Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Utnytte mikro-CT-skanning for å analysere parasittiske plante-vert-interaksjoner

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63423
Automatic Translation
1,2
1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Summary

Micro-CT er et ikke-destruktivt verktøy som kan analysere plantestrukturer i tre dimensjoner. Den foreliggende protokollen beskriver prøveprepareringen for å utnytte mikro-CT for å analysere parasittisk plantestruktur og funksjon. Ulike arter brukes til å markere fordelene ved denne metoden når de kombineres med spesifikke preparater.

Abstract

Micro-CT-skanning har blitt et etablert verktøy for å undersøke anleggets struktur og funksjon. Dens ikke-destruktive natur, kombinert med muligheten for tredimensjonal visualisering og virtuell seksjonering, har tillatt ny og stadig mer detaljert analyse av komplekse planteorganer. Interaksjoner mellom planter, inkludert mellom parasittiske planter og deres verter, kan også utforskes. Imidlertid blir prøvepreparering før skanning avgjørende på grunn av samspillet mellom disse plantene, som ofte varierer i vevsorganisasjon og sammensetning. Videre må det brede mangfoldet av parasittiske blomstrende planter, alt fra sterkt reduserte vegetative kropper til trær, urter og busker, vurderes under prøvetaking, behandling og tilberedning av parasittvertsmateriale. Her beskrives to ulike tilnærminger for å introdusere kontrastløsninger i parasitten og/eller vertsplantene, med fokus på å analysere haustorium. Dette organet fremmer forbindelse og kommunikasjon mellom de to plantene. Etter en enkel tilnærming kan detaljer om haustoriumvevsorganisasjon utforskes tredimensjonalt, som vist her for eufytoide, vinranker og mistelteinparasittiske arter. Valg av spesifikke kontrastmidler og applikasjonsmetoder tillater også detaljert observasjon av endoparasittspredning i vertskroppen og påvisning av direkte kar-til-fartøy-forbindelse mellom parasitt og vert, som vist her for en obligatorisk rotparasitt. Dermed kan protokollen diskutert her brukes på det brede mangfoldet av parasittiske blomstrende planter for å fremme forståelsen av deres utvikling, struktur og funksjon.

Introduction

Høyoppløselig røntgenmikrocomputertomografi (mikro-CT) er en avbildningsmetode der flere røntgenbilder (projeksjoner) av en prøve registreres fra forskjellige synsvinkler og senere brukes til å gi en virtuell rekonstruksjon av prøven1. Dette virtuelle objektet kan deretter analyseres, manipuleres og segmenteres, noe som tillater ikke-destruktiv utforskning i tre dimensjoner2. Opprinnelig designet for medisinske analyser og senere for industrielle applikasjoner, gir micro-CT også fordelen av å visualisere indre organer og vev uten behov for invasive prosedyrer3. Som andre former for bildebehandling fungerer mikro-CT med en avveining mellom synsfeltet og pikselstørrelsen, noe som betyr at høyoppløselig avbildning av store prøver er nesten uoppnåelig4. Fremskritt i bruk av røntgenkilder med høy energi (dvs. synkrotron) og sekundær optisk forstørrelse blir stadig gjort, slik at den minste oppløsningen kan nå under 100 nm 5,6. Likevel er lengre skanningstider nødvendig for store prøver, noe som øker sjansen for artefakter på grunn av prøvebevegelse eller deformasjon inne i skanneren. Videre er mikro-CT generelt begrenset av naturlige tetthetsvariasjoner i prøven og hvordan prøven interagerer med røntgenstråler. Mens en høyere røntgendose er best for å trenge inn i tettere prøver, er den mindre effektiv til å fange variasjoner i tetthet innenfor og mellom prøven og dens omkringliggende medium7. På den annen side gir en lavere røntgendose mindre penetrasjonskraft og krever ofte lengre skanningstider, men mer følsomhet i tetthetsdeteksjon7.

Disse restriksjonene har lenge hindret bruken av mikrotomografi for plantevitenskap, gitt at de fleste plantevev består av lett (ikke-tett) vev med lav røntgenabsorpsjon8. De første anvendelsene av mikro-CT var fokusert på å kartlegge rotnettverk i jordmatrisen 9,10. Senere begynte plantestrukturer med mer signifikante forskjeller i vevstetthet, som tre, å bli utforsket. Dette har gjort det mulig å undersøke xylemfunksjonalitet11,12, utvikling av komplekse vevsorganisasjoner 13,14 og interaksjoner mellom planter15,16,17. Analysen av bløt og homogent vev blir utbredt på grunn av kontrastmidler, som nå er standard prosedyre i forberedelser til mikro-CT-skanning av planteprøver. Protokoller for kontrastinnføring kan imidlertid ha forskjellige resultater avhengig av prøvevolum, strukturelle egenskaper og typen løsning som brukes8. Ideelt sett bør kontrastmiddelet øke skillet mellom forskjellige vev, muliggjøre vev / organfunksjonalitetsevaluering og / eller gi biokjemisk informasjon om et vev18. Derfor blir tilstrekkelig prøvebehandling, klargjøring og montering før skanning avgjørende for enhver mikro-CT-analyse.

