Summary
Mikro-BT, bitki yapılarını üç boyutlu olarak analiz edebilen tahribatsız bir araçtır. Mevcut protokol, parazitik bitki yapısını ve işlevini analiz etmek için mikro-BT'den yararlanmak için numune hazırlamayı açıklamaktadır. Belirli preparatlarla birleştirildiğinde bu yöntemin avantajlarını vurgulamak için farklı türler kullanılır.
Abstract
Mikro-BT taraması, bitki yapısını ve işlevini araştırmada yerleşik bir araç haline gelmiştir. Tahribatsız doğası, üç boyutlu görselleştirme ve sanal bölümleme olasılığı ile birleştiğinde, karmaşık bitki organlarının yeni ve giderek daha ayrıntılı analizine izin vermiştir. Paraziter bitkiler ve konakçıları da dahil olmak üzere bitkiler arasındaki etkileşimler de araştırılabilir. Bununla birlikte, taramadan önce numune hazırlama, genellikle doku organizasyonu ve kompozisyonunda farklılık gösteren bu bitkiler arasındaki etkileşim nedeniyle çok önemli hale gelir. Ayrıca, parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliği, oldukça azaltılmış bitkisel gövdelerden ağaçlara, bitkilere ve çalılara kadar, parazit konakçı materyalin örneklenmesi, işlenmesi ve hazırlanması sırasında dikkate alınmalıdır. Burada, haustoryumu analiz etmeye odaklanarak parazit ve / veya konakçı bitkilere kontrast çözeltileri sokmak için iki farklı yaklaşım açıklanmaktadır. Bu organ iki bitki arasındaki bağlantıyı ve iletişimi teşvik eder. Basit bir yaklaşımı takiben, haustorium doku organizasyonunun ayrıntıları, burada öfitoid, asma ve ökse otu parazitik türleri için gösterildiği gibi üç boyutlu olarak araştırılabilir. Spesifik zıt ajanların seçilmesi ve uygulama yaklaşımları, burada zorunlu bir kök parazit için gösterildiği gibi, konakçı vücutta endoparazit yayılımının ayrıntılı olarak gözlemlenmesine ve parazit ile konakçı arasındaki doğrudan damardan damara bağlantının tespit edilmesine de olanak tanır. Bu nedenle, burada tartışılan protokol, gelişimlerinin, yapılarının ve işlevlerinin anlaşılmasını ilerletmek için parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliğine uygulanabilir.
Introduction
Yüksek çözünürlüklü röntgen mikrobilgisayarlı tomografi (mikro-BT), bir numunenin çoklu radyografilerinin (projeksiyonlarının) farklı görüş açılarından kaydedildiği ve daha sonra numunenin sanal bir rekonstrüksiyonunu sağlamak için kullanıldığı bir görüntüleme yöntemidir1. Bu sanal nesne daha sonra analiz edilebilir, manipüle edilebilir ve bölümlere ayrılabilir, böylece üç boyutlu2'de tahribatsız keşif yapılabilir. Başlangıçta tıbbi analizler ve daha sonra endüstriyel uygulamalar için tasarlanan mikro-BT, invaziv prosedürlere gerek kalmadan iç organları ve dokuları görselleştirme avantajı da sunar3. Diğer görüntüleme biçimleri gibi, mikro-BT de görüş alanı ve piksel boyutu arasında bir denge ile çalışır, bu da büyük örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesinin neredeyse ulaşılamaz olduğu anlamına gelir4. Yüksek enerjili X-ışını kaynaklarının (yani senkrotron) ve ikincil optik büyütmenin kullanımındaki ilerlemeler sürekli olarak yapılmakta ve en küçük çözünürlüğün 100 nm 5,6'nın altına ulaşmasına izin verilmektedir. Bununla birlikte, büyük numuneler için daha uzun tarama süreleri gereklidir, bu da tarayıcı içindeki numune hareketi veya deformasyonu nedeniyle artefakt olasılığını artırır. Ayrıca, mikro-BT genellikle numune içindeki doğal yoğunluk değişimleri ve numunenin X-ışınları ile nasıl etkileşime girdiği ile sınırlıdır. Daha yoğun numunelere nüfuz etmek için daha yüksek bir X-ışını dozu en iyisi olsa da, numune ile çevresindeki ortam7 içindeki ve arasındaki yoğunluk değişikliklerini yakalamada daha az etkilidir. Öte yandan, daha düşük bir X-ışını dozu daha az penetrasyon gücü sunar ve genellikle daha uzun tarama süreleri gerektirir, ancak yoğunluk algılamada daha fazla hassasiyet gerektirir7.
Bu kısıtlamalar, çoğu bitki dokusunun düşük X-ışını emilimine sahip hafif (yoğun olmayan) dokudan oluştuğu göz önüne alındığında, bitki bilimleri için mikrotomografi kullanımını uzun zamandır engellemiştir8. Mikro-BT'nin ilk uygulamaları, toprak matrisi 9,10 içindeki kök ağlarının haritalandırılmasına odaklanmıştır. Daha sonra, ahşap gibi doku yoğunluğunda daha önemli farklılıklar gösteren bitki yapıları araştırılmaya başlandı. Bu, ksilem işlevselliğinin 11,12, karmaşık doku organizasyonlarının gelişiminin 13,14 ve bitkiler arasındaki etkileşimlerinaraştırılmasına izin vermiştir 15,16,17. Yumuşak ve homojen doku analizi, bitki örneklerinin mikro-BT taraması için preparatlarda artık standart prosedür olan kontrast maddeler nedeniyle yaygınlaşmaktadır. Bununla birlikte, kontrast tanıtımı protokolleri, numune hacmine, yapısal özelliklere ve kullanılan çözeltinin türüne bağlı olarak farklı sonuçlara sahip olabilir8. İdeal olarak, kontrast madde farklı dokular arasındaki ayrımı arttırmalı, doku/organ işlevselliğinin değerlendirilmesini sağlamalı ve/veya bir doku hakkında biyokimyasal bilgi sağlamalıdır18. Bu nedenle, taramadan önce yeterli numune tedavisi, hazırlanması ve montajı, herhangi bir mikro-BT analizi için çok önemli hale gelir.
