Summary
Micro-CT는 식물 구조를 3차원으로 분석할 수 있는 비파괴 도구입니다. 현재 프로토콜은 기생 식물 구조 및 기능을 분석하기 위해 마이크로 CT를 활용하기 위한 샘플 준비를 설명합니다. 특정 제제와 결합 될 때이 방법의 장점을 강조하기 위해 다른 종이 사용됩니다.
Abstract
마이크로 CT 스캐닝은 식물의 구조와 기능을 조사하는 데 확립된 도구가 되었습니다. 3차원 시각화 및 가상 절편의 가능성과 결합된 비파괴적 특성으로 인해 복잡한 식물 기관에 대한 새롭고 점점 더 상세한 분석이 가능해졌습니다. 기생 식물과 숙주 사이를 포함하여 식물 간의 상호 작용도 탐구할 수 있습니다. 그러나 스캐닝 전 샘플 준비는 종종 조직 조직과 구성이 다른 이들 식물 간의 상호 작용으로 인해 중요합니다. 또한, 기생충 숙주 물질의 샘플링, 처리 및 준비 중에 고도로 감소된 식물체에서 나무, 허브 및 관목에 이르기까지 기생 꽃 식물의 광범위한 다양성을 고려해야 합니다. 여기에서는 haustorium 분석에 초점을 맞춰 기생충 및/또는 숙주 식물에 대조 용액을 도입하기 위한 두 가지 다른 접근 방식을 설명합니다. 이 기관은 두 식물 사이의 연결과 의사 소통을 촉진합니다. 간단한 접근 방식에 따라 euphytoid, 포도 나무 및 겨우살이 기생 종에 대해 여기에 표시된 것처럼 haustorium 조직 조직의 세부 사항을 3차원으로 탐색할 수 있습니다. 특정 조영제 및 적용 접근법을 선택하면 숙주 체내 기생충 확산을 자세히 관찰하고 여기에 표시된 것처럼 기생충과 숙주 사이의 직접적인 혈관 간 연결을 감지할 수 있습니다. 따라서 여기에서 논의된 프로토콜은 기생 꽃 식물의 광범위한 다양성에 적용하여 발달, 구조 및 기능에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
Introduction
고해상도 X선 마이크로컴퓨터 단층촬영(micro-CT)은 샘플의 여러 방사선 사진(투영)을 서로 다른 시야각에서 기록하고나중에 샘플의 가상 재구성을 제공하는 데 사용하는 이미징 방법입니다1. 그런 다음 이 가상 개체를 분석, 조작 및 분할하여 3차원에서 비파괴 탐색이 가능합니다2. 처음에는 의료 분석용으로 설계되었다가 나중에는 산업 응용 분야를 위해 설계된 micro-CT는 침습적 절차 없이 내부 장기와 조직을 시각화할 수 있는 이점도 제공합니다3. 다른 형태의 이미징과 마찬가지로 마이크로 CT는 시야와 픽셀 크기 사이의 균형을 유지하므로 큰 샘플의 고해상도 이미징은 거의 달성할 수 없습니다4. 고 에너지 X 선 소스 (즉, 싱크로트론) 및 2 차 광학 배율 사용의 발전이 지속적으로 이루어지고 있으며, 가장 작은 해상도가 100 nm 5,6 미만에 도달 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 큰 샘플의 경우 더 긴 스캔 시간이 필요하므로 스캐너 내부의 샘플 이동 또는 변형으로 인한 아티팩트 가능성이 높아집니다. 또한 마이크로 CT는 일반적으로 시료 내의 자연 밀도 변화와 시료가 X선과 상호 작용하는 방식에 의해 제한됩니다. 밀도가 높은 시료를 투과하는 데는 X선 선량이 더 많을수록 가장 좋지만, 시료와 주변 매질7 내부 및 그 사이의 밀도 변화를 포착하는 데는 덜 효율적이다. 반면, X선 선량이 낮을수록 투과력이 떨어지고 스캔 시간이 길어지지만 밀도 검출 감도가 더 높아진다7.
이러한 제한은 대부분의 식물 조직이 X선 흡수율이 낮은 빛(비조밀) 조직으로 구성되어 있다는 점을 감안할 때 식물 과학에서 현미경 촬영을 사용하는 데 오랫동안 방해가 되어 왔다8. micro-CT의 첫 번째 응용 프로그램은 토양 매트릭스 9,10 내의 뿌리 네트워크를 매핑하는 데 중점을 두었습니다. 나중에 나무와 같이 조직 밀도에 더 큰 차이가 있는 식물 구조가 탐구되기 시작했습니다. 이를 통해 목부 기능성11,12, 복잡한 조직 조직의 발달 13,14 및 식물 간의 상호 작용15,16,17에 대한 조사가 가능해졌습니다. 연질 및 균질 조직의 분석은 조영제로 인해 널리 보급되고 있으며, 이는 현재 식물 샘플의 마이크로 CT 스캐닝 준비의 표준 절차입니다. 그러나, 조영제 도입을 위한 프로토콜은 시료의 부피, 구조적 특성, 사용된 용액의 종류에 따라 다른 결과를 가질 수 있다8. 이상적으로는, 조영제는 상이한 조직들 사이의 구별을 강화하고, 조직/기관 기능 평가를 가능하게 하고, 및/또는 조직(18)에 대한 생화학적 정보를 제공해야 한다. 따라서 스캔 전 적절한 샘플 처리, 준비 및 장착은 모든 마이크로 CT 분석에 매우 중요합니다.