Micro-CT av parasittplanten haustorium
Parasittiske blomstrende planter representerer en distinkt funksjonell gruppe angiospermer preget av et organ kjent som haustorium19. Dette flercellede organet, en utviklingshybrid mellom en modifisert stamme og en rot, virker på vertens vedlegg, penetrasjon og kontakt av en parasitt20. Av denne grunn anses haustorium å "legemliggjøre selve ideen om parasittisme blant planter"21. En detaljert forståelse av dette organets utvikling, struktur og funksjon er avgjørende for parasittisk planteøkologi, evolusjon og ledelsesstudier. Likevel hindrer parasittiske planters generelle kompleksitet og svært modifiserte struktur og haustoria ofte detaljert analyse og sammenligning. Haustoriumforbindelser er også vanligvis omfattende og ikke homogene i vev og cellefordeling (figur 1). I denne sammenheng, mens arbeid med små vevfragmenter tillater lettere manipulering og høyere oppløsning, kan det føre til feilaktige konklusjoner om den tredimensjonale arkitekturen av komplekse strukturer, som for eksempel det parasittiske anlegget haustorium.

Selv om det finnes en enorm litteratur om haustoriumanatomi og ultrastruktur for de fleste parasittiske plantearter, er den tredimensjonale organiseringen og det romlige forholdet mellom parasitt og vertsvev fortsatt dårlig utforsket17. I et nylig arbeid av Masumoto et al.22 ble over 300 serielle halvtynne mikrotomseksjoner avbildet og rekonstruert til et tredimensjonalt virtuelt objekt som representerer haustorium av to parasittarter. Denne metodens utmerkede detaljnivå gir enestående innsikt i haustoriums cellulære og anatomiske 3D-struktur. En slik tidkrevende teknikk vil imidlertid forby en lignende analyse hos parasitter med mer omfattende haustoriumforbindelser. Bruken av mikro-CT fremstår som et utmerket verktøy for tredimensjonal analyse av komplekse og ofte klumpete haustorier av parasittiske planter. Selv om det ikke er en erstatning for detaljert anatomisk seksjonering og andre komplementære former for mikroskopianalyser17,23, kan resultater oppnådd via mikro-CT-skanning, spesielt for store prøver, også tjene som en veiledning for å lede delprøvetaking av mindre segmenter, som deretter kan analyseres ved hjelp av andre verktøy, for eksempel konfokal og elektronmikroskopi, eller analyseres på nytt med høyoppløselige mikro-CT-systemer.

Figure 1
Figur 1: Parasittiske planter av forskjellige funksjonelle grupper brukt i denne protokollen. Eufytoid parasitt Pyrularia pubera (A), endoparasitt Viscum minimum (B) med grønne frukter (stiplet svart sirkel), parasittisk vintreet Cuscuta americana (C), misteltein Struthanthus martianus (D), obligate rotparasitt Scybalium fungiforme (E). Segmenter av vertsroten (Hr) eller stammen (Hs) letter påføringen av kontrast i parasitten haustorium (P). Tilstedeværelsen av parasitt moderrot/stamme (piler) i prøven tillater analyse av haustoriumkarets organisasjon. Rektangler angir segmenter av prøven som brukes til analyse. Skalastenger = 2 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Etter hvert som mikro-CT blir en stadig mer populær teknikk innen plantevitenskap, er det guider, protokoller og litteratur som omhandler prøveskanning, tredimensjonal rekonstruksjon, segmentering og analyse 3,10,24. Dermed vil disse trinnene ikke bli diskutert her. Som med enhver tenketeknikk er passende behandling og montering av prøver en grunnleggende, om enn ofte en oversett prosedyre. Av denne grunn fokuserer denne protokollen på utarbeidelse av haustoriumprøver for mikro-CT-skanning. Mer spesifikt beskriver denne protokollen to tilnærminger for å introdusere kontrastmidler i haustoriumprøver for å forbedre visualiseringen av forskjellige vev og celletyper i haustorium, for å lette påvisning av parasittvev i vertsroten / stammen, og for å analysere parasitt-vert vaskulære forbindelser i tre dimensjoner. Preparatene beskrevet her kan også tilpasses analysen av andre plantestrukturer.

Fem arter ble brukt for å bedre illustrere bekvemmeligheten av protokollen beskrevet her. Hver art representerer en av de fem funksjonelle gruppene av parasittiske blomstrende planter, og adresserer dermed spesifikke punkter knyttet til funksjonaliteten til hver gruppe. Pyrularia pubera (Santalaceae) ble valgt for å representere eufytoide parasitter, som spirer i bakken og danner flere haustoria som forbinder parasitten med røttene til vertene25. Haustoria skapt av disse plantene er ofte tynne og lett revet fra hverandre fra verten26 (figur 1A), og krever dermed en mer delikat håndteringsprosess. Endoparasitter er representert her av Viscum minimum (Viscaceae). Arter i denne funksjonelle gruppen er bare synlige utenfor kroppen til vertene sine i korte perioder (figur 1B) og lever mesteparten av livssyklusen som betydelig reduserte og mycellignende tråder av celler innebygd i vertsvev25. En tredje funksjonell gruppe består av parasittiske vinstokker, som spirer på bakken, men danner bare rudimentære røtter, avhengig av flere haustorier som fester seg til stilkene til vertsplanter25 (figur 1C). Her er denne funksjonelle gruppen representert av Cuscuta americana (Convolvulaceae). I motsetning til parasittiske vinstokker spirer mistelteiner direkte på grenene til vertsplantene og utvikler enten flere eller ensomme haustoria25. Arten som er valgt for å illustrere denne funksjonelle gruppen er Struthanthus martianus (Loranthaceae), som danner ulike forbindelser med vertsgrenen (figur 1D). Analyse av solitær misteltein haustoria ved hjelp av en kombinasjon av mikro-CT og lysmikroskopi finnes i Teixeira-Costa & Ceccantini17. Til slutt omfatter obligatoriske rotparasitter arter som spirer på bakken og trenger inn i røttene til vertsplanter, som de er helt avhengige av fra de tidligste vekststadiene25. Disse plantene er her representert av Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), som produserer store knolllignende haustoria (figur 1E).