Parazitik bitki haustoriumunun mikro-BT'si
Parazitik çiçekli bitkiler, haustorium19 olarak bilinen bir organ ile karakterize edilen anjiyospermlerin ayrı bir fonksiyonel grubunu temsil eder. Modifiye edilmiş bir kök ve bir kök arasındaki gelişimsel bir melez olan bu çok hücreli organ, konakçının bağlanmasına, nüfuz etmesine ve bir parazit20 ile temasına etki eder. Bu nedenle, haustoriumun "bitkiler arasındaki parazitizm fikrini somutlaştırdığı"21 düşünülmektedir. Bu organın gelişiminin, yapısının ve işleyişinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, parazitik bitki ekolojisi, evrimi ve yönetimi çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, parazitik bitkilerin genel karmaşıklığı ve yüksek oranda değiştirilmiş yapısı ve haustoria genellikle ayrıntılı analiz ve karşılaştırmayı engellemektedir. Haustorium bağlantıları da genellikle geniştir ve doku ve hücre dağılımında homojen değildir (Şekil 1). Bu bağlamda, küçük doku parçaları ile çalışmak daha kolay manipülasyon ve daha yüksek çözünürlük sağlarken, parazitik bitki haustorium gibi karmaşık yapıların üç boyutlu mimarisi hakkında hatalı sonuçlara yol açabilir.
Çoğu parazitik bitki türü için haustorium anatomisi ve ultrayapısı hakkında geniş bir literatür olmasına rağmen, parazit ve konakçı dokular arasındaki üç boyutlu organizasyon ve mekansal ilişki hala yeterince araştırılmamıştır17. Masumoto ve ark.22 tarafından yapılan yakın tarihli bir çalışmada, 300'den fazla seri yarı ince mikrotom bölümü görüntülendi ve iki parazit türünün haustoriumunu temsil eden üç boyutlu bir sanal nesneye yeniden yapılandırıldı. Bu yöntemin mükemmel ayrıntı seviyesi, haustoriumun hücresel ve anatomik 3-D yapısı hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlar. Bununla birlikte, böyle zaman alıcı bir teknik, daha kapsamlı haustorium bağlantılarına sahip parazitlerde benzer bir analizi yasaklayacaktır. Mikro-BT kullanımı, parazitik bitkilerin karmaşık ve genellikle hacimli haustorialarının üç boyutlu analizi için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıntılı anatomik kesitleme ve mikroskopi analizlerinin diğer tamamlayıcı formlarının yerine geçmese de17,23, özellikle büyük numuneler için mikro-BT taraması yoluyla elde edilen sonuçlar, daha sonra konfokal ve elektron mikroskobu gibi diğer araçlar kullanılarak analiz edilebilen veya yüksek çözünürlüklü mikro-BT sistemleriyle yeniden analiz edilebilen daha küçük segmentlerin alt örneklemesini yönlendirmek için bir rehber görevi görebilir.
Şekil 1: Bu protokolde kullanılan farklı fonksiyonel gruplara ait paraziter bitkiler. Euphytoid parazit Pyrularia pubera (A), endoparazit Viscum minimum (B) yeşil meyveler (kesikli siyah daire), parazitik asma Cuscuta americana (C), ökse otu Struthanthus martianus (D), zorunlu kök paraziti Scybalium fungiforme (E). Konakçı kökün (Hr) veya gövdenin (Hs) segmentleri, parazit haustoriuma (P) kontrast uygulanmasını kolaylaştırır. Numunede parazit ana kökü/gövdesinin (okların) varlığı, haustorium damar organizasyonunun analizine olanak sağlar. Dikdörtgenler, analiz için kullanılan numunenin segmentlerini gösterir. Ölçek çubukları = 2 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Mikro-BT, bitki bilimlerinde giderek daha popüler bir teknik haline geldikçe, örnek tarama, üç boyutlu rekonstrüksiyon, segmentasyon ve analiz 3,10,24 ile ilgili kılavuzlar, protokoller ve literatür bulunmaktadır. Bu nedenle, bu adımlar burada tartışılmayacaktır. Herhangi bir hayal etme tekniğinde olduğu gibi, numunelerin uygun şekilde işlenmesi ve montajı, çoğu zaman göz ardı edilen bir prosedür olmasına rağmen, temel bir prosedürdür. Bu nedenle, bu protokol mikro-BT taraması için haustorium örneklerinin hazırlanmasına odaklanmaktadır. Daha spesifik olarak, bu protokol, haustoriumdaki farklı dokuların ve hücre tiplerinin görselleştirilmesini iyileştirmek, konakçı kök / kök içindeki parazitik dokunun tespitini kolaylaştırmak ve parazit-konakçı vasküler bağlantılarını üç boyutlu olarak analiz etmek için haustoryum örneklerine kontrast maddeler sokmak için iki yaklaşımı açıklamaktadır. Burada açıklanan preparatlar, diğer bitki yapılarının analizine de uyarlanabilir.
Burada açıklanan protokolün rahatlığını daha iyi göstermek için beş tür kullanılmıştır. Her tür, parazitik çiçekli bitkilerin beş fonksiyonel grubundan birini temsil eder, böylece her grubun işlevselliği ile ilgili belirli noktaları ele alır. Pyrularia pubera (Santalaceae), toprakta çimlenen ve paraziti konakçılarının köklerine bağlayan çoklu haustoria oluşturan öfitoid parazitleri temsil etmek üzere seçildi25. Bu bitkiler tarafından yaratılan haustoria genellikle zayıftır ve konakçı26'dan kolayca ayrılır (Şekil 1A), bu nedenle daha hassas bir işleme süreci gerektirir. Endoparazitler burada Viscum minimum (Viscaceae) ile temsil edilir. Bu fonksiyonel gruptaki türler sadece kısa süreler için konakçılarının vücudunun dışında görülebilir (Şekil 1B) ve yaşam döngülerinin çoğunu konakçı dokuların içine gömülü hücrelerin önemli ölçüde azalmış ve miselli benzeri iplikçikleri olarak yaşarlar25. Üçüncü bir fonksiyonel grup, zeminde çimlenen, ancak konakçı bitkilerin gövdelerine bağlanan çoklu haustorialara dayanan sadece ilkel kökler oluşturan parazitik asmalardan oluşur25 (Şekil 1C). Burada, bu fonksiyonel grup Cuscuta americana (Convolvulaceae) ile temsil edilmektedir. Parazitik asmaların aksine, ökse otu doğrudan konakçı bitkilerinin dalları üzerinde çimlenir ve çoklu veya yalnız haustoria25 geliştirir. Bu fonksiyonel grubu göstermek için seçilen tür, konakçı dal ile çeşitli bağlantılar oluşturan Struthanthus martianus'tur (Loranthaceae). Mikro-BT ve ışık mikroskobu kombinasyonu kullanılarak yalnız ökse otu haustoria'nın analizi Teixeira-Costa &; Ceccantini17'de bulunabilir. Son olarak, zorunlu kök parazitleri, zeminde çimlenen ve en erken büyüme aşamalarından25'ten itibaren tamamen bağımlı oldukları konakçı bitkilerin köklerine nüfuz eden türlerden oluşur. Bu bitkiler burada büyük yumru benzeri haustoria üreten Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) ile temsil edilmektedir (Şekil 1E).