기생 식물 haustorium의 Micro-CT
기생 꽃 피는 식물은 haustorium으로 알려진 기관을 특징으로 하는 속씨식물의 뚜렷한 작용기를 나타냅니다 19. 변형된 줄기와 뿌리 사이의 발달 잡종인 이 다세포 기관은 숙주의 부착, 침투 및 기생충에 의한 접촉에 작용한다(20). 이러한 이유로 haustorium은 "식물들 사이의 기생에 대한 바로 그 아이디어를 구현"하는 것으로 간주됩니다.21. 이 기관의 발달, 구조 및 기능에 대한 자세한 이해는 기생 식물 생태학, 진화 및 관리 연구에 매우 중요합니다. 그럼에도 불구하고 기생 식물의 전반적인 복잡성과 고도로 변형된 구조 및 하우스토리아는 종종 상세한 분석과 비교를 방해합니다. Haustorium 연결은 또한 일반적으로 광범위하고 조직 및 세포 분포에서 균질하지 않습니다(그림 1). 이러한 맥락에서 작은 조직 조각으로 작업하면 조작이 더 쉽고 해상도가 높아질 수 있지만 기생 식물 haustorium과 같은 복잡한 구조의 3 차원 구조에 대한 잘못된 결론을 이끌어 낼 수 있습니다.
대부분의 기생 식물 종에 대한 하우스 토리움 해부학 및 미세 구조에 대한 방대한 문헌이 있지만, 기생충과 숙주 조직 사이의 3차원 조직과 공간적 관계는 아직 잘 연구되지 않고 있다17. Masumoto et al.22의 최근 연구에서 300개 이상의 직렬 반박형 마이크로톰 섹션이 이미지화되어 두 기생충 종의 하우스토리엄을 나타내는 3차원 가상 개체로 재구성되었습니다. 이 방법의 뛰어난 수준의 디테일은 하우스토리움의 세포 및 해부학적 3D 구조에 대한 전례 없는 통찰력을 제공합니다. 그러나 이러한 시간 소모적 인 기술은보다 광범위한 haustorium 연결을 가진 기생충에서 유사한 분석을 금지합니다. micro-CT의 사용은 기생 식물의 복잡하고 종종 부피가 큰 하우스토리아의 3차원 분석을 위한 훌륭한 도구로 부상합니다. 상세한 해부학적 절편 및 기타 보완적인 형태의 현미경 분석을 대체할 수는 없지만17,23, 특히 큰 샘플에 대한 마이크로 CT 스캐닝을 통해 얻은 결과는 더 작은 세그먼트의 하위 샘플링을 지시하는 가이드 역할을 할 수 있으며, 이는 컨포칼 및 전자 현미경과 같은 다른 도구를 사용하여 분석하거나 고해상도 마이크로 CT 시스템으로 재분석할 수 있습니다.
그림 1: 이 프로토콜에 사용된 다양한 작용기의 기생 식물. Euphytoid 기생충 Pyrularia pubera (A), 녹색 과일 (점선 검은 색 원), 기생 덩굴 Cuscuta americana (C), 겨우살이 Struthanthus martianus (D), 절대 뿌리 기생충 Scybalium fungiforme (E). 숙주 뿌리 (Hr) 또는 줄기 (Hs)의 세그먼트는 기생충 하우스 토륨 (P)에 대비를 적용하는 것을 용이하게합니다. 샘플에 기생충 모근/줄기(화살표)가 있으면 하우스 토리움 혈관 조직을 분석할 수 있습니다. 직사각형은 분석에 사용된 샘플의 세그먼트를 나타냅니다. 스케일 바 = 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
micro-CT가 식물 과학에서 점점 더 대중적인 기술이 됨에 따라 샘플 스캐닝, 3차원 재구성, 분할 및 분석을 다루는 가이드, 프로토콜 및 문헌이 있습니다 3,10,24. 따라서 이러한 단계는 여기에서 설명하지 않습니다. 모든 상상 기법과 마찬가지로 샘플의 적절한 처리 및 장착은 종종 간과되는 절차이기는 하지만 기본입니다. 이러한 이유로 이 프로토콜은 마이크로 CT 스캐닝을 위한 하우스 토리움 샘플 준비에 중점을 둡니다. 보다 구체적으로, 이 프로토콜은 호스토리움 샘플에 조영제를 도입하여 호스토리움의 다양한 조직 및 세포 유형의 시각화를 개선하고, 숙주 뿌리/줄기 내의 기생 조직의 검출을 용이하게 하고, 기생충-숙주 혈관 연결을 3차원으로 분석하는 두 가지 접근 방식을 설명합니다. 여기에 설명 된 제제는 다른 식물 구조의 분석에도 적용될 수 있습니다.
여기에 기술된 프로토콜의 편의성을 더 잘 설명하기 위해 5종이 사용되었다. 각 종은 기생 꽃 식물의 5 가지 기능 그룹 중 하나를 나타내므로 각 그룹의 기능과 관련된 특정 사항을 다룹니다. Pyrularia pubera (Santalaceae)는 땅에서 발아하여 기생충을 숙주의 뿌리에 연결하는 여러 haustoria를 형성하는 euphytoid 기생충을 나타 내기 위해 선택되었습니다25. 이러한 식물에 의해 생성된 하우스토리아는 종종 미약하고 숙주(26)(그림 1A)로부터 쉽게 찢어지므로, 보다 섬세한 취급 과정이 필요하다. 내부 기생충은 Viscum minimum (Viscaceae)로 표시됩니다. 이 작용기에 속하는 종들은 짧은 기간 동안 숙주의 몸 밖에서만 볼 수 있으며(그림 1B), 숙주 조직 내에 박혀 있는 현저히 감소된 균사체와 같은 세포 가닥으로 수명 주기의 대부분을 산다25. 세 번째 작용기는 기생 덩굴로 구성되며, 이 덩굴은 땅에서 발아하지만 숙주 식물의 줄기에 부착되는 여러 하우스토리아에 의존하여 기초적인 뿌리만 형성합니다25(그림 1C). 여기서, 이 작용기는 Convolvulaceae(Convolvulaceae)로 대표된다. 기생 덩굴과는 달리, 겨우살이는 숙주 식물의 가지에서 직접 발아하여 여러 개 또는 고독한 하우스토리아를 발달시킨다25. 이 작용기를 설명하기 위해 선택된 종은 Struthanthus martianus (Loranthaceae)로, 숙주 가지와 다양한 연결을 형성합니다 (그림 1D). micro-CT와 광학 현미경의 조합을 이용한 고독한 겨우살이 하우스토리아의 분석은 Teixeira-Costa & Ceccantini17에서 찾을 수 있습니다. 마지막으로, 절대 뿌리 기생충은 땅에서 발아하여 숙주 식물의 뿌리에 침투하는 종으로 구성되며, 초기 성장 단계부터 전적으로 의존한다25. 이 식물은 여기에서 Scybalium fungiforme (Balanophoraceae)으로 대표되며, 이는 큰 괴경과 같은 haustoria를 생산합니다 (그림 1E).