Alle planteprøver brukt i denne protokollen ble fiksert i en 70% formalineddiksyrealkohol (FAA 70). Fiksering ved prøvetaking er avgjørende for å bevare plantevev, spesielt hvis det er behov for etterfølgende anatomiske analyser. Når det gjelder parasittisk plantehaustorium, er fiksering også viktig, da dette organet ofte primært består av ikke-lignifiserte parenkymceller20. Detaljerte protokoller for fiksering av plantevev, inkludert fremstilling av fikserende løsninger, finnes andre steder27. På den annen side kan fikseringsmidler i større eller mindre grad forårsake endringer i prøvens fysiske og kjemiske egenskaper, noe som gjør den uegnet for spesifikke biomekaniske og histokjemiske analyser. Dermed kan ferske prøver, dvs. ikke-fiksert materiale samlet umiddelbart før tilberedning, også brukes med denne protokollen. Detaljer om hvordan du håndterer ferske prøver og feilsøkingsforslag for fiksert materiale er gitt i diskusjonsdelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Valg av parasittisk planteprøve

  1. Samle hele parasittisk plantehaustorium, inkludert den vedlagte vertsstammen / roten og segmenter av både proksimale og distale ender av det parasitiserte vertsorganet; Den ideelle lengden på hvert segment tilsvarer dobbelt så stor diameter som haustorium.
    MERK: For lateral haustoria, inkluder en del av parasitten moderstamme/rot som haustorium ble dannet fra (figur 1A,B,D). For endoparasitter, samle et segment av vertsstammen/roten der tegn på parasitten er synlige (figur 1B). Ved terminalforbindelser skal hele anlegget samles (figur 1E).
  2. Senk hele prøven i fiksativ løsning (f.eks. FAA) i en volumetrisk proporsjon på 1:10 (prøve: fiksativ). La prøvene ligge i fiksativ i minst 1 dag, avhengig av størrelsen på prøven27.
    MERK: Prøver kan lagres i fiksativ før skanning eller overføres til en konserveringsløsning (f.eks. etanol 70%). Ferske prøver kan også brukes dersom den påfølgende anatomiske analysen ikke er berettiget (se diskusjonsdelen). Hvis du arbeider med nytt materiale, sett opp apparatet for perfusjon av kontrastoppløsningen, og samle deretter prøven. Prøven skal ikke få tørke ut.