Bu protokolde kullanılan tüm bitki örnekleri% 70 formalin asetik asit alkolüne (FAA 70) sabitlenmiştir. Örnekleme üzerine sabitleme, özellikle daha sonraki anatomik analizlere ihtiyaç duyulduğunda, bitki dokularını korumak için çok önemlidir. Parazitik bitki haustorium durumunda, fiksasyon da önemlidir, çünkü bu organ genellikle öncelikle odunlaşmamış parankim hücrelerinden oluşur20. Fiksatif çözeltilerin hazırlanması da dahil olmak üzere bitki dokusu fiksasyonu için ayrıntılı protokoller başka bir yerde bulunabilir27. Öte yandan, fiksatifler az ya da çok bir dereceye kadar, bir numunenin fiziksel ve kimyasal özelliklerinde değişikliklere neden olabilir ve bu da numuneyi spesifik biyomekanik ve histokimyasal analizler için uygun hale getiremez. Böylece, taze numuneler, yani hazırlıktan hemen önce toplanan sabitlenmemiş malzeme de bu protokolle kullanılabilir. Yeni numunelerin nasıl işleneceğine ilişkin ayrıntılar ve sabitlenmiş malzeme için sorun giderme önerileri tartışma bölümünde verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Paraziter bitki numune seçimi
- Ekli konakçı kök / kök ve parazitli konakçı organın hem proksimal hem de distal uçlarının segmentleri dahil olmak üzere tüm parazitik bitki haustoriumunu toplayın; Her segmentin ideal uzunluğu, haustoriumun çapının iki katına eşdeğerdir.
NOT: Lateral haustoria için, haustoriumun oluştuğu parazit ana sapının/kökünün bir kısmını ekleyin (Şekil 1A,B,D). Endoparazitler için, parazit belirtilerinin görülebildiği konakçı sapının / kökünün bir segmentini toplayın (Şekil 1B). Terminal bağlantıları söz konusu olduğunda, tüm tesis toplanmalıdır (Şekil 1E). - Tüm numuneyi fiksatif çözeltiye (örneğin, FAA) 1:10'luk hacimsel bir oranda batırın (numune: fiksatif). Numunenin büyüklüğüne bağlı olarak numuneleri en az 1 gün fiksatif olarak bırakın27.
NOT: Numuneler taramadan önce fiksatif olarak saklanabilir veya bir koruyucu çözeltiye aktarılabilir (örneğin, etanol% 70). Yeni numuneler, sonraki anatomik analizin garanti edilmediği durumlarda da kullanılabilir (Tartışma bölümüne bakınız). Taze malzeme ile çalışıyorsanız, kontrast çözeltisinin perfüzyonu için aparatı kurun, ardından numuneyi toplayın. Numunenin kurumasına izin verilmemelidir.
2. Zıt çözümlerin uygulanması
- Kullanılacak uygulama yöntemini seçin. Küçük (Şekil 1A) veya odunsu olmayan (Şekil 1B) numuneler için vakum yöntemini (adım 2.3) kullanın. Konakçı sapının/kökünün bir segmentini içermesi koşuluyla daha büyük numuneler için perfüzyon yöntemini kullanın (Şekil 1A, C-E).
- Aşağıdaki adımlarda seçilen yaklaşımdan bağımsız olarak numuneyi manipüle ederken lastik eldiven ve diğer uygun kişisel koruma ekipmanlarını (ör. laboratuvar önlüğü) giyin.
DİKKAT: Tüm zıt çözeltiler, bileşimlerinde ağır metal tuzları içerir ve bu nedenle yeterli kişisel koruma ekipmanı olmadan ve bir duman davlumbazının altında kullanılmamalıdır. - Vakum yöntemi için aşağıda belirtilen adımları izleyin.
- Uygun bir şişe seçin ve etiketleyin. Flakon, numuneyi ve zıt çözeltiyi barındıracak kadar büyük olmalı, genellikle 1:10 oranında olmalıdır. Şişenin düşük ila orta vakuma dayanabileceğinden emin olmak için üreticinin talimatlarını kontrol edin.
NOT: Negatif basınç (vakum) sıvının dökülmesine neden olabileceğinden, şişeyi ağzına kadar doldurmayın. - Numuneyi zıt çözelti ile şişeye yerleştirin (% 1 iyot veya% 3 fosfotungstat, bakınız Malzeme Tablosu). Daha sonra şişeyi bir vakum pompasına bağlı bir vakum odasına veya kurutucuya yerleştirin. Kapağı şişeden çıkarın, ardından vakum odasını veya kurutucuyu kapatın.
- Vakum odasında/kurutucuda çatlak olmadığından ve vakum pompasında yeterli yağ bulunduğundan emin olun.
- Havanın dışarı akmasını önlemek için pompanın egzozyon valfini kapatın ve havayı dışarı çıkmaya zorlamak için haznenin/kurutucunun egzozyon valfini açın.
- Pompayı açın ve basınç yaklaşık 20" Hg'ye ulaşana kadar bekleyin.