이 프로토콜에 사용된 모든 식물 샘플을 70% 포르말린 아세트산 알코올(FAA 70)에 고정했습니다. 샘플링 시 고정은 특히 후속 해부학적 분석이 필요한 경우 식물 조직을 보존하는 데 중요합니다. 기생 식물 haustorium의 경우, 이 기관은 종종 주로 목질화되지 않은 실질 세포로 구성되기 때문에 고정도 필수적이다20. 고정액의 제조를 포함하여, 식물 조직 고정을 위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서 찾을 수 있다27. 반면에, 어느 정도 고정제는 샘플의 물리적 및 화학적 특성을 변화시켜 특정 생체역학적 및 조직화학적 분석에 적합하지 않게 만들 수 있습니다. 따라서, 신선한 샘플, 즉 준비 직전에 수집된 고정되지 않은 물질도 이 프로토콜과 함께 사용할 수 있습니다. 새로운 샘플을 처리하는 방법과 고정된 재료에 대한 문제 해결 제안에 대한 자세한 내용은 토론 섹션에 제공됩니다.
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Protocol
1. 기생 식물 샘플 선택
- 부착된 숙주 줄기/뿌리 및 기생된 숙주 기관의 근위 및 원위 말단의 세그먼트를 포함하여 전체 기생 식물 haustorium을 수집합니다. 각 세그먼트의 이상적인 길이는 하우스 토리움 직경의 두 배에 해당합니다.
참고: 외측 haustoria의 경우 haustorium이 형성된 기생충 모체 줄기/뿌리의 일부를 포함합니다(그림 1A,B,D). 내부 기생충의 경우 기생충의 징후가 보이는 숙주 줄기/뿌리의 세그먼트를 수집합니다(그림 1B). 단자 연결의 경우 전체 플랜트를 수집해야 합니다(그림 1E). - 전체 샘플을 고정 용액(예: FAA)에 1:10의 부피 비율로 담그십시오(샘플: 고정액). 샘플의 크기에 따라 최소 1일 동안 샘플을 고정액에 두십시오27.
참고: 샘플은 스캔하기 전에 고정액에 보관하거나 보존 용액(예: 에탄올 70%)으로 옮길 수 있습니다. 후속 해부학적 분석이 보증되지 않는 경우에도 신선한 샘플을 사용할 수 있습니다(토론 섹션 참조). 신선한 재료로 작업하는 경우 조영제를 관류하는 장치를 설정 한 다음 샘플을 수집하십시오. 샘플이 마르지 않도록해야합니다.
2. 대조 용액의 적용
- 사용할 신청 방법을 선택했습니다. 소형(그림 2.3A) 또는 비목재(그림 1B) 샘플에 대해 진공 방법(1단계)을 사용합니다. 숙주 줄기/뿌리의 세그먼트를 포함하는 경우 더 큰 샘플에 관류 방법을 사용합니다(그림 1A,C-E).
- 다음 단계에서 선택한 접근 방식에 관계없이 샘플을 조작할 때 고무 장갑 및 기타 적절한 개인 보호 장비(예: 실험실 코트)를 착용하십시오.
주의 : 모든 대조 용액에는 중금속 염이 포함되어 있으므로 적절한 개인 보호 장비 없이 흄 후드 아래에서 취급해서는 안 됩니다. - 진공 방법의 경우 아래에 언급된 단계를 따르십시오.
- 적절한 바이알을 선택하고 라벨을 붙입니다. 바이알은 샘플과 대조 용액을 수용할 수 있을 만큼 충분히 커야 하며 일반적으로 1:10의 비율로 있어야 합니다. 바이알이 낮거나 중간 정도의 진공을 견딜 수 있는지 제조업체의 지침을 확인하십시오.
알림: 음압(진공)으로 인해 액체가 쏟아질 수 있으므로 바이알을 가장자리까지 채우지 마십시오. - 대조 용액 (1 % 요오드 또는 3 % 포스 포 텅스텐 산염, 재료 표 참조)과 함께 바이알에 샘플을 놓습니다. 그런 다음 바이알을 진공 챔버 또는 진공 펌프에 연결된 데시케이터에 놓습니다. 바이알에서 뚜껑을 제거한 다음 진공 챔버 또는 건조기를 닫습니다.
- 진공 챔버/데시케이터에 균열이 없는지, 진공 펌프에 오일이 충분한지 확인하십시오.
- 펌프의 탈진 밸브를 닫아 공기가 빠져나가는 것을 방지하고 챔버/데시케이터의 탈진 밸브를 열어 공기를 강제로 배출합니다.
- 펌프를 켜고 압력이 약 20"Hg에 도달할 때까지 기다립니다.
주의 : 이 프로세스는 일반적으로 빠르므로 진공 시스템을 방치하지 마십시오.