2. Påføring av kontrasterende løsninger

  1. Velg applikasjonsmetoden som skal brukes. Bruk vakuummetoden (trinn 2.3) for små (figur 1A) eller ikke-treaktige (figur 1B) prøver. Bruk perfusjonsmetoden for større prøver, forutsatt at den inkluderer et segment av vertsstammen/roten (figur 1A, C-E).
  2. Bruk gummihansker og annet egnet personlig verneutstyr (f.eks. laboratoriefrakk) når du manipulerer prøven, uavhengig av tilnærmingen som er valgt i de følgende trinnene.
    FORSIKTIG: Alle kontrasterende løsninger inkluderer tungmetallsalter i sammensetningen, og bør derfor ikke håndteres uten tilstrekkelig personlig verneutstyr og under en avtrekkshette.
  3. For vakuummetoden, følg trinnene som er nevnt nedenfor.
    1. Velg et passende hetteglass og merk det. Hetteglasset må være stort nok til å romme prøven og kontrastoppløsningen, vanligvis i en andel på 1:10. Kontroller instruksjonene fra produsenten for å sikre at hetteglasset tåler lavt til moderat vakuum.
      MERK: Ikke fyll hetteglasset til randen, da undertrykket (vakuum) kan føre til at væsken søles.
    2. Plasser prøven i hetteglasset med kontrastoppløsningen (1 % jod eller 3 % fosfotungtilstand, se materialfortegnelse). Plasser deretter hetteglasset i et vakuumkammer eller tørkeglass koblet til en vakuumpumpe. Fjern lokket fra hetteglasset, lukk deretter vakuumkammeret eller tørketrommen.
    3. Kontroller at det ikke er sprekker i vakuumkammeret/tørketrommelen og at vakuumpumpen har nok olje.
    4. Lukk pumpens utmattelsesventil for å forhindre at luft slipper ut, og åpne utløpsventilen til kammeret/tørkeren for å tvinge luften ut.
    5. Slå på pumpen og vent til trykket når ca. 20" Hg.
      FORSIKTIG: Denne prosessen er vanligvis rask, så ikke la vakuumsystemet være uten tilsyn.
      MERK: Mens den metriske systemenheten for trykk er Pascal (Pa), viser trykkmålere i de fleste laboratorievakuumpumper trykk i tommer kvikksølv ("Hg), pund per kvadrattomme (psi) eller barer. 20" Hg tilsvarer ca. 67,7 Pa, 10 psi eller 0,7 bar.
    6. Lukk kammeret/tørkeventilen for å forhindre at luft kommer inn igjen, og slå deretter pumpen raskt av.
    7. La prøven ligge under vakuum i minst 2 timer; Større prøver krever lengre tid for kontrastløsningen å trenge inn i den.
    8. Etter ønsket periode, fjern prøven fra kontrastløsningen for å forberede den til skanning.
    9. Åpne kammeret/tørketrommelen sakte for å la luft komme inn i den.
    10. Vent til trykket i kammeret/tørketrommelen er helt oppbrukt (dvs. trykkmåleren når nær 0), og åpne den deretter forsiktig for å hente prøven.
    11. Kast kontrastoppløsningen på riktig måte, og oppbevar prøven som forberedelse til skanning.
  4. For perfusjonsmetoden, følg trinnene som er nevnt nedenfor.
    1. Velg en tilførselstank for kontrastløsningen i henhold til prøvens størrelse. Bruk en 50 ml sprøyte (uten kanyle eller stempel) for små prøver (figur 2A) eller et 1 l medisinsk sett til intravenøs bruk av store prøver (figur 2B).
    2. Koble den ene enden av et gjennomsiktig plastrør (se materialfortegnelse) til tilførselstanken, og koble deretter den andre enden til en toveis- eller treveisventil. Koble en andre slange til et annet uttak i ventilen (figur 2A,B).
    3. Fest tilførselstanken i forhøyet stilling uten å demontere apparatet som ble satt opp i forrige trinn.
      MERK: Den vertikale avstanden mellom tanken og prøven vil diktere løsningens perfusjonstrykk (figur 2B). En avstand på 20-50 cm er nok for små prøver. For store prøver er en avstand på 1 m mer tilstrekkelig.
    4. Lukk treveisventilen (figur 2C) eller toveisventilen (figur 2D) for å forhindre at væske kommer ut av slangesystemet, og hell deretter kontrastløsningen i tilførselstanken. Hvis du bruker et intravenøst medisinsk sett, fyll posen med løsningen og lukk ventilen før du fester apparatet i forhøyet stilling.
    5. Forsikre deg om at det ikke dannes store luftbobler langs slangesystemet (figur 2E). La om nødvendig kontrastoppløsningen strømme ut av slangen til boblen er fjernet. Lukk ventilen igjen og la apparatet være på plass.
    6. For å klargjøre prøven for perfusjon av kontrastoppløsningen, hold den nedsenket i væske (vann, etanol eller fikseringsmiddel) og klipp av spissen av den proksimale enden av vertsstammen/roten i prøven (figur 2F).
    7. Fjern prøven fra væsken den ble lagret i, og pakk den inn i en parafinfilm for å unngå uttørking. Hold prøven i nærheten og klar til å kobles til apparatet.
    8. Åpne ventilen forsiktig for å la den kontrasterende løsningen strømme sakte og fyll plastslangen som er koblet til tanken mens du holder den åpne enden av systemet i en litt forhøyet stilling for å forhindre at kontrastløsningen søler. Igjen, sørg for at det ikke dannes store luftbobler langs røret.
    9. Koble den proksimale enden av vertsstammen/roten i prøven til den åpne enden av slangesystemet (figur 2B, forstørret område). Unngå å introdusere luftbobler i systemet under dette trinnet. Koble om nødvendig prøven fra apparatet og fjern luftbobler fra systemet ved å la oppløsningen strømme.
    10. Mens du holder prøven koblet til apparatet, plasser den inne i en beholder for å unngå lekkasje av kontrastløsningen inn i området der eksperimentet ble satt opp. Bruk rør med forskjellige diametre, glidelåser i plast og ventiladaptere (figur 2G) for å sikre at alle tilkoblinger i apparatet er godt egnet, imøtekomme vertsgrener av forskjellige størrelser, og at løsningen ikke lekker ut av slangesystemet (figur 2B, forstørret region).
    11. La oppløsningen perfisere prøven i minst 2 timer, eller til oppløsningen akkumuleres inne i beholderen.
    12. Lukk ventilen og koble prøven forsiktig fra apparatet. Tøm resten av oppløsningen i beholderen og kast den på riktig måte.
    13. Fjern parafinfilmen fra prøven som forberedelse til skanning.

Figure 2
Figur 2: Perfusjonstilnærming for kontrastpåføring. Små (A) og store (B) versjoner av perfusjonsapparatet inkluderer en forsyningstank (st) og to plastrør (t1 og t2) forbundet med en ventil (va). Den proksimale enden av vertsstammen (H) som bærer en parasitt (P) festet til den via haustorium (ha) er koblet til den åpne enden av systemet (B, utvidet). En treveis (C) eller en toveis (D) ventil brukes til å forhindre dannelse av luftbobler inne i slangesystemet, som blokkerer passasjen av kontrastløsning (E). Spissen av den proksimale enden av vertsstammen (H) er kuttet under vann for å tillate passasje av kontrastløsningen (F). Glidelåser, ventiladaptere og slanger med forskjellige diametre bidrar til å sikre tettere tilkoblinger og unngå lekkasje i systemet (G). Figur 2B, D og F ble laget med BioRender. Skalastenger = 2 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Prøveklargjøring og montering