DİKKAT: Bu işlem genellikle hızlıdır, bu nedenle vakum sistemini gözetimsiz bırakmayın.
NOT: Basınç için metrik sistem birimi Pascal (Pa) olsa da, çoğu laboratuvar vakum pompasındaki basınç göstergeleri basıncı inç cıva ("Hg"), inç kare başına pound (psi) veya çubuk cinsinden görüntüler. 20" Hg, yaklaşık 67,7 Pa, 10 psi veya 0,7 bar'a eşittir. - Havanın tekrar girmesini önlemek için hazne/kurutucu egzoz valfini kapatın, ardından pompayı hızla kapatın.
- Numuneyi en az 2 saat vakum altında bırakın; Daha büyük numuneler, zıt çözeltinin nüfuz etmesi için daha uzun süre gerektirir.
- İstenilen süreden sonra, taramaya hazırlamak için numuneyi zıt çözeltiden çıkarın.
- Havanın içeri girmesine izin vermek için hazne/kurutucu egzoz valfini yavaşça açın.
- Odadaki/kurutucudaki basıncın tamamen tükenmesini bekleyin (yani, basınç göstergesi 0'a yaklaşır), ardından numuneyi almak için dikkatlice açın.
- Zıt çözeltiyi uygun şekilde atın ve numuneyi tarama için hazırlıkta tutun.
- Uygun bir şişe seçin ve etiketleyin. Flakon, numuneyi ve zıt çözeltiyi barındıracak kadar büyük olmalı, genellikle 1:10 oranında olmalıdır. Şişenin düşük ila orta vakuma dayanabileceğinden emin olmak için üreticinin talimatlarını kontrol edin.
- Perfüzyon yöntemi için aşağıda belirtilen adımları izleyin.
- Numunenin boyutuna göre zıt çözelti için bir besleme tankı seçin. Küçük numuneler için 50 mL'lik bir şırınga (iğne veya piston olmadan) veya büyük numuneler için 1 L intravenöz tıbbi kit kullanın (Şekil 2B).
- Şeffaf bir plastik borunun bir ucunu (bakınız Malzeme Tablosu) besleme tankına bağlayın, ardından diğer ucunu iki yönlü veya üç bir vanaya bağlayın. İkinci bir boruyu valfteki farklı bir prize bağlayın (Şekil 2A,B).
- Önceki adımda kurulan aparatı sökmeden besleme tankını yüksek bir konumda sabitleyin.
NOT: Tank ile numune arasındaki dikey mesafe, çözelti perfüzyon basıncını belirleyecektir (Şekil 2B). Küçük numuneler için 20-50 cm'lik bir mesafe yeterlidir. Büyük numuneler için 1 m'lik bir mesafe daha yeterlidir. - Sıvının boru sisteminden çıkmasını önlemek için üç (Şekil 2C) veya iki yönlü (Şekil 2D) valfi kapatın, ardından kontrast çözeltisini besleme tankına dökün. İntravenöz bir tıbbi kit kullanıyorsanız, torbayı çözelti ile doldurun ve aparatı yüksek bir konuma sabitlemeden önce valfi kapatın.
- Boru sistemi boyunca büyük hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun (Şekil 2E). Gerekirse, kontrast çözeltisinin kabarcık çıkarılana kadar borudan akmasına izin verin. Vanayı tekrar kapatın ve aparatı yerinde bırakın.
- Numuneyi kontrast çözeltisinin perfüzyonuna hazırlamak için, sıvıya (su, etanol veya fiksatif) batırılmış halde tutun ve numunedeki konakçı sapının/kökün proksimal ucunun ucunu kesin (Şekil 2F).
- Numuneyi depolandığı sıvıdan çıkarın ve kurumasını önlemek için bir parafin filme sarın. Numuneyi yakınlarda tutun ve cihaza bağlanmaya hazır tutun.
- Zıt çözeltinin yavaşça akmasına izin vermek için vanayı dikkatlice açın ve zıt çözeltinin dökülmesini önlemek için sistemin açık ucunu hafifçe yükseltilmiş bir konumda tutarken tanka bağlı plastik boruyu doldurun. Yine, tüp boyunca büyük hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun.
- Numunedeki konakçı gövdenin/kökün proksimal ucunu boru sisteminin açık ucuna bağlayın (Şekil 2B, büyütülmüş bölge). Bu adım sırasında sisteme hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Gerekirse, numuneyi aparattan ayırın ve çözeltinin akmasına izin vererek hava kabarcıklarını sistemden çıkarın.
- Numuneyi cihaza bağlı tutarken, zıt çözeltinin deneyin kurulduğu alana sızmasını önlemek için bir kabın içine yerleştirin. Cihazdaki tüm bağlantıların iyi oturduğundan, çeşitli boyutlardaki ana dalları barındırdığından ve çözeltinin boru sisteminden sızmadığından emin olmak için farklı çaplarda tüpler, plastik fermuarlı bağlar ve valf adaptörleri kullanın (Şekil 2B, büyütülmüş bölge).
- Çözeltinin numuneyi en az 2 saat boyunca veya çözelti kabın içinde birikinceye kadar perfüze etmesine izin verin.
- Vanayı kapatın ve numuneyi cihazdan dikkatlice ayırın. Çözeltinin geri kalanını kabın içine boşaltın ve uygun şekilde atın.
- Taramaya hazırlanırken parafin filmi numuneden çıkarın.
Şekil 2: Kontrast uygulaması için perfüzyon yaklaşımı. Perfüzyon cihazının küçük (A) ve büyük (B) versiyonları, bir besleme tankı (st) ve bir valf (va) ile bağlanmış iki plastik tüp (t1 ve t2) içerir. Haustorium (ha) aracılığıyla kendisine bağlı bir parazit (P) taşıyan konakçı sapın (H) proksimal ucu, sistemin açık ucuna (B, genişlemiş) bağlanır. Boru sistemi içinde, kontrast çözeltinin (E) geçişini engelleyen hava kabarcıklarının oluşumunu önlemeye yardımcı olmak için üç yönlü (C) veya iki yönlü (D) valf kullanılır. Konakçı sapın (H) proksimal ucunun ucu, kontrast çözeltisinin (F) geçişine izin vermek için su altında kesilir. Fermuarlı bağlar, valf adaptörleri ve farklı çaplardaki borular, daha sıkı bağlantıların güvence altına alınmasına ve sistemde sızıntının önlenmesine yardımcı olur (G). Şekil 2B, D ve F BioRender ile oluşturulmuştur. Ölçek çubukları = 2 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
3. Numune hazırlama ve montaj
- Numuneyi 2 dakika suya batırarak yıkayın.
