Scanning to Analyze Parasitic Plant-Host Interactions. J. Vis. Exp. (179), e63423, doi:10.3791/63423 (2022).

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