  1. Vask prøven ved å senke den i vann i 2 minutter.
    FORSIKTIG: Ikke vask prøver i vasken, da alle kontrasterende løsninger inkluderer tungmetallsalter i sammensetningen. Vurder vannet som brukes til vask som en fortynnet kontrastløsning og kast det på riktig måte.
  2. Legg prøven i et papirhåndkle ved romtemperatur for å la overflødig vann fordampe i 2-5 minutter, avhengig av størrelsen på prøven. Alternativt kan du tørke prøven litt ved hjelp av et papirhåndkle. Ikke la prøven tørke helt ut.
  3. Pakk prøven inn i en parafinfilm ved å strekke den til et tynt lag. Unngå å brette parafinfilmen på toppen av prøven.
  4. Monter den innpakkede prøven på en prøveholder, og hold den stabil og på plass mens den roterer under skanningen. Bruk tape, skum med lav tetthet, pipettespisser og/eller klare plastbeholdere for å feste prøven på plass.
  5. Skann prøven og analyser bildene ved å følge spesifikke protokoller og retningslinjer etablert for mikro-CT-systemet som er tilgjengelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Haustorium av parasittiske planter er et komplekst organ som består av forskjellige vev og celletyper som blander seg og forbinder med vevet til en annen plante, brukt som vert20. Micro-CT-skanning kan utnyttes for å bedre forstå denne komplekse strukturen på en ikke-destruktiv og tredimensjonal måte når man analyserer både små (figur 1A-C) og store (figur 1D, E) haustoria. For å gjøre dette kan kontrasterende løsninger påføres i parasitt-vertsgrensesnittet, og dermed gjøre det mulig å analysere prøver som ellers ville ha lav og homogen røntgenabsorpsjon. De to enkle tilnærmingene beskrevet i denne protokollen er avhengige av å trykke på kontrastløsningen for å akselerere penetrasjonen gjennom prøven. Som forventet fungerer protokollene beskrevet her for forskjellige mikro-CT-systemer. Skanneinnstillinger og parametere varierer imidlertid avhengig av systemet og den analyserte prøven (tabell 1).

Funksjonell gruppe Euphytoid parasitt Endoparasitt Parasittisk vintreet Misteltein (før/etter kontrast) Obligate rot parasitt
Arter (familie) Pyrularia pubera Viscum minimum Cuscuta americana Struthanthus martianus Scybalium fungiforme
Familie Santalaceae Viscaceae Convolvulaceae Loranthaceae Balanophoraceae
Kontrast løsning 3% fosfotungstat 1% jod 1% jod 1% jod 0,2% blynitrat
Påføringsmetode vakuum vakuum Perfusjon Perfusjon Perfusjon
Micro-CT-system Zeiss Versa 620 Nikon X-Tek HMXST225 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176
Anslag 4500 3140 610 1200 / 2400 5300
Rammer 1 1 3 (gjennomsnitt) 3 / 3 (gjennomsnitt) 3 (gjennomsnitt)
Eksponering (ms) 5000 1000 680 1600 / 830 750
Filter (mm) ingen Al 0,25 AL 1.0 Al 1,0 / Al 1,0 ingen
Spenning (kV) 60 85 35 90 / 45 40
Gjeldende (μA) 108 80 375 180 / 390 600

Tabell 1: Skanneinnstillinger og parametere for de analyserte prøvene.

Etter den første tilnærmingen for kontrastapplikasjon (trinn 2.3) ble vakuum brukt til å perfusere haustoriumet til eufytoidparasitten P. pubera med en 3% fosfotungtilstandsløsning i to timer. Prøven ble deretter skannet i et 3D-røntgenmikroskopsystem (XRM) (se materialtabell), og oppnådde høy bildeoppløsning via sekundær optisk forstørrelse4. XRM-bilder ble observert å være like effektive som anatomiske seksjoner analysert under et lysmikroskop for å analysere vevsorganisasjon og topologi ved parasitt-vert-grensesnittet (figur 3). Bruken av fosfotungstate fremhever overflod av parenkymvev, som vises i en lys hvit tone på grunn av den høye absorpsjonen av kontrastmiddelet. Fartøy vises i en mørkegrå tone på grunn av lav absorpsjon av kontrast. Basert på denne fargeforskjellen er det mulig å observere overflod av parenkym som omgir haustoriums vaskulære kjerne (figur 3). De intrikate karene og tynne parenkymstrengene i selve vaskulærkjernen observeres også, spesielt i langsgående seksjoner (figur 3A-C). I tverrsnitt observeres den vaskulære kjernen lett som to vaskulære tråder adskilt av parenkym (figur 3D,E).

Figure 3
Figur 3: Eufytoid parasitt haustorium. Langsgående (A-C) og transversale (D-E) snitt gjennom haustorium ble observert med lysmikroskop (A,E) og via 3D-røntgenmikroskopi etter påføring av 3 % fosfotungtilstandsløsning ved bruk av vakuum (B-D). Røde konturer indikerer parenkymvev (par), og blå konturer indikerer vaskulær kjerne (vc). Hx: vert xylem. Hb: vert bark. Skalastenger = 500 μm (A, E) og 2,5 cm (B-D; voxelstørrelse = 2,8382 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Den samme tilnærmingen ble brukt til å introdusere kontrast i stammen til en saftig vertsplante (Euphorbia polygona, Cactaceae) parasitert av V. minimum. Her ble 1% jodoppløsning valgt som kontrastmiddel basert på foreløpig histokjemisk analyse, som viste at parenkymceller i endoparasitten lagrer karbohydrater i form av stivelse (figur 4A). Samtidig lagrer celler i vertsbarken ikke en påviselig mengde stivelse (figur 4B-D). Etter kontrastpåføring ble prøven deretter skannet ved hjelp av et Nikon X-Tek micro-CT-system (se materialfortegnelsen). Forskjellen i jodabsorpsjon tillot deteksjon av det intrikate nettet av kortikale tråder dannet av endoparasitten i vertskroppen (figur 4E). Etter denne metodikken ble kortikale tråder observert å konsentrere seg rundt vertens vaskulære senter og til slutt forgrene seg mot periferien av vertsstammen når de var assosiert med emersion av en parasittblomst (figur 4F,G).