DİKKAT: Numuneleri lavaboda yıkamayın, çünkü tüm zıt çözeltiler bileşimlerinde ağır metal tuzları içerir. Yıkama için kullanılan suyu seyreltilmiş kontrast bir çözelti olarak düşünün ve uygun şekilde atın. - Numunenin boyutuna bağlı olarak fazla suyun 2-5 dakika buharlaşmasını sağlamak için numuneyi oda sıcaklığında bir kağıt havluya koyun. Alternatif olarak, numuneyi bir kağıt havlu yardımıyla hafifçe kurulayın. Numunenin tamamen kurumasına izin vermeyin.
- Numuneyi ince bir tabakaya gererek bir parafin filme sarın. Parafin filmi numunenin üzerine katlamaktan kaçının.
- Sarılmış numuneyi bir numune tutucuya monte edin, tarama sırasında dönerken sabit ve yerinde tutun. Numuneyi yerine sabitlemek için yapışkan bant, düşük yoğunluklu köpük, pipet uçları ve/veya şeffaf plastik kaplar kullanın.
- Numuneyi tarayın ve mevcut mikro-BT sistemi için oluşturulan belirli protokolleri ve yönergeleri izleyerek görüntüleri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parazitik bitkilerin haustoriumu, konakçı olarak kullanılan başka bir bitkinin dokularıyla iç içe geçen ve bağlanan farklı doku ve hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir organdır20. Mikro-BT taraması, hem küçük (Şekil 1A-C) hem de büyük (Şekil 1D, E) haustoria'yı analiz ederken bu karmaşık yapıyı tahribatsız ve üç boyutlu bir şekilde daha iyi anlamak için kullanılabilir. Bunu yapmak için, parazit-konakçı arayüzüne zıt çözeltiler uygulanabilir, böylece aksi takdirde düşük ve homojen X-ışınları emilimine sahip olacak numunelerin analiz edilmesi mümkün olur. Bu protokolde açıklanan iki basit yaklaşım, numune boyunca penetrasyonu hızlandırmak için zıt çözeltinin basınçlandırılmasına dayanır. Beklendiği gibi, burada açıklanan protokoller farklı mikro-BT sistemleri için çalışır. Bununla birlikte, tarama ayarları ve parametreleri sisteme ve analiz edilen örneğe bağlı olarak farklılık gösterir (Tablo 1).
| İşlevsel grup | Öfitoid parazit | Endoparazit | Parazitik asma | Ökse otu (kontrasttan önce/sonra) | Zorunlu kök paraziti |
| Türler (Aile) | Pyrularia pubera | Viscum minimum | Cuscuta americana | Struthanthus martianus | Scybalium fungiforme |
| Aile | Santalaceae | Viscaceae | Convolvulaceae | Loranthaceae | Balanophoraceae |
| Kontrast çözeltisi | %3 fosfotungstat | %1 iyot | %1 iyot | %1 iyot | % 0.2 kurşun nitrat |
| Uygulama yöntemi | vakum | vakum | Perfüzyon | Perfüzyon | Perfüzyon |
| Mikro-BT sistemi | Zeiss Versa 620 · | Nikon X-Tek HMXST225 | Bruker Skyscan 1176 · | Bruker Skyscan 1176 · | Bruker Skyscan 1176 · |
| Projeksiyon | 4500 | 3140 | 610 | 1200 / 2400 | 5300 |
| Çerçeve | 1 | 1 | 3 (ortalama) | 3 / 3 (ortalama) | 3 (ortalama) |
| Pozlama (ms) | 5000 | 1000 | 680 | 1600 / 830 | 750 |
| Filtre (mm) | hiç kimse | Al 0.25 | Al 1.0 | Al 1.0 / Al 1.0 | hiç kimse |
| Gerilim (kV) | 60 | 85 | 35 | 90 / 45 | 40 |
| Akım (μA) | 108 | 80 | 375 | 180 / 390 | 600 |
Tablo 1: Analiz edilen numuneler için tarama ayarları ve parametreleri.
Kontrast uygulaması için ilk yaklaşımı takiben (adım 2.3), öfitoid parazit P. pubera'nın haustoriumunu iki saat boyunca% 3'lük bir fosfotungstat çözeltisi ile perfüze etmek için vakum kullanıldı. Numune daha sonra bir 3D X-ışını mikroskobu (XRM) sisteminde tarandı (bkz. Malzeme Tablosu), ikincil optik büyütme4 ile yüksek görüntü çözünürlüğü elde edildi. XRM görüntülerinin, parazit-konakçı arayüzünde doku organizasyonunu ve topolojiyi analiz etmek için ışık mikroskobu altında analiz edilen anatomik kesitler kadar etkili olduğu gözlendi (Şekil 3). Fosfotungstat kullanımı, zıt maddenin yüksek emilimi nedeniyle parlak beyaz bir tonda görünen parankim dokusunun bolluğunu vurgulamaktadır. Damarlar, kontrastın düşük emilimi nedeniyle koyu gri bir tonda görünür. Bu renk farklılığına dayanarak, haustoriumun vasküler çekirdeğini çevreleyen parankim bolluğunu gözlemlemek mümkündür (Şekil 3). Vasküler çekirdeğin kendisinin girift damarları ve ince parankim iplikçikleri de özellikle uzunlamasına kesitlerde gözlenir (Şekil 3A-C). Kesitlerde vasküler çekirdek, parankim ile ayrılan iki vasküler iplikçik olarak kolayca gözlenir (Şekil 3D,E).