알림: 압력의 미터법 단위는 파스칼(Pa)이지만 대부분의 실험실 진공 펌프의 압력 게이지는 압력을 수은 인치("Hg), 제곱인치당 파운드(psi) 또는 막대로 표시합니다. 20" Hg는 약 67.7Pa, 10psi 또는 0.7bar와 같습니다. - 챔버/데시케이터 배기 밸브를 닫아 공기가 다시 들어가지 않도록 한 다음 펌프를 빠르게 끕니다.
- 샘플을 최소 2시간 동안 진공 상태로 두십시오. 더 큰 샘플은 대조 용액이 침투하는 데 더 오래 걸립니다.
- 원하는 기간이 지나면 대조 용액에서 샘플을 제거하여 스캔을 준비합니다.
- 챔버/데시케이터 배출 밸브를 천천히 열어 공기가 들어갈 수 있도록 합니다.
- 챔버/데시케이터의 압력이 완전히 소진될 때까지 기다린 다음(즉, 압력 게이지가 0에 가까워질 때까지) 조심스럽게 열어 s를 회수합니다.amp르.
- 대조 용액을 적절하게 버리고 샘플을 스캔할 준비를 하십시오.
- 적절한 바이알을 선택하고 라벨을 붙입니다. 바이알은 샘플과 대조 용액을 수용할 수 있을 만큼 충분히 커야 하며 일반적으로 1:10의 비율로 있어야 합니다. 바이알이 낮거나 중간 정도의 진공을 견딜 수 있는지 제조업체의 지침을 확인하십시오.
- 관류 방법의 경우 아래에 언급된 단계를 따르십시오.
- 샘플의 크기에 따라 대조 용액의 공급 탱크를 선택하십시오. 작은 샘플의 경우 50mL 주사기(바늘 또는 플런저 없음)(그림 2A) 또는 큰 샘플의 경우 1L 정맥 의료 키트(그림 2B)를 사용합니다.
- 투명 플라스틱 튜브(재료 표 참조)의 한쪽 끝을 공급 탱크에 연결한 다음 다른 쪽 끝을 양방향 또는 3방향 밸브에 연결합니다. 두 번째 튜브를 밸브의 다른 배출구에 연결합니다(그림 2A,B).
- 이전 단계에서 설정한 장치를 분해하지 않고 높은 위치에 공급 탱크를 고정하십시오.
알림: 탱크와 샘플 사이의 수직 거리는 용액 관류 압력을 결정합니다(그림 2B). 작은 샘플의 경우 20-50cm의 거리로 충분합니다. 큰 샘플의 경우 1m의 거리가 더 적합합니다. - 3방향(그림 2C) 또는 2방향(그림 2D) 밸브를 닫아 액체가 튜빙 시스템에서 빠져나가는 것을 방지한 다음 대조 용액을 공급 탱크에 붓습니다. 정맥 주사 의료 키트를 사용하는 경우 장치를 높은 위치에 고정하기 전에 백에 용액을 채우고 밸브를 닫으십시오.
- 튜빙 시스템을 따라 큰 기포가 형성되지 않도록 합니다(그림 2E). 필요한 경우 기포가 제거될 때까지 조영제가 튜브 밖으로 흘러나오도록 합니다. 밸브를 다시 닫고 장치를 제자리에 두십시오.
- 조영제의 관류를 위해 샘플을 준비하려면 액체(물, 에탄올 또는 고정제)에 담그고 샘플에서 숙주 줄기/뿌리의 근위 끝 끝을 잘라냅니다(그림 2F).
- 저장된 액체에서 샘플을 제거하고 건조를 피하기 위해 파라핀 필름으로 싸십시오. 샘플을 가까이에 두고 장치에 연결할 준비를 하십시오.
- 대조 용액이 천천히 흐르도록 밸브를 조심스럽게 열고 대조 용액이 쏟아지는 것을 방지하기 위해 시스템의 열린 끝을 약간 높은 위치로 유지하면서 탱크에 연결된 플라스틱 튜브를 채웁니다. 다시 말하지만, 튜브를 따라 큰 기포가 형성되지 않는지 확인하십시오.
- 샘플에서 호스트 스템/루트의 근위 끝을 튜빙 시스템의 열린 끝에 연결합니다(그림 2B, 확대 영역). 이 단계에서 시스템에 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 필요한 경우 장치에서 샘플을 분리하고 용액이 흐르도록 하여 시스템에서 기포를 제거합니다.
- 샘플을 장치에 연결한 상태로 유지하면서 대조 용액이 실험이 설정된 영역으로 누출되는 것을 방지하기 위해 용기 안에 넣습니다. 직경이 다른 튜브, 플라스틱 집타이 및 밸브 어댑터(그림 2G)를 사용하여 장치의 모든 연결이 잘 맞는지, 다양한 크기의 호스트 분기를 수용하는지, 용액이 튜브 시스템에서 누출되지 않는지 확인합니다(그림 2B, 확대 영역).
- 용액이 샘플을 최소 2시간 동안 또는 용액이 용기 내부에 축적될 때까지 관류하도록 합니다.
- 밸브를 닫고 장치에서 샘플을 조심스럽게 분리하십시오. 나머지 용액을 용기에 배출하고 적절하게 폐기하십시오.
- 스캔을 준비하기 위해 샘플에서 파라핀 필름을 제거합니다.
그림 2: 조영제 적용을 위한 관류 방식. 관류 장치의 소형(A) 및 대형(B) 버전은 공급 탱크(st)와 밸브(va)로 연결된 두 개의 플라스틱 튜브(t1 및 t2)를 포함합니다. 하우스토리엄(ha)을 통해 부착된 기생충(P)을 품고 있는 숙주 줄기(H)의 근위 말단은 시스템의 개방된 말단(B, 확장)에 연결됩니다. 3방향(C) 또는 2방향(D) 밸브는 튜빙 시스템 내부에 기포가 형성되어 대조 용액(E)의 통과를 차단하는 것을 방지하는 데 사용됩니다. 숙주 줄기(H)의 근위 단부의 끝은 대조 용액(F)의 통과를 허용하기 위해 수중에서 절단된다. 다양한 직경의 지퍼 타이, 밸브 어댑터 및 튜브는 더 단단한 연결을 고정하고 시스템(G)의 누출을 방지하는 데 도움이 됩니다. 그림 2B, D 및 F는 BioRender로 생성되었습니다. 스케일 바 = 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 시료 준비 및 장착
- 샘플을 물에 2분 동안 담가 세척합니다.
주의 : 세척하지 마십시오amp모든 대조 용액에는 중금속 염이 포함되어 있으므로 싱크대에서. 세척에 사용되는 물을 희석된 대조 용액으로 간주하고 적절하게 폐기하십시오. - 샘플의 크기에 따라 과도한 물이 2-5분 동안 증발할 수 있도록 실온에서 종이 타월에 샘플을 놓습니다. 또는 종이 타월을 사용하여 샘플을 약간 건조시킵니다. 샘플이 완전히 건조되지 않도록 하십시오.
- 샘플을 얇은 층으로 늘려서 파라핀 필름으로 감싼다. 샘플 위에 파라핀 필름을 접지 마십시오.
- 포장된 샘플을 샘플 홀더에 장착하여 스캔하는 동안 회전하는 동안 안정적으로 제자리에 유지합니다. 접착 테이프, 저밀도 폼, 피펫 팁 및/또는 투명 플라스틱 용기를 사용하여 샘플을 제자리에 고정합니다.
- 샘플을 스캔하고 사용 가능한 마이크로 CT 시스템에 대해 설정된 특정 프로토콜 및 지침에 따라 이미지를 분석합니다.
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Representative Results
기생 식물의 하우스토리엄(haustorium)은 숙주(host20)로 사용되는 다른 식물의 조직과 서로 얽히고 연결되는 상이한 조직 및 세포 유형을 포함하는 복잡한 기관이다. Micro-CT 스캐닝은 소형(그림 1A-C)과 대형(그림 1D,E)을 모두 분석할 때 비파괴적이고 3차원적인 방식으로 이 복잡한 구조를 더 잘 이해하는 데 활용할 수 있습니다. 이를 위해 대조 용액을 기생충-숙주 인터페이스에 적용할 수 있으므로 그렇지 않으면 X선 흡수가 낮고 균일한 샘플을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 두 가지 간단한 접근 방식은 샘플을 통한 침투를 가속화하기 위해 대조 용액에 압력을 가하는 데 의존합니다. 예상대로 여기에 설명된 프로토콜은 다양한 마이크로 CT 시스템에서 작동합니다. 그러나 스캐닝 설정 및 매개변수는 시스템 및 분석된 샘플에 따라 다릅니다(표 1).
| 작용기 | Euphytoid 기생충 | 내기생충 | 기생 덩굴 | 겨우살이(대비 전/후) | 절대 뿌리 기생충 |
| 종 (가족) | 피룰라리아 사춘기 | 비스쿰 최소 | 쿠스쿠타 아메리카나 | 스트루탄투스 마르티아누스 | Scybalium fungiforme |
| 가족 | 산타과 (Santalaceae) | 점성과 (Viscaceae) | Convolvulaceae (콘볼루과) | 로란타과 (Loranthaceae) | Balanophoraceae (발라노포라과) |
| 조영제 | 3 % 포스 포 텅스텐 산염 | 1 % 요오드 | 1 % 요오드 | 1 % 요오드 | 0.2% 질산납 |
| 신청 방법 | 진공 | 진공 | 관류 | 관류 | 관류 |
| Micro-CT 시스템 | 자이스 베르사 620 | 니콘 X-Tek HMXST225 | 브루커 스카이스캔 1176 | 브루커 스카이스캔 1176 | 브루커 스카이스캔 1176 |
| 예측 | 4500 | 3140 | 610 | 1200 / 2400 | 5300 |
| 프레임 | 1 | 1 | 3(평균) | 3 / 3 (평균) | 3(평균) |
| 노출(ms) | 5000 | 1000 | 680 | 1600 / 830 | 750 |
| 필터 (mm) | 없음 | 알 0.25 | 알루미늄 1.0 | 알루미늄 1.0 / 알루미늄 1.0 | 없음 |
| 전압 (kV) | 60 | 85 | 35 | 90 / 45 | 40 |
| 전류 (μA) | 108 | 80 | 375 | 180 / 390 | 600 |
표 1: 분석된 샘플에 대한 스캐닝 설정 및 매개변수.
조영제 적용을 위한 첫 번째 접근법(단계 2.3)에 이어, 진공을 사용하여 진공을 사용하여 euphytoid 기생충 P. pubera의 하우스토리엄을 3% 포스포텅스텐산염 용액으로 2시간 동안 관류했습니다. 그런 다음 샘플을 3D X선 현미경(XRM) 시스템(재료 표 참조)에서 스캔하여 2차 광학 배율4를 통해 높은 이미지 해상도를 달성했습니다. XRM 이미지는 기생충-숙주 계면에서 조직 조직과 토폴로지를 분석하기 위해 광학 현미경으로 분석한 해부학적 절편만큼 효과적인 것으로 관찰되었습니다(그림 3). 포스 포 텅스텐 산염의 사용은 조영제의 높은 흡수로 인해 밝은 흰색 톤으로 나타나는 실질 조직의 풍부함을 강조합니다. 혈관은 대비의 낮은 흡수로 인해 어두운 회색 톤으로 나타납니다. 이 색상 차이에 기초하여, haustorium의 혈관 코어를 둘러싼 실질의 풍부함을 관찰 할 수 있습니다 (그림 3). 혈관 코어 자체의 복잡한 혈관과 얇은 실질 가닥도 특히 세로 단면에서 관찰됩니다(그림 3A-C). 단면에서 혈관 코어는 실질에 의해 분리된 두 개의 혈관 가닥으로 쉽게 관찰됩니다(그림 3D, E).
그림 3 : Euphytoid 기생충 haustorium. 진공(B-D)을 사용하여 3% 인산 텅스텐산염 용액을 적용한 후 광학 현미경(A,E)과 3D X선 현미경을 통해 하우스토리엄을 통한 세로(A-C) 및 횡단(D-E) 단면을 관찰했습니다. 빨간색 윤곽선은 실질 조직(par)을 나타내고 파란색 윤곽선은 혈관 코어(vc)를 나타냅니다. Hx: 호스트 목부. Hb : 숙주 나무 껍질. 스케일 바 = 500 μm (A, E) 및 2.5 cm (B-D, 복셀 크기 = 2.8382 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
V. minimum에 의해 기생하는 즙이 많은 숙주 식물(Euphorbia polygona, Cactaceae)의 줄기에 대비를 도입하기 위해 동일한 접근 방식이 사용되었습니다. 여기서, 1 % 요오드 용액은 예비 조직 화학적 분석에 기초한 대조제로 선택되었으며, 이는 내 기생충의 실질 세포가 전분 형태로 탄수화물을 저장한다는 것을 보여 주었다 (그림 4A). 동시에, 숙주 피질의 세포는 검출 가능한 양의 전분을 저장하지 않습니다(그림 4B-D). 조영제 적용 후, 샘플은 Nikon X-Tek micro-CT 시스템을 사용하여 스캔되었습니다(재료 표 참조). 요오드 흡수의 차이는 숙주체 내의 내부 기생충에 의해 형성된 피질 가닥의 복잡한 웹을 검출할 수 있게 해주었습니다(그림 4E). 이 방법론에 따라 피질 가닥은 숙주 혈관 중심 주위에 집중되고 기생충 꽃의 발화와 관련될 때 결국 숙주 줄기 주변으로 분기되는 것으로 관찰되었습니다(그림 4F, G).
그림 4: Endoparasite 조직 네트워크. 해부학 적 (A) 및 매크로 (B-D) 섹션은 1 % 요오드 용액과의 반응을 보여 주며, 이는 전분 (검은 색으로 염색 됨)이 기생충의 혈관 (ve)과 관련된 실질 (par)에 존재한다는 것을 나타냅니다. 숙주 피질(Hc)과 목부(Hx)에는 전분이 없기 때문에 숙주 배경(H)에서 볼 수 있는 기생충 피질 가닥 조직(보라색 윤곽선, E-G)의 대비를 향상시키기 위해 1% 요오드 용액을 선택적으로 사용했습니다. 꽃(Pf)의 존재는 염색된 조직이 기생충 구조(A,F,G)의 일부임을 확인합니다. 스케일 바 = 0.25cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기에 설명된 제2 접근법(단계 2.4)에서, 대조 용액을 함유하는 공급 탱크는 샘플이 놓이는 레벨로부터 상승되고, 따라서 중력을 이용하여 샘플을 통한 용액의 통과를 구동한다. 조영제 관류 후, Bruker Skycan micro-CT 시스템을 사용하여 스캐닝을 수행하였다(재료 표 참조). C. americana(그림 5A,B) 및 S. martianus(그림 5C-G)에 대해 얻은 결과는 각각 작은 샘플과 큰 샘플 모두에 대한 이 접근 방식의 편리함을 설명하는 데 도움이 됩니다. 1% 요오드 용액의 관류 전(그림 5C,E)과 후(그림 5D,F)에서 스캔한 샘플을 비교하면 목질 하우스 샘플에서도 조영제 적용의 중요성이 강조됩니다. C. americana와 S. martianus(그림 5)와 각각의 숙주 사이의 연관성에서 기생충은 조직에 전분 함량이 거의 또는 전혀 없다는 점에 주목할 만합니다. 이것은 동일한 방법 및 유형의 조영제가 사용 된 endoparasite V. minimum (그림 4)에 대해 설명 된 다른 결과를 설명합니다.
그림 5 : 기생 덩굴과 겨우살이 haustorium. 기생 덩굴(A,B)과 겨우살이(C-G)의 하우스토리엄을 통과하는 세로 단면. 신선한 재료의 스캔과 매크로 섹션을 비교하면 복잡한 하우스 토리움 구조가 마이크로 CT 스캔(A, B)에서 잘 포착된다는 것을 알 수 있습니다. 1% 요오드 용액의 관류 전(C,E)과 후(D,F)의 고정된 시료를 비교하면 목질화된 시료에서도 대비가 향상되어 피질 뿌리(분홍색 화살촉), 혈관 가닥(파란색 화살촉) 및 싱커(노란색 화살촉)의 혈관과 같은 기생충(P) 구조의 관찰을 용이하게 합니다. 숙주 목부(Hx)의 혈관 및 연륜과 숙주 껍질(Hb)의 전분도 더 쉽게 관찰됩니다. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기에 설명된 관류 프로토콜로 얻은 최종 결과는 기생충과 숙주 식물 사이의 혈관 연결을 감지할 수 있는 가능성입니다. 이것은 절대 뿌리 기생충 S. fungiforme의 괴경이 발달 한 숙주 뿌리의 세그먼트를 통해 0.2 % 질산 납 용액을 관류함으로써 달성되었습니다. 조영제 적용 후 Bruker Skyscan micro-CT 시스템을 사용하여 스캐닝을 수행했습니다(재료 표 참조). 순차적 투영은 숙주 뿌리의 혈관이 기생충 괴경으로 분기된다는 것을 보여줍니다(그림 6A-C). 이러한 결과를 분석한 후, 동일한 샘플을 더 작은 하위 샘플로 절단하고, 해부학적 연구를 위해 준비하고, 광학 현미경을 사용하여 분석했습니다. 이 하위 샘플의 연속 절편은 두 식물 사이의 목부 연속성이 천공판을 통한 용기 간 연결에 의해 형성됨을 확인합니다(그림 6D-F).
그림 6 : 절대 뿌리 기생충 haustorium. 마이크로 CT 스캐닝(A-C)을 통해 관찰한 하우스토리엄을 통한 세로 절편과 광학 현미경(D-F)으로 관찰한 해부학적 절편. 숙주 뿌리의 혈관계 내에 0.2% 질산납 용액이 축적되면(Hr, 분홍색 윤곽선) 기생충관(Pt) 내에서 분기되는 숙주 혈관을 관찰하고 두 식물 사이의 직접적인 혈관 연결(점선 흰색 윤곽선)을 감지할 수 있습니다. 스케일 바 = 1cm(A-C) 및 500μm(D-F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
식물 조직 대비를 개선하기 위해 중금속 용액을 사용하는 것은 마이크로 CT 분석을 위한 샘플 준비에서 중요한 단계가 되었습니다. Staedler et al.은 식물 미세 형태학 실험실에서 일반적으로 사용할 수있는 몇 가지 화합물을 테스트했으며, 샘플을 관통하고 대비 지수를 높이는 데 가장 효과적인 약제로 포스 포 텅스텐 산염을 사용할 것을 권장합니다8. P. pubera 의 하우스 토리움 분석에서 얻은 결과는이 권장 사항을 뒷받침합니다. 조영제 적용의 관점에서, Steadler et al. 조영제가 1일에서 8일 동안 분석된 물질(1mm에서 10mm 범위의 꽃과 꽃봉오리)을 통해 수동적으로 침투되었다고 설명한다8. 다른 저자들은 내부 기생충 Rafflesiaceae종 28의 30cm 너비의 꽃과 같은 더 큰 샘플을 분석 할 때 장기간(1-4주)에 걸쳐 동일한 수동 침투 프로토콜을 사용했습니다. 이 공정은 성공적인 것으로 입증되었지만, 여기에 설명된 프로토콜로 얻은 결과는 침투 과정이 진공 하에서 상당히 가속화될 수 있음을 보여주며, 따라서 이전에 확립된 방법을 개선합니다. 진공 챔버 또는 펌프는 식물 조직에서 공기가 빠져나가도록 하여 조영제가 더 쉽게 침투할 수 있도록 합니다. 진공은 P. pubera 의 haustorium과 V. minimum에 의해 기생하는 즙이 많은 숙주 식물 E. polygona 의 연조직에 대해 여기에서 볼 수 있듯이 깨지기 쉬운 구조에도 적용될 수 있습니다 . 또한, 진공 펌프의 사용은 식물 미세 형태학의 많은 실험실에서 고정제의 침투 또는 매립 물질에 대한 일반적인 절차이므로 이 프로토콜에 더 쉽게 접근할 수 있습니다.
특정 저장 화합물이 존재하는 경우 샘플을 선택적으로 염색하는 대조제와 함께 동일한 접근법이 사용되었습니다. 진공 또는 수동 침투를 통해 적용 할 때, 선택적 염색은 예를 들어 포스 포 텅스텐 산염과 비교할 때 전체 샘플에 대한 대비 향상을 더 낮출 수 있습니다. 반면에 특정 식물 구조나 조직을 강조하는 데 유리합니다. 여기에 보고된 바와 같이, 이전의 해부학적 또는 조직화학적 분석과 결합할 때, 요오드와 같은 선택적 조영제의 사용은 기생충 또는 숙주(둘 다 아님)가 풍부한 전분 매장량을 보이는 경우 숙주의 신체 내에서 기생 식물 조직의 분화를 도울 수 있습니다. 기생충 조직의 X선 흡수를 선택적으로 증가시키는 것은 숙주 식물의 줄기 내에서 V.와 같은 기생 식물에 의해 형성된 복잡한 3차원 네트워크를 처음으로 탐색하는 데 특히 유용한 것으로 나타났습니다 . 더욱이, 내부 기생 식물과 특정 균류는 흥미로운 진화적 수렴을 보여주며, 둘 다 생애주기의 대부분 동안 숙주 내부에서 "시크릿"으로 성장하며 짧은 기간 동안에만 나타난다는 점은 주목할 만합니다 29. 따라서 여기에 설명된 프로토콜의 잠재적인 새로운 적용은 브롬30을 포함하는 염색인 플록신 B를 사용하여 식물 조직 내에서 내생 진균을 검출하는 것입니다. 식물 조직에만 거의 사용되지 않는 또 다른 브롬 기반 염색 용액인 에오신(Eosin)은 특정 마이크로 CT 시스템을 사용하여 분석된 마우스 신장 샘플에서 대비를 향상시키는 것으로 나타났습니다31.
이 프로토콜에 기술된 또 다른 접근법은 숙주 줄기 또는 뿌리의 혈관 조직을 통한 대조제의 관류이다. 이전에 보고된 방법과 크게 다른 이 접근 방식은 수력 전도도를 분석하기 위해 목재 샘플을 사프라닌 염료로 관류한 Sperry et al.의 작업을 기반으로 합니다32. 저자에 의해 논의되고 여기에서 강조된 바와 같이, 프로토콜의 중요한 단계는 시스템(32) 내로 기포를 도입하는 것을 피하기 위해 얼룩-관류 장치를 설정하는 것이다. 3방향 밸브는 용액 플럭스를 일시적으로 발산시키고 액체 압축기(32)로부터 기포를 제거할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 색전증은 숙주 식물의 혈관 내부에 존재할 수 있으며, 샘플링 중에 인위적으로 또는 기생 식물의 일반적으로 높은 증산률로 인해 자연적으로 발생할 수 있습니다33,34. 이는 관류 효율을 심각하게 감소시켜 샘플에서 대비가 개선되지 않도록 할 수 있습니다. 이 문제를 방지하기 위해 샘플링 후 표본을 고정할 때 낮거나 중간 정도의 진공을 적용하는 것이 중요합니다. 상보적으로, 고정된 시편은 검체가 저장되는 고정액을 사용하여 고압에서 세척할 수 있습니다. 플러싱은 기포(32)를 제거함으로써 샘플의 전도성을 회복시키는 것을 도울 수 있고, 따라서 조영제의 관류를 위한 경로를 클리어링한다. 신선한 재료로 작업하는 경우 샘플링 직후 시편을 물에 담근 다음 다시 수중에서 절단하고 날카로운 블레이드(35)로 끝 표면을 매끄럽게 하여 플랜트에 기포가 유입되는 것을 방지할 수 있습니다.
이 접근법에 따라, 1 % 요오드 용액은 C. americana 및 S. martianus의 haustorium을 통해 관류되어 전체적으로 숙주-기생충 계면의 대비를 향상 시켰습니다. 이러한 종에 대해 얻은 결과는 여기에 설명된 관류 프로토콜이 신선 샘플과 고정 샘플 모두에 대해 잘 작동하며 조영제를 도입하면 목질화된 샘플에서도 시각화가 향상된다는 것을 보여줍니다. 이러한 관찰은 Teixeira-Costa & Ceccantinti17이 보고한 결과와 일치하며, 이들은 동일한 접근 방식을 사용하여 0.2% 질산납 용액을 적용하여 하우스 토륨 구조의 특정 측면을 시각화했습니다. 이산화탄소와 접촉하여, 질산 납은 반응하여 탄산 납 결정으로 구성된 매우 불용성 침전물을 형성하며, 이는 X- 선 8,36을 효율적으로 흡수합니다. 샘플 혈관 조직에 관류되면 이 침전물은 혈관 구덩이 연결을 막아 용액이 천공 플레이트를 통해 직접 혈관 간 연결을 통해서만 흐를 수 있도록 합니다. 이 접근법에 따라 천공판을 통한 직접적인 기생충-숙주 목부 연결의 존재가 S. fungiforme에 대해 여기에 표시되고 상세한 해부학적 분석으로 확인됩니다. 이러한 결과는 하우스 기능을 테스트하기 위한 이 접근 방식의 추가 적용을 강조합니다. haustorium 개시가 기생충-숙주 비호환성 또는 기생충에 대한 숙주 저항성으로 인해 완전한 기능을 하는 기관의 발달로 절정에 달하지 않을 수 있다는 점을 감안할 때, 여기에 설명된 접근 방식은 두 식물 사이에 혈관 연결이 형성되어 효과적인 기생충의 발생으로 이어지는지 여부를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 목부 색전증을 보다 광범위하게 조사하기 위해 마이크로 CT 스캐닝을 사용하는 것의 가치를 고려할 때12,37, 여기에 제시된 프로토콜은 다른 비기생 식물 종에서 목부 색전증의 시각화 및 정량 분석도 개선할 수 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 식물 현미경 촬영에서 기대되는 중요한 발전 중 하나에 접근하며, 이는 낮은 X선 흡수24로 구조를 구별하는 데 도움이 되는 조영제를 적용하는 것입니다. 여기에서 볼 수 있듯이 대조 솔루션은 기생 식물과 숙주 사이의 경계면에서 하우스 토리움 구조의 시각화를 크게 향상시킬 수 있습니다. 전분과 같은 예비 화합물과 반응할 때의 특이성에 따라 다른 화합물을 선택할 수 있으며, 이는 종종 기생충 및 숙주 조직 사이에 다르게 분포됩니다. 하우스 토리움 샘플에 대한 대조 적용에 대한 접근 방식은 직접 혈관 간 연결과 같은 기생충-숙주 인터페이스의 특정 기능을 조사하기 위해 선택할 수도 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 비기생 종에도 적용될 수 있으며, 잠재적으로 내생 균류의 검출 및 목부 색전증의 정량화를 개선할 수 있습니다. 임의의 응용분야에서, 마이크로단층 촬영 분석을 개선하기 위해 여기에 기술된 프로토콜은 광학 투영 단층 촬영 및 자동화된 가상 분할과 같은 다른 도구와 결합되어, 이들 식물과 그들의 숙주 사이의 연결의 3차원적 발전에 대한 새롭고 흥미로운 통찰력을 제공할 수 있다38,39.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
다양한 현미경 촬영 시스템 및 데이터 분석 소프트웨어에 대한 최고의 도움과 필수 사용자 교육을 제공한 Simone Gomes Ferreira 박사(브라질 상파울루 대학교 현미경 촬영 실험실)와 Greg Lin 박사(미국 하버드 대학교 나노스케일 시스템 센터)에게 감사드립니다. 또한 미국 코네티컷 대학의 EEB 온실 직원, 특히 최소 비스쿰 표본을 제공한 클린턴 모스와 매튜 오펠에게도 감사드립니다. John Wenzel 박사는 Pyrularia pubera의 샘플링에 대한 기회와 큰 도움을 제공했습니다. 석사 Carolina Bastos, 석사 Yasmin Hirao 및 Talitha Motta는 Scybalium fungiforme의 샘플링에 큰 도움을 주었습니다. 석사 Ariadne Furtado, Drs. Fernanda Oliveira와 Maria Aline Neves는 내생 균류 분석을 위한 플록신 B의 사용에 대한 참고 자료를 제공했습니다. Vrije Universiteit Brussel의 비디오 녹화는 Philippe Claeys 박사, Christophe Snoeck 박사, Jake Griffith 박사, Barabara Veselka 박사 및 Harry Olde Venterink 박사의 도움으로 가능했습니다. 자금은 고등 교육 인력 개선을 위한 조정(CAPES, 브라질)과 Harvard University Herbaria(미국)에서 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems - ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR - USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR - USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR - USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR - USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
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