Figure 4
Figur 4: Endoparasittvevsnettverk. Anatomiske (A) og makro (B-D) seksjoner viser reaksjon med 1% jodoppløsning som indikerer at stivelse (farget i svart) er tilstede i parenkymet (par) assosiert med parasittenes kar (ve). Fordi stivelse er fraværende i vertscortex (Hc) og xylem (Hx), ble 1% jodløsninger selektivt brukt for å øke kontrasten av parasittkortikale trådvev (lilla konturer, E-G), sett mot vertsbakgrunnen (H). Tilstedeværelsen av en blomst (Pf) bekrefter at det fargede vevet er en del av endoparasittstrukturen (A, F, G). Skalastenger = 0,25 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I den andre tilnærmingen beskrevet her (trinn 2.4) heves en tilførselstank som inneholder kontrastløsningen fra nivået der prøven er plassert, og bruker dermed tyngdekraften til å drive passasjen av løsningen gjennom prøven. Etter kontrastperfusjon ble skanning utført ved hjelp av et Bruker Skycan micro-CT-system (se materialtabell). Resultater oppnådd for C. americana (figur 5A, B) og S. martianus (figur 5C-G) bidrar til å illustrere bekvemmeligheten av denne tilnærmingen for henholdsvis små og store prøver. Sammenligning av prøver skannet før (figur 5C,E) og etter (figur 5D,F) perfusjon av 1% jodoppløsning understreker viktigheten av kontrastpåføring selv i treaktige haustoriumprøver. Det er bemerkelsesverdig at i foreningene mellom både C. americana og S. martianus (figur 5) og deres respektive verter, har parasitter lite eller ingen stivelsesinnhold i vevet. Dette forklarer de forskjellige resultatene som er beskrevet for endoparasitten V. minimum (figur 4), der samme metode og type kontrastløsning ble brukt.

Figure 5
Figur 5: Parasittisk vinstokk og misteltein haustorium. Langsgående snitt gjennom haustorium av en parasittisk vinranke (A,B) og en misteltein (C-G). Sammenligning mellom skanning og makroseksjon av ferskt materiale viser at den intrikate haustoriumstrukturen er godt fanget opp i mikro-CT-skanninger (A,B). Sammenligning mellom fikserte prøver før (C,E) og etter (D,F) perfusjonen av 1% jodoppløsning viser at kontrasten forsterkes selv i lignifiserte prøver, noe som letter observasjonen av parasitter (P) strukturer som kar i epikortikal rot (rosa pilspisser), vaskulære tråder (blå pilspisser) og søkke (gul pilspiss). Kar og årringer til verten xylem (Hx) og stivelse i vertsbarken (Hb) observeres også lettere. Skalastenger = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et endelig resultat oppnådd med perfusjonsprotokollen beskrevet her er muligheten til å oppdage vaskulære forbindelser mellom parasitter og vertsplanter. Dette ble oppnådd ved å perfusjonere en 0,2% blynitratløsning gjennom et segment av vertsroten rundt hvilken knollen til den obligatoriske rotparasitten S. fungiforme hadde utviklet seg. Etter kontrastpåføring ble skanning også utført ved hjelp av et Bruker Skyscan micro-CT-system (se materialfortegnelse). Sekvensielle fremspring viser at kar i vertsroten deler seg inn i parasittknollen (figur 6A-C). Etter analysen av disse resultatene ble den samme prøven kuttet i en mindre underprøve, forberedt for anatomisk studie, og analysert ved hjelp av lysmikroskopi. Seriell seksjonering av denne delprøven bekrefter at xylemkontinuiteten mellom de to anleggene dannes ved fartøy-til-fartøy-forbindelse via perforeringsplater (figur 6D-F).