Resim 3: Euphytoid parazit haustorium. Haustoryum boyunca uzunlamasına (A-C) ve enine (D-E) kesitler, ışık mikroskobu (A, E) altında ve vakum (B-D) kullanılarak% 3 fosfotungstat çözeltisinin uygulanmasını takiben 3D X-ışını mikroskobu ile gözlendi. Kırmızı anahatlar parankim dokusunu (par) ve mavi ana hatlar vasküler çekirdeği (vc) gösterir. Hx: konakçı ksilem. Hb: konakçı kabuğu. Ölçek çubukları = 500 μm (A, E) ve 2,5 cm (B-D; voksel boyutu = 2,8382 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Aynı yaklaşım, V. minimum ile parazitlenmiş etli bir konakçı bitkinin (Euphorbia polygona, Cactaceae) sapına kontrast katmak için kullanılmıştır. Burada, endoparazitin parankim hücrelerinin karbonhidratları nişasta şeklinde depoladığını gösteren ön histokimyasal analize dayanarak% 1 iyot çözeltisi kontrast madde olarak seçildi (Şekil 4A). Aynı zamanda, konakçı korteksteki hücreler tespit edilebilir miktarda nişasta depolamaz (Şekil 4B-D). Kontrast uygulamasından sonra, numune daha sonra bir Nikon X-Tek mikro-CT sistemi kullanılarak tarandı (bkz. İyot emilimindeki fark, konakçı vücut içindeki endoparazit tarafından oluşturulan kortikal iplikçiklerin karmaşık ağının saptanmasına izin vermiştir (Şekil 4E). Bu metodolojiyi takiben, kortikal iplikçiklerin konakçı vasküler merkez etrafında yoğunlaştığı ve sonunda bir parazit çiçeğinin emersiyonu ile ilişkili olduğunda konakçı sapın çevresine doğru dallandığı gözlendi (Şekil 4F, G).
Şekil 4: Endoparazit doku ağı. Anatomik (A) ve makro (B-D) kesitler, parazitin damarları (ve) ile ilişkili parankimde (par) nişastanın (siyah boyalı) bulunduğunu gösteren% 1 iyot çözeltisi ile reaksiyon gösterir. Nişasta konakçı kortekste (Hc) ve ksilemde (Hx) bulunmadığından, konakçı arka planında (H) görülen parazit kortikal iplikçik dokularının (mor anahatlar, E-G) kontrastını arttırmak için% 1 iyot çözeltileri seçici olarak kullanılmıştır. Bir çiçeğin (Pf) varlığı, lekeli dokunun endoparazit yapısının (A, F, G) bir parçası olduğunu doğrular. Ölçek çubukları = 0,25 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Burada açıklanan ikinci yaklaşımda (adım 2.4), zıt çözeltiyi içeren bir besleme tankı, numunenin yerleştirildiği seviyeden yükseltilir, böylece çözeltinin numuneden geçişini sağlamak için yerçekimi kullanılır. Kontrast perfüzyonundan sonra, tarama Bruker Skycan mikro-BT sistemi kullanılarak gerçekleştirildi (bkz. C. americana (Şekil 5A,B) ve S. martianus (Şekil 5C-G) için elde edilen sonuçlar, sırasıyla hem küçük hem de büyük örnekler için bu yaklaşımın kolaylığını göstermeye yardımcı olmaktadır. %1 iyot çözeltisi perfüzyonundan önce (Şekil 5C,E) ve sonra (Şekil 5D,F) taranan numunelerin karşılaştırılması, odunsu haustoryum numunelerinde bile kontrast uygulamasının önemini vurgulamaktadır. Hem C. americana hem de S. martianus (Şekil 5) ve bunların konakçıları arasındaki ilişkilerde, parazitlerin dokularında nişasta içeriğinin çok az olması veya hiç olmaması dikkat çekicidir. Bu, aynı yöntemin ve kontrast çözeltisinin kullanıldığı endoparazit V. minimum (Şekil 4) için açıklanan farklı sonuçları açıklamaktadır.
Resim 5: Parazitik asma ve ökse otu haustorium. Parazitik bir asma (A, B) ve ökse otu (C-G) haustoriumundan uzunlamasına kesitler. Tarama ve taze materyalin makro kesiti arasındaki karşılaştırma, karmaşık haustorium yapısının mikro-BT taramalarında iyi yakalandığını göstermektedir (A, B). % 1 iyot çözeltisinin perfüzyonundan önce (C,E) ve sonra (D,F) sabitlenmiş numuneler arasındaki karşılaştırma, odunlaşmış numunelerde bile kontrastın arttığını ve epikortikal kökteki damarlar (pembe ok uçları), vasküler iplikçikler (mavi ok uçları) ve batırıcı (sarı ok ucu) gibi parazit (P) yapılarının gözlemlenmesini kolaylaştırdığını göstermektedir. Konakçı ksilemin (Hx) damarları ve yıllık halkaları ve konakçı kabuğundaki nişasta (Hb) da daha kolay gözlenir. Ölçek çubukları = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Burada açıklanan perfüzyon protokolü ile elde edilen nihai sonuç, parazitler ve konakçı bitkiler arasındaki vasküler bağlantıları tespit etme olasılığıdır. Bu, zorunlu kök paraziti S. fungiforme'nin yumrusunun geliştiği konakçı kökün bir segmenti boyunca% 0.2'lik bir kurşun nitrat çözeltisinin perfüze edilmesiyle elde edildi. Kontrast uygulamasından sonra, tarama Bruker Skyscan mikro-BT sistemi kullanılarak da gerçekleştirildi (bkz. Sıralı projeksiyonlar, konakçı kökündeki damarların parazit yumruya çatallandığını göstermektedir (Şekil 6A-C). Bu sonuçların analizini takiben, aynı örnek daha küçük bir alt numuneye kesildi, anatomik çalışma için hazırlandı ve ışık mikroskobu kullanılarak analiz edildi. Bu alt numunenin seri kesitlenmesi, iki bitki arasındaki ksilem sürekliliğinin, perforasyon plakaları aracılığıyla damardan damara bağlantı ile oluştuğunu doğrulamaktadır (Şekil 6D-F).
Şekil 6: Zorunlu kök parazit haustorium. Mikro-BT taraması (A-C) ve ışık mikroskobu (D-F) altında gözlenen anatomik kesitler ile gözlemlendiği gibi haustoryum boyunca uzunlamasına kesitler. Konakçı kökün vasküler sisteminde (Hr, pembe anahat) %0.2 kurşun nitrat çözeltisinin birikmesi, parazit tüpü (Pt) içinde dallanan konakçı damarların gözlemlenmesini ve iki bitki arasındaki doğrudan vasküler bağlantının (kesikli beyaz anahat) tespit edilmesini sağlar. Ölçek çubukları = 1 cm (A-C) ve 500 μm (D-F). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bitki dokusu kontrastını iyileştirmek için ağır metal çözeltilerinin kullanılması, mikro-BT analizi için numune hazırlamada çok önemli bir adım haline gelmiştir. Bitki mikromorfolojisi laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan çeşitli bileşikler, fosfotungstatın nüfuz eden numunelerde ve kontrast indeksi8'in arttırılmasında en etkili ajan olarak kullanılmasını öneren Staedler ve ark. tarafından test edilmiştir. Burada P. pubera haustoriumunun analizinde elde edilen sonuçlar bu öneriyi doğrulamaktadır. Kontrast uygulaması açısından, Steadler ve ark., kontrast çözeltisinin 1 ila 8 gün boyunca analiz edilen malzemeden (1 mm ila 10 mm arasında değişen çiçekler ve çiçek tomurcukları) pasif olarak sızdığını açıklamaktadır8. Diğer yazarlar, endoparazitik Rafflesiaceae türü28'in 30 cm genişliğindeki çiçekleri gibi daha büyük örnekleri analiz ederken uzun süreler boyunca (1-4 hafta) aynı pasif infiltrasyon protokolünü kullanmışlardır. Bu işlemin başarılı olduğu kanıtlanmış olsa da, burada açıklanan protokol ile elde edilen sonuçlar, infiltrasyon işleminin vakum altında önemli ölçüde hızlandırılabileceğini ve böylece daha önce belirlenmiş yöntemin geliştirilebileceğini göstermektedir. Bir vakum odası veya pompa, havayı bitki dokularından kaçmaya zorlar, böylece kontrast çözeltisinin daha kolay sızmasını sağlar. Vakum, burada P. pubera'nın haustorium'u ve etli konakçı bitki E. polygona'nın yumuşak dokuları için gösterildiği gibi kırılgan yapılara bile uygulanabilir. Ayrıca, vakum pompalarının kullanımı, bitki mikromorfolojisinin birçok laboratuvarında fiksatiflerin veya gömme maddelerinin sızması için yaygın bir prosedürdür, böylece bu protokolü daha erişilebilir hale getirir.
Aynı yaklaşım burada, spesifik depolama bileşikleri mevcutsa numuneleri seçici olarak boyayan kontrast bir ajanla kullanılmıştır. Vakum veya pasif infiltrasyon yoluyla uygulandığında, seçici boyama, örneğin fosfotungstat ile karşılaştırıldığında tüm numuneye daha zayıf kontrast artışı sağlayabilir. Öte yandan, belirli bitki yapılarını veya dokularını vurgulamak için faydalıdır. Burada bildirildiği gibi, önceki anatomik veya histokimyasal analizlerle birleştirildiğinde, iyot gibi seçici kontrast maddelerin kullanımı, parazit veya konakçının (ancak her ikisinin de değil) bol miktarda nişasta rezervi göstermesi koşuluyla, konakçının vücudundaki parazitik bitki dokusunun farklılaşmasına yardımcı olabilir. Parazit dokularının seçici olarak artan X-ışını emiliminin, ilk kez, konakçı bitkinin gövdesi içinde V. minimum gibi endoparaziter bir bitki tarafından oluşturulan karmaşık üç boyutlu ağı keşfetmek için özellikle yararlı olduğu gösterilmiştir. Dahası, endoparaziter bitkilerin ve bazı mantarların, her ikisi de yaşam döngülerinin çoğunda konakçılarının içinde "gizli" olarak büyüyen ve sadece kısa dönemlerde ortaya çıkan ilginç bir evrimsel yakınsama göstermeleri dikkat çekicidir29. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün potansiyel yeni bir uygulaması, bitki dokularındaki endofitik mantarları tespit etmek için brom30 içeren bir leke olan floksin B'yi kullanmak olacaktır. Bitki dokuları için nadiren kullanılan başka bir brom bazlı boyama çözeltisi olan Eozin'in, belirli bir mikro-BT sistemi31 kullanılarak analiz edilen fare böbrek örneklerinde kontrastı arttırdığı gösterilmiştir.
Bu protokolde açıklanan bir diğer yaklaşım, kontrast ajanların konakçı kök veya kökün vasküler dokusu boyunca perfüzyonudur. Daha önce bildirilen yöntemlerden önemli ölçüde farklı olan bu yaklaşım, hidrolik iletkenliği analiz etmek için ahşap örneklerini safranin boyası ile perfüze eden Sperry ve arkadaşlarının çalışmalarına dayanmaktadır32. Yazarlar tarafından tartışıldığı ve burada vurgulandığı gibi, protokoldeki kritik bir adım, sisteme hava kabarcıklarının girmesini önlemek için leke perfüzyon aparatını kurmaktır32. Üç valfler, çözelti akısını geçici olarak saptırabilir ve sıvı komplumn32'den kabarcıkları ortadan kaldırabilir. Bununla birlikte, emboli, örnekleme sırasında yapay olarak veya parazitik bitkilerin genel olarak yüksek terleme oranlarından dolayı doğal olarak ortaya çıkan konakçı bitkinin damarlarının içinde bulunabilir33,34. Bu, perfüzyon verimliliğini ciddi şekilde azaltabilir ve numunede kontrastın iyileştirilmemesine neden olabilir. Bu sorunu önlemek için numuneden sonra numuneyi sabitlerken düşük ila orta vakum uygulamak esastır. Ek olarak, sabitlenmiş numune, numunenin depolandığı fiksatif çözelti kullanılarak yüksek basınç altında yıkanabilir. Yıkama, hava kabarcıklarını32 gidererek numunedeki iletkenliğin geri kazanılmasına yardımcı olabilir, böylece kontrast çözeltisinin perfüzyon yolunu temizleyebilir. Taze malzeme ile çalışıyorsanız, numune numuneden hemen sonra suya batırılarak, daha sonra tekrar su altında kesilerek ve uç yüzeyin keskin bıçaklarla pürüzsüzleştirilmesiyle hava kabarcıklarının bitkiye girmesi önlenebilir35.
Bu yaklaşımı takiben, konakçı-parazit arayüzünün kontrastını bir bütün olarak arttırmak için% 1 iyot çözeltisi C. americana ve S. martianus'un haustoriumundan perfüze edildi. Bu türler için elde edilen sonuçlar, burada açıklanan perfüzyon protokolünün hem taze hem de sabitlenmiş numuneler için iyi çalıştığını ve kontrast çözeltilerinin eklenmesinin odunlaşmış numunelerde bile görselleştirmeyi geliştirdiğini göstermektedir. Bu gözlemler, haustoryum yapısının belirli yönlerini görselleştirmek için% 0.2'lik bir kurşun nitrat çözeltisi uygulamak için aynı yaklaşımı kullanan Teixeira-Costa & Ceccantinti17 tarafından bildirilen sonuçlarla aynı fikirdedir. Karbondioksit ile temas halinde, kurşun nitrat, X-ışınlarını verimli bir şekilde emen kurşun karbonat kristallerinden oluşan yüksek oranda çözünmez bir çökelti oluşturmak için reaksiyona girer 8,36. Numune vasküler dokusuna perfüze edildikten sonra, bu çökelti vasküler çukur bağlantılarını tıkar ve çözeltinin sadece perforasyon plakaları aracılığıyla doğrudan, damardan damara bağlantılardan akmasına izin verir. Bu yaklaşımı takiben, perforasyon plakaları yoluyla doğrudan parazit-konakçı ksilem bağlantılarının varlığı burada S. fungiforme için gösterilmiş ve ayrıntılı anatomik analizlerle doğrulanmıştır. Bu sonuçlar, haustorium işlevselliğini test etmek için bu yaklaşımın başka bir uygulamasını vurgulamaktadır. Haustorium inisiyasyonunun, parazit-konakçı uyumsuzluğu veya parazite karşı konakçı direnci nedeniyle tamamen işlevsel bir organın gelişmesiyle sonuçlanmayabileceği göz önüne alındığında, burada açıklanan yaklaşım, etkili parazitizmin ortaya çıkmasına yol açan iki bitki arasında vasküler bağlantıların oluşup oluşmadığını test etmek için kullanılabilir. Ksilem embolilerini daha geniş bir şekilde araştırmak için mikro-BT taramasının kullanılmasının değeri göz önüne alındığında12,37, burada sunulan protokol, diğer parazitik olmayan bitki türlerinde ksilem embolisinin görselleştirilmesini ve kantitatif analizini de geliştirebilir.
Sonuç olarak, bu protokol, düşük X-ışını absorpsiyonu24 ile yapıları ayırt etmeye yardımcı olmak için zıt maddeler uygulayan bitki mikrotomografisinde beklenen kritik gelişmelerden birine yaklaşmaktadır. Burada gösterildiği gibi, kontrast çözeltileri, parazitik bitkiler ve konakçıları arasındaki arayüzde haustorium yapılarının görselleştirilmesini önemli ölçüde iyileştirebilir. Farklı bileşikler, parazit ve konakçı dokular arasında genellikle farklı şekilde dağılmış olan nişasta gibi rezerv bileşiklerle reaksiyona girmedeki özgüllüklerine göre seçilebilir. Haustoryum örneklerine kontrast uygulamasına yaklaşım, parazit-konakçı arayüzünün doğrudan damardan gemiye bağlantı gibi spesifik özelliklerini araştırmak için de seçilebilir. Ayrıca, bu protokol parazitik olmayan türlere de uygulanabilir, potansiyel olarak endofitik mantarların tespitini ve ksilem embolisinin miktarını iyileştirir. Herhangi bir uygulamada, mikrotomografi analizini geliştirmek için burada açıklanan protokol, optik projeksiyon tomografisi ve otomatik sanal segmentasyon gibi diğer araçlarla birleştirilerek, bu tesisler ile konakçıları arasındaki bağlantının üç boyutlu gelişimine yeni ve heyecan verici bilgiler sağlayabilir38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Simone Gomes Ferreira'ya (Mikrotomografi Laboratuvarı, Sao Paulo Üniversitesi, Brezilya) ve Dr. Greg Lin'e (Nano Ölçekli Sistemler Merkezi, Harvard Üniversitesi, ABD) farklı mikrotomografi sistemleri ve veri analiz yazılımları için üstün yardımları ve vazgeçilmez kullanıcı eğitimleri için teşekkür ederim. Ayrıca Connecticut Üniversitesi'ndeki (ABD) EEB Sera personeline, özellikle Clinton Morse ve Matthew Opel'e Viscum minimum örneklerini sağladıkları için teşekkür ediyorum. Dr. John Wenzel, Pyrularia pubera'nın örneklenmesi için fırsat ve büyük yardım sağladı. Carolina Bastos, Yasmin Hirao ve Talitha Motta, Scybalium fungiforme'un örneklenmesinde büyük ölçüde yardımcı oldu. Yüksek Lisans Ariadne Furtado ve Dr. Fernanda Oliveira ve Maria Aline Neves, endofitik mantarların analizi için floksin B kullanımı için referans sağlamıştır. Brüksel Vrije Üniversitesi'nde video kaydı, Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka ve Dr. Harry Olde Venterink'in yardımıyla mümkün oldu. Finansman, Yüksek Öğretim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES, Brezilya) ve Harvard Üniversitesi Herbarisi (ABD) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems - ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR - USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR - USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR - USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR - USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
References
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
- Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
- Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
- Sakdinawat, A., Attwood, D.
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
- Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
- Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
- Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
- da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
- Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
- Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
- Lusic, H., Grinstaff, M. W.
- Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
- Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
- Kuijt, J. The Biology of Parasitic Flowering Plants. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).
- Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
- Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
- Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
- Simpson, B. B.
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).
- Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
- Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
- Largent, D., Johnson, D., Watling, R. How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
- Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
- Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
- Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).