Figure 6
Figur 6: Obligat rotparasitt haustorium. Lengdesnitt gjennom haustorium observert ved mikro-CT-skanning (A-C) og anatomiske snitt observert under lysmikroskopet (D-F). Akkumuleringen av 0,2% blynitratoppløsning i vertsrotens vaskulære system (Hr, rosa omriss) tillater observasjon av vertskar som forgrener seg i parasittrøret (Pt) og påvisning av direkte vaskulær forbindelse mellom de to plantene (stiplet hvit kontur). Skalastenger = 1 cm (A-C) og 500 μm (D-F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruken av tungmetallløsninger for å forbedre kontrasten av plantevev har blitt et avgjørende skritt i prøvepreparering for mikro-CT-analyse. Flere forbindelser som vanligvis er tilgjengelige i plantemikromorfologilaboratorier, har blitt testet av Staedler et al., som anbefaler å bruke fosfotungtilstand som det mest effektive middelet i penetrerende prøver og økende kontrastindeks8. Resultater oppnådd her i analysen av haustorium av P. pubera bekrefter denne anbefalingen. Når det gjelder kontrastapplikasjon, beskriver Steadler et al. at kontrastløsningen ble passivt infiltrert gjennom det analyserte materialet (blomster og blomsterknopper fra 1 mm til 10 mm) i løpet av 1 til 8 dager8. Andre forfattere har brukt samme protokoll for passiv infiltrasjon over lengre perioder (1-4 uker) når de analyserer større prøver, for eksempel de 30 cm brede blomstene av endoparasittiske Rafflesiaceae-arter28. Selv om denne prosessen har vist seg vellykket, viser resultater oppnådd med protokollen beskrevet her at infiltrasjonsprosessen kan akselereres betydelig under vakuum, og dermed forbedre den tidligere etablerte metoden. Et vakuumkammer eller en pumpe tvinger luft til å rømme fra plantevevet, og tillater dermed lettere infiltrasjon av kontrastløsningen. Vakuum kan påføres selv på skjøre strukturer, som vist her for haustorium av P. pubera og det myke vevet i den saftige vertsplanten E. polygona parasitert av V. minimum. Videre er bruk av vakuumpumper en vanlig prosedyre for infiltrasjon av fikseringsmidler eller innebygging av stoffer i mange laboratorier av plantemikromorfologi, noe som gjør denne protokollen mer tilgjengelig.

Den samme tilnærmingen ble brukt her med et kontrastmiddel som selektivt flekker prøver hvis spesifikke lagringsforbindelser er tilstede. Når det påføres gjennom vakuum eller passiv infiltrasjon, kan selektiv farging gi dårligere kontrastforsterkning til en hel prøve sammenlignet med fosfotungtilstand, for eksempel. På den annen side er det gunstig for å fremheve spesifikke plantestrukturer eller vev. Som rapportert her, når kombinert med tidligere anatomisk eller histokjemisk analyse, kan bruk av selektive kontrastmidler som jod hjelpe til med differensiering av parasittisk plantevev i vertsens kropp, forutsatt at enten parasitt eller vert (men ikke begge) viser rikelig stivelsesreserver. Selektivt økende røntgenabsorpsjon av parasittvev er vist å være spesielt nyttig for å utforske, for første gang, det komplekse tredimensjonale nettverket dannet av en endoparasittisk plante som V. minimum innenfor stammen til vertsplanten. Videre er det bemerkelsesverdig at endoparasittiske planter og visse sopp viser en interessant evolusjonær konvergens, begge vokser "inkognito" inne i vertene sine for mye av deres livssykluser, og dukker bare opp i korte perioder29. Dermed vil en potensiell ny anvendelse av protokollen beskrevet her være å bruke phloxine B, en flekk som inneholder brom30, for å oppdage endofytiske sopp i plantevev. Eosin, en annen brombasert fargeløsning som bare sjelden brukes til plantevev, har vist seg å øke kontrasten i musenyreprøver analysert ved hjelp av et spesifikt mikro-CT-system31.

En annen tilnærming beskrevet i denne protokollen er perfusjonen av kontrastmidler gjennom det vaskulære vevet i vertsstammen eller roten. Denne tilnærmingen, som skiller seg vesentlig fra tidligere rapporterte metoder, er basert på arbeidet til Sperry et al., som perfuserte treprøver med safraninfargestoff for å analysere hydraulisk ledningsevne32. Som diskutert av forfatterne og fremhevet her, er et kritisk trinn i protokollen å sette opp flekkperfuseringsapparatet for å unngå å introdusere luftbobler i systemet32. Treveisventiler kan midlertidig divergere løsningsfluksen og eliminere bobler fra væskencomlumn 32. Likevel kan emboli være tilstede inne i karene til vertsplanten, forårsaket enten kunstig under prøvetaking eller naturlig på grunn av de generelt høye transpirasjonshastighetene til parasittiske planter33,34. Dette kan redusere perfusjonseffektiviteten kraftig, noe som fører til at kontrasten ikke forbedres i prøven. Det er viktig å bruke lavt til moderat vakuum når prøven festes etter prøvetaking for å forhindre dette problemet. Komplementært kan den fikserte prøven skylles under høyt trykk ved bruk av fikseringsløsningen der prøven er lagret. Spyling kan bidra til å gjenopprette konduktiviteten i prøven ved å fjerne luftbobler32, og dermed fjerne banen for perfusjon av kontrastoppløsningen. Hvis du arbeider med ferskt materiale, kan innføring av luftbobler i planten unngås ved å senke prøven i vann umiddelbart etter prøvetaking, deretter kutte den igjen under vann og glatte endeflaten med skarpe kniver35.

Etter denne tilnærmingen ble 1% jodoppløsning perfusert gjennom haustorium av C. americana og S. martianus for å forbedre kontrasten til vertsparasittgrensesnittet som helhet. Resultater oppnådd for disse artene viser at perfusjonsprotokollen beskrevet her fungerer bra for både ferske og fikserte prøver, og at innføring av kontrastløsninger forbedrer visualiseringen selv i lignifiserte prøver. Disse observasjonene stemmer overens med resultater rapportert av Teixeira-Costa &; Ceccantinti17, som brukte samme tilnærming til å bruke en 0.2% blynitratløsning for å visualisere spesifikke aspekter av haustoriumstruktur. I kontakt med karbondioksid reagerer blynitrat for å danne et svært uoppløselig bunnfall sammensatt av blykarbonatkrystaller, som effektivt absorberer røntgenstråler 8,36. Når det er perfusert i prøvens vaskulære vev, tetter dette bunnfallet opp vaskulære gropforbindelser, slik at løsningen bare kan strømme gjennom direkte, fartøy-til-fartøy-forbindelser via perforeringsplater. Etter denne tilnærmingen er tilstedeværelsen av direkte parasitt-vert xylemforbindelser gjennom perforeringsplater vist her for S. fungiforme og bekreftet med detaljert anatomisk analyse. Disse resultatene fremhever en videre anvendelse av denne tilnærmingen for å teste haustorium-funksjonalitet. Gitt at haustoriuminitiering kanskje ikke kulminerer i utviklingen av et fullt funksjonelt organ på grunn av enten parasitt-vert-inkompatibilitet eller vertsresistens mot parasitten, kan tilnærmingen beskrevet her brukes til å teste om vaskulære forbindelser dannes mellom de to plantene som fører til forekomsten av effektiv parasittisme. Tatt i betraktning verdien av å bruke mikro-CT-skanning for å undersøke xylemembolier bredere12,37, kan protokollen som presenteres her også forbedre visualiseringen og kvantitativ analyse av xylememboli i andre ikke-parasittiske plantearter.

Avslutningsvis nærmer denne protokollen seg en av de kritiske fremskrittene som forventes innen plantemikrotomografi, som bruker kontrastmidler for å skille strukturer med lav røntgenabsorpsjon24. Som vist her, kan kontrastløsninger forbedre visualiseringen av haustoriumstrukturer betydelig ved grensesnittet mellom parasittiske planter og deres verter. Ulike forbindelser kan velges i henhold til deres spesifisitet ved å reagere med reserveforbindelser, slik som stivelse, som ofte er forskjellig fordelt mellom parasitt- og vertsvev. Tilnærmingen til kontrastapplikasjon i haustoriumprøver kan også velges for å undersøke spesifikke egenskaper ved parasitt-vertsgrensesnittet, for eksempel direkte fartøy-til-fartøy-forbindelse. Videre kan denne protokollen også brukes på ikke-parasittiske arter, noe som potensielt kan forbedre påvisning av endofytiske sopp og kvantifisering av xylememboli. I enhver applikasjon kan protokollen beskrevet her for å forbedre mikrotomografianalyse kombineres med andre verktøy, for eksempel optisk projeksjonstomografi og automatisert virtuell segmentering, for å gi ny og spennende innsikt i den tredimensjonale utviklingen av forbindelsen mellom disse plantene og deres verter38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Jeg vil gjerne takke Dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, University of Sao Paulo, Brasil) og Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) for deres avgjørende hjelp og uunnværlig brukeropplæring for ulike mikrotomografisystemer og dataanalyseprogramvare. Jeg takker også de ansatte ved EEB Greenhouse ved University of Connecticut (USA), spesielt Clinton Morse og Matthew Opel for å gi eksemplarer av Viscum minimum. Dr. John Wenzel ga muligheten og stor hjelp til prøvetaking av Pyrularia pubera. MSc. Carolina Bastos, MSc. Yasmin Hirao og Talitha Motta hjalp sterkt med prøvetaking av Scybalium fungiforme. MSc. Ariadne Furtado, og Dr. Fernanda Oliveira og Maria Aline Neves ga referansen for bruk av phloxine B for analyse av endofytiske sopp. Videoopptak ved Vrije Universiteit Brussel ble gjort mulig ved hjelp av Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka og Dr. Harry Olde Venterink. Finansiering ble gitt av Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brasil) og Harvard University Herbaria (USA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D X-ray microscope (XRM) system Zeiss Versa 620 used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22 Zeiss Versa 620 Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software Nikon version XT 3.1.11 Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software Bruker version 3.3.1 Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software Object Research Systems - ORS version Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials Glass Vials Inc. SE V2708C-FM-SP Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X Zeiss version XT 3.1.11 Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N WR Chemicals BDH BDH7422-1 Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g Vetec 361.08 Sold by SPLab
Microtomography scanner Bruker Skyscan1176 Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner Nikon X-Tek HMXST225 Used for scanning the species V. minimum
NRecon software Bruker version 1.0.0 Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution Electron Microscopy Sciences 101410-756 Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm) Heathrow Scientific PM996 Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL Taylor 3478 Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4'' Nalge Nunc International SC63013-164 Sold by VWR - USA
Scanning system Nikon X-Tek HMXST225 used to scan Viscum minimum
Scanning system Bruker Skyscan 1176 used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software Zeiss version 16 Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve ToToT DMTWVS-5 Sold by Amazon USA
Two-part syringe HSW Henke-Ject 4850001000 Used without the plunger
Vacuum chamber Binder 80080-434 Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software Volume Graphics version 3.0 Used for analyses and acquisition of images and videos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. The Biology of Parasitic Flowering Plants. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 179 Microtomography haustorium holoparasite endoparasitt Cuscuta misteltein cytokjemi
Utnytte mikro-CT-skanning for å analysere parasittiske plante-vert-interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teixeira-Costa, L. Leveraging… More

Teixeira-Costa, L. Leveraging Micro-CT Scanning to Analyze Parasitic Plant-Host Interactions. J. Vis. Exp. (179), e63423, doi:10.3791/63423 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter