Summary
从小鼠视网膜获得的Müller神经胶质细胞原代培养物是研究microRNA处理后神经胶质转化为视网膜祖细胞的非常强大和可靠的工具。在随后应用 体内 方法之前，可以测试单个分子或组合。
Abstract
穆勒神经胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要神经胶质细胞，可以作为视网膜神经元的再生源。在鱼类等低等脊椎动物中，MG驱动的再生自然发生;然而，在哺乳动物中，需要用某些因素或遗传/表观遗传操作进行刺激。由于MG仅占视网膜细胞群的5%，因此需要允许专门研究该细胞群的模型系统。这些模型系统之一是可重复的原代MG培养物，可用于各种应用，包括分子/因子筛选和鉴定，化合物或因子的测试，细胞监测和/或功能测试。该模型用于研究小鼠MG 在通过 转染人工miRNA或其抑制剂补充或抑制microRNA（miRNA）后转化为视网膜神经元的潜力。将MG特异性报告小鼠与免疫荧光标记和单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合使用，证实在这些培养物中发现的80%-90%的细胞是MG.使用该模型，发现miRNA可以将MG重新编程为视网膜祖细胞（RPC），随后分化为神经元样细胞。该技术的优点是，在 体内 应用之前，可以测试miRNA候选物的效率和结果。
Introduction
米勒神经胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要神经胶质细胞。与中枢神经系统其他部位的其他神经胶质细胞相比，它们具有相似的功能，例如维持水和离子稳态，滋养神经元和保护组织。MG还有另一个迷人的特征：虽然它们是成熟的神经胶质细胞，但它们仍然在发育后期表达视网膜祖细胞（RPC）中的许多基因1，2。这种相似性被认为是视网膜损伤3，4后鱼视网膜中自然发生的基于MG的神经元再生的原因。在此过程中，MG重新进入细胞周期并解分化成RPC，然后分化成所有六种类型的视网膜神经元。虽然这种现象自然发生在鱼类中，但哺乳动物MG不会转化为神经元5，6。但是，它们可以重新编程。已经证明多种因素可以将MG重新编程为RPC /神经元;这些因素包括参与鱼类再生的基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子阿科特-斯库特同源物1（Ascl1）7，8。在小鼠中， Ascl1 仅在视网膜发生期间在RPC中表达，但在成熟的MG或视网膜神经元中不存在9。
直接 在体内 重编程细胞不仅在方法学上具有挑战性，而且还需要获得机构动物护理和使用委员会的批准。要获得批准，需要有关使用或改变的因子，浓度，脱靶效应，潜在机制，毒性和效率的初步数据。细胞培养系统允许在 体内 模型中使用之前测试这些标准。此外，由于MG仅占整个视网膜细胞群10的约5%，MG培养物允许研究其功能11 以及它们的行为，包括迁移12，13，增殖14，对损伤/损伤的应激反应15，16，它们与其他细胞类型的相互作用，如小胶质细胞17 或视网膜神经节细胞（RGC）18， 或他们的神经源性潜力19，20，21。许多研究人员使用永生细胞系进行研究，因为它们具有无限的增殖潜力，并且可以轻松维持和转染。然而，原代细胞比永生化细胞更适合生物学相关测定，因为它们具有真正的细胞特征（基因和蛋白质表达），更重要的是，它们代表发育的某个阶段，因此具有“年龄”。动物的年龄（以及因此从动物获得的细胞的年龄）是细胞重编程中特别关键的因素，因为细胞可塑性随着发育阶段的推进而降低22。
该协议详细描述了如何用miRNA重新编程原代MG作为研究再生的当前 体外 方法。该MG原代培养模型建立于2012年，用于评估MG在P53敲除小鼠（trp53-/-小鼠）23中的细胞增殖特征。结果表明，培养的MG保持其神经胶质特征（即 通过 免疫荧光标记评估的S100β，Pax6和Sox2蛋白的表达），并且它们类似于 体内 MG（FACS纯化的MG的微阵列）23。此后不久，使用病毒载体20以不同的方法验证和确认了神经胶质mRNA和蛋白质表达。几年后，通过使用MG特异性 Rlbp1CreERT：tdTomatoSTOPFL / fl 报告小鼠24，证实在这些培养物中发现的绝大多数细胞是MG。此外，对FACS纯化的MG和培养的原代MG中一组miRNA的定量表明，在生长阶段，培养的MG中mRNA的水平变化不大。然而，较长的培养周期会导致miRNA水平的变化，从而导致mRNA水平和蛋白质表达的变化，因为miRNA是翻译调节因子25。
2013年，该MG培养模型用于测试各种转录因子，这些转录因子具有将MG重新编程为视网膜神经元20的能力。Ascl1被发现是一种非常强大和可靠的重编程因子。通过病毒载体过表达Ascl1诱导形态学变化，神经元标志物的表达以及神经元电生理特性的获得。更重要的是，从这些首次体外实验中获得的见解和结果已成功转移到体内应用22，26中，证明初级MG培养物代表了在体内实施之前进行初始因子筛选和神经胶质特征评估的坚实可靠的工具。
几年前，已经证明，在视网膜神经元中高度表达的富含脑的miRNA miR-124可以在培养的MG21中诱导Ascl1表达。通过Ascl1报告小鼠可视化活细胞中的Ascl1表达（Ascl1CreERT：td多马托斯托普夫特/fl）。报告小鼠是一种基因工程小鼠，其DNA中插入了报告基因。这个报告基因编码一种报告蛋白，在这项研究中，这是一种红色荧光蛋白tdTomato。该报告蛋白报告目的基因的表达，在这种情况下，Ascl1。换句话说，表达Ascl1的细胞将变成红色。由于Ascl1仅在RPC9中表达，因此该Ascl1CreERT：td多马托斯托普弗/fl小鼠允许跟踪MG转化为表达RPC的Ascl1，这意味着转换细胞将表达红色荧光tdtomato报告蛋白。这是不可逆的标记，因为这些细胞的DNA被改变。因此，任何随后的神经元分化都将被可视化，因为tdTomato标签保留在分化细胞中。如果表达MG衍生的RPC（带有tdTomato标签）的Ascl1分化成神经元，这些神经元仍将具有红色标签。因此，该小鼠不仅可以标记MG衍生的RPC以进行活细胞成像，还可以允许这些MG衍生的（红色）RPC的命运映射和谱系追踪。最近，鉴定了RPC中的一组miRNA，并使用Ascl1CreERT：tdTomatoSTOPFL / fl RPC报告基因小鼠的MG培养物来筛选和测试这些miRNA对重编程能力和效率的影响27。一种候选者RPC-miRNA miR-25被发现能够将培养的MG重新编程为Ascl1表达（Ascl1-番茄+）细胞。这些重编程的细胞随着时间的推移采用神经元特征，包括神经元形态（小体细胞和短或长精细过程），通过scRNA-Seq测量的神经元转录本的表达，以及通过免疫荧光标记27验证的神经元蛋白的表达。
在这里，该协议详细介绍了如何从适应先前工作21，24，27的P12小鼠中生长和转染MG。为该方案选择的是上述miRNA miR-25，这是一种在RPC中高度表达的miRNA，在MG或视网膜神经元中表达水平低。为了过表达miR-25，使用小鼠miR-25模拟物，即人工miRNA分子。作为对照，选择来自秀丽隐杆线虫的miRNA的模拟物，它们在哺乳动物细胞中没有功能。MG转换为RPC的可视化是通过RPC报告小鼠（Ascl1CreERT：tdTomatoSTOPFL / fl），具有混合背景的小鼠（C57BL / 6，S129和ICR菌株）完成的。然而，这种培养可以用所有小鼠品系进行，包括野生型品系。在过去几年中，对原始方案进行了修改，以减少生长阶段的持续时间和整个培养期，并确保更健壮的神经胶质细胞状态，并最大限度地减少细胞变性的程度，这在长时间的培养期间发生。常规转染时间窗口也从3小时延长至2天。如前所述，尽管目前的方案将MG培养物描述为再生研究的工具，但该方法不仅可用于测试重编程因子，还可以适用于其他应用，包括关于MG迁移或增殖行为的研究，损伤/细胞损伤相关范例，和/或潜在机制和途径的鉴定。
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Protocol
涉及动物受试者的程序已获得纽约州立大学眼科学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：该培养方案包括三个阶段：生长、转染和转化阶段。 图1给出了带有时间表的整体协议摘要。
1. 培养基和所有所需试剂的制备
注：所有步骤都需要在A2或B2生物安全柜（BSC）中执行。在生长阶段，使用高血清生长培养基，其由补充有表皮生长因子（EGF）的基础神经元培养基组成。对于转换阶段，使用补充神经元补充剂的低血清神经生理学基础培养基来确保神经元分化和存活。
- 通过将200 mL基础神经元培养基补充20mL胎牛血清（FBS，10%），1mL 200mM L-谷氨酰胺（0.5%），2mL青霉素/链霉素（1%）和2mL N2补充剂（1%）来制备生长培养基（在生长阶段使用）。进行无菌过滤（孔径为0.22μm的过滤装置）。使用前在37°C金属珠浴中预热介质。
- 按照制造商的说明（见 材料表）准备神经元培养基（在转化阶段使用），在磷酸盐缓冲盐水中补充2 mL B27神经元补充剂（2%），20μL 100 ng / mL脑源性神经营养因子（BDNF，在0.1%牛血清白蛋白（BSA）中重组， 终浓度20 ng / mL），20μL 100 ng / mL神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF，在无菌汉克斯平衡盐溶液[HBSS]中重建，终浓度20ng / mL），500μL 100mg / mL二丁酰基-cAMP（在DMSO中重组），70μL 50 ng / mL抗坏血酸（在无菌PBS中重建）和1.5 mL青霉素/链霉素。进行无菌过滤（孔径为0.22μm的过滤装置）。使用前在37°C金属珠浴中预热介质。
注意：这些培养基可以在4°C下储存1个月。 - 按照制造商的方案重建视网膜解离所需的木瓜蛋白酶、DNase I 和卵泡样试剂。在无菌1.5 mL管中等分750μL木瓜蛋白酶，在无菌0.6 mL管中等分75μLDNase I，在2 mL管中等分750μL卵泡蛋白酶抑制剂。将木瓜蛋白酶和DNase I等分试样冷冻在-20°C，并将卵胞浆样等分试样保持在4°C，以避免试剂降解。使用前在室温下解冻。
注意：木瓜蛋白酶，DNase I和卵胞浆菌在称为木瓜蛋白酶解离系统的试剂盒中发现（参见 材料表）。 - 如果按照数据表说明进行免疫荧光标记（Poly-O：在无菌水中0.1mg / mL;层粘连蛋白： 在 DMEM 中以 1：50 稀释 1.2 毫克/毫升）。等分试样聚O和层粘连蛋白（2.5 mL）并在-20°C下冷冻等分试样。 使用前在室温下解冻。
注：步骤 1.4。仅当进行免疫荧光标记和激光扫描显微镜检查时才需要。
2. 小鼠和组织提取
注意：对于这些重新编程研究，阿斯克莱1CreERT：td多马托单胞胎鼠标是通过将阿斯克莱1克瑞特小鼠（阿斯克拉1-克里特：贾克斯#012882）与一只叔丁点穴位/fl小鼠（B6.Cg-gt（ROSA）26Sortm14（CAG-td多马托）Hze/J：贾克斯#007914）杂交而产生的。此鼠标具有混合背景（C57BL/6、S129 和 ICR 应变）。该小鼠的基因型如图1A所示。所有菌株都可用于该方案。
- 戴上手套并对工作空间进行消毒，包括解剖显微镜和所有精细工具（杜蒙#5精细和杜蒙特#7弯曲镊子，精细剪刀和Vannas剪刀）与70%乙醇。将10厘米的硅胶涂层黑色解剖盘暴露在紫外线下20分钟，对其进行消毒。
- 准备用于组织提取的培养皿和盘子
- 准备一个24孔板用于眼睛收集和样品分离（每只小鼠在一个孔中两只眼睛，用小鼠ID标记），每孔约1mL冷HBSS（4°C）。将24孔板放在冰上。
- 将无菌的10厘米培养皿（用于洗涤）和消毒的硅胶涂层解剖皿中填充几毫升冷HBSS（4°C），以确保组织被HBSS完全覆盖。
- 用1 mL 70%乙醇制备无菌的1.5 mL管。
- 通过在培养板上标记培养物编号，日期，菌株和所有必需的信息来准备12孔培养板。
- 使用任何批准的方法对P12小鼠实施安乐死。
- 眼部切除
- 用拇指和食指轻轻握住鼠标头的眼睛。
- 使用Dumont #7弯曲的镊子，轻轻地走到眼球后面并夹住视神经。小心地把眼睛拿出来。
注意：如果使用成年小鼠，请勿使用弯曲的镊子，也不要拉动眼睛。而是用细剪刀小心地切开眼球;切开视神经，但不切开眼睛本身。使用镊子小心地取下眼球。
- 眼球清洁
- 将眼球短暂浸入含乙醇的管中，以避免细菌从动物中携带。
- 在10厘米培养皿中短暂清洗眼球，然后将其放入24孔板上的冰上。
- 对另一只眼睛重复步骤2.4和2.5。在此过程中将孔板保持在冰上。将一只动物的两只眼睛放在带有光源的解剖显微镜下的解剖皿中。
- 视网膜提取
- 用Dumont #5细镊子抓住视神经和巩膜周围的结缔组织，并将其小心地压在解剖皿（角膜向上）上，从而固定一个眼球。
- 使用30 G针在角膜中心打一个洞，以便于获得Vannas剪刀。
- 使用Vannas剪刀解剖睫状体周围的角膜，并用Dumont #5精细镊子仔细去除角膜，晶状体，虹膜和玻璃体。 图2A 显示了一个内含视网膜的眼罩。
- 用瓦纳斯剪刀解剖巩膜，直到到达视神经。夹住视神经，并使用Dumont #5精细镊子小心地提取视网膜。
- 使用第二对Dumont #5细镊子推动视网膜，并允许完全切除玻璃体。 图2B 示出了两个提取的视网膜。
- 转移和清洗
- 切开约2.5厘米的无菌转移移液管尖端以扩大直径。使用此尖端，在不损伤组织的情况下拾取（吸入）整个视网膜。
- 将视网膜转移到具有冷HBSS（4°C）的新无菌培养皿中，并摇晃培养皿（来回，左侧和右侧）。
- 使用转移移液器吸头，小心地推动视网膜以洗去视网膜色素上皮（RPE）细胞。
注意：或者，可以将整个视网膜与晶状体和玻璃体从眼罩中取出。然后，可以从提取的视网膜中取出晶状体和玻璃体。如果视网膜被撕裂，请确保收集所有碎片以进行解离;否则，将没有足够的组织量来生长融合的细胞层。
- 立即将分离的视网膜放入装有1 mL HBSS的24孔板的新，干净的孔中。在解剖过程中将24孔板保持在冰上。
- 重复步骤2.7-2.9以隔离第二个视网膜。
3. 视网膜解离
注意：所有后续步骤（直到细胞收获）都需要在A2或B2生物安全柜（BSC）中进行。
- 按如下方式制备木瓜蛋白酶/DNase I解离混合物。
- 对于六个视网膜，将75μLDNase I加入含有750μL木瓜蛋白酶（从步骤1.3开始）的管中并仔细混合（解离混合物）。
- 对于该方案所需的单个样品制备，将825μL的总体积分成三个等分试样：275μL混合物，每只小鼠（两个视网膜）在一个1.5 mL管中。相应地计算DNase I和木瓜蛋白酶所需的量。
注意：在一管木瓜蛋白酶/DNase I混合物中最多可以解离六个视网膜。然而，与组合样品相比，单个样品制备可减少团块并改善细胞生长。
- 将两个视网膜转移到木瓜蛋白酶/DNase I解离混合物中。使用吸头直径增大的转移移液管（步骤2.8.1），拿起视网膜，等到视网膜沉降在吸头底部，然后将视网膜释放出来，而不会过多的HBSS进入含有木瓜蛋白酶/DNase I混合物的管中。
- 放在坚果上，在细胞培养箱（37°C，5%CO2）中孵育10分钟。
- 通过用1mL移液管小心地上下移液（约20-30次）来解离细胞。细胞解离后（即，产生没有块的均匀溶液），从木瓜蛋白酶解离试剂盒中加入275μL卵胞浆蛋白酶抑制剂以中和木瓜蛋白酶。通过上下移液轻轻混合。
注意：如果在825μL木瓜蛋白酶/DNase I混合物中分离出六个视网膜，则需要825μL卵泡。 - 在4°C下以300× g 离心混合物10分钟。
- 将表皮生长因子（EGF，每1mL生长培养基1μL，在PBS中以200μg/ mL重建）添加到在37°C预热的生长培养基（每只小鼠1mL）的计算体积中。
注意：根据实验设计，可以在培养期开始时添加增殖标记5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）以及4-羟基他莫昔芬（4-OHT）或其他所需因子。 - 小心地从离心机中取出管子。不要触摸管底部的颗粒。
- 仔细和完全地除去上清液。用500μL补充EGF的生长培养基重悬细胞沉淀。
- 将细胞悬浮液转移到标记的12孔板的一个孔中（图2C）。用另一个500μL补充EGF的生长培养基冲洗管并将其加入孔中（每孔总体积为1mL）。
- 对所有其他示例重复步骤 3.8 和 3.9。
- 小心地将孔板摇三次（来回，左，右）。将板放入培养箱（37°C，CO2）。
注意：如果使用转基因小鼠，请对每只动物进行基因分型（图2D）。鉴定 Cre 重组酶阳性和阴性小鼠并相应地标记板。对于该协议，只有Cre 重组酶阳性报告小鼠的细胞用于后续步骤。Cre 阴性标本的细胞被冷冻并用于其他应用。
4. 成长阶段
注意：生长阶段的持续时间约为4-5天（图1B）。为了将液体添加到含有细胞的孔中，移液器需要指向孔壁，并且需要缓慢释放液体以避免细胞脱离。不要直接移液在细胞顶部。
- 解离后一天，取出培养基并加入1 mL新鲜EGF补充生长培养基。
- 在第3天，取出培养基并加入1 mL HBSS（室温）以除去细胞碎片。从左到右轻轻来回摇摆。取出HBSS，重复洗涤步骤，并加入1 mL预热的EGF补充生长培养基。
- 每天监测细胞并评估其生长状态，直到细胞达到90%-100%汇合。 图 3 显示了一段时间内良好 MG 增长的示例。检查可能的污染或细胞死亡（补充图1）。丢弃受污染的培养物。
注意：要监视和记录细胞状态，请使用带有相机和4x，10x或20x物镜的光学显微镜以各种放大倍率拍摄图像。在这项研究中，使用了荧光显微镜。
5. 用聚-L-鸟氨酸（Poly-O）和层粘连蛋白涂层制备盖玻片
注意：仅当执行免疫荧光标记和共聚焦激光扫描显微镜时，才需要此步骤。圆形玻璃盖玻片（直径12毫米）是正确成像所必需的。涂层方案也可以在神经元介质数据表中找到（参见 材料表）。
- 使用无菌Dumont#2AP镊子将无菌盖玻片小心地放在24孔板的每个孔的中心。
注意：将盖玻片放在孔的中心。将盖玻片放置在靠近井壁的地方会导致后续步骤的表面张力问题。 - 在室温下解冻2.5 mL Poly-O等分试样，并将其100μL放在每个盖玻片的中心。
- 将孔板在37°C培养箱中孵育30分钟。
- 取出Poly-O并用盖玻片用~1 mL无菌水洗涤孔三次。
- 让孔板在平衡计分卡中干燥过夜。在4°C下解冻2.5 mL层粘连蛋白过夜。
- 第二天早上，在每个盖玻片的中心加入100μL层粘连蛋白，并在37°C培养箱中孵育4小时。
- 仔细和完全去除层粘连蛋白。
- 如果不能立即进行传代，则将板保持在4°C。
注意：准备好的板中的涂层盖玻片可以在4°C下保存几天。
6. 细胞通道以清除神经元幸存者
注意：细胞传代需要去除神经元细胞，而不是增加细胞群。神经胶质细胞只分裂几次，通过后不会进一步生长。不要稀释细胞悬浮液。12孔板的一个汇合孔的细胞可以分布到12孔板的一个孔或24孔板的两个孔上。当使用涂层盖玻片时，只有大约三分之一的盖玻片被涂覆。因此，位于24孔板中的六个盖玻片，具有汇合细胞（〜80%-90%）可以从12孔板的融合细胞的一孔中获得。也可以选择其他比率来增加或减少细胞密度。对于该协议，使用一只 Cre +报告小鼠[一个实验，两个处理：miR-25或对照-miR;技术重复n = 3（每次处理三个盖玻片），生物重复n = 1]。技术和生物重复的数量可以根据实验设计以不同的方式定义。
- 检查细胞是否汇合90%-100%（也在井的边缘; 图 3E，F）。
- 取出培养基，加入1毫升HBSS（室温）洗涤。轻轻摇动盘子（来回，左右）。完全删除哈佛商学院。
- 加入500μL预热的含胰蛋白酶的溶液（在金属珠浴中预热在37°C下）以将细胞从孔中分离。轻轻摇晃（来回，从左到右）并在37°C培养箱中孵育2分钟。
- 将培养皿从培养箱移至平衡计分卡。倾斜时，吸出含有胰蛋白酶的溶液，并将其小心缓慢地分散在孔上几次，直到细胞完全分离。将板对着灯，确保底部没有细胞。
- 将此细胞悬浮液转移到无菌的1.5 mL管中。在4°C下以300× g 离心8分钟。
- 取出上清液，并通过加入600μL（每孔100μL，6孔/盖玻片）预热生长培养基（补充EGF; 1：1000）小心地重悬细胞沉淀。并上下移液约30-40次。
注意：此时可以在-80°C或液氮中冷冻细胞，并按照解冻细胞系的标准方案解冻。如果细胞被冷冻，它们将不会重悬于EGF补充培养基（生长培养基）中。它们将被重悬于碱性培养基（无EGF）和冷冻溶液（1/1比例）中。步骤6.1.1至6.6.2描述了冷冻细胞的步骤。如果没有细胞被冷冻，请继续执行步骤6.7。- 通过混合100μLDMSO和400μLFBS（每孔/样品总体积为500μL）来制备冷冻溶液。
- 将细胞沉淀重悬于500μL预热的生长培养基中。将细胞悬浮液加入500μLDMSO / FBS冷冻溶液（总体积为1mL）中。将试管保持在冰上，直到所有样品都处理完毕。将细胞在-20°C下冷冻1小时，然后在-80°C下储存。
- 通过将100μL的600μL细胞/培养基悬浮液（步骤6.6）置于24孔板的六个涂覆盖玻片（参见步骤5）的中心来接种细胞。将板小心地放入培养箱中，让细胞沉降。
注意：100 μL的600 μL细胞悬浮液（从12孔板的一个孔中收获）将产生90%-100%的细胞汇合度，这是转染所必需的。 - 3小时后检查细胞，看看它们是否已经落在盖玻片上。加入400μL补充EGF的生长培养基。
注意：细胞通常已准备好在第二天进行转染（图3G）。如果没有汇合（90%-100%），请将它们留到另一天。如果仍不能融合，请勿将其用于转染。如果进行其他下游应用，例如miRNA分析，RNA-Seq，RT-qPCR或蛋白质印迹，则需要将细胞传代到12孔板中（1：1比例，无需板处理）并收获以进行RNA /蛋白质提取。
7. 转染
注意：转染阶段仅包括转染介质中的3小时阶段（转染程序在转染试剂随附的转染手册中描述）和延长阶段，其中转染试剂和miRNA仍然存在，但添加了具有所需补充的神经元培养基（总持续时间为2天; 图 1B）。在该协议中，将转染六个孔：三个孔将接收重编程miRNA miR-25，三个孔将接收对照miRNA。
- 检查细胞是否达到90%汇合度，并在转染前记录/成像细胞。
- 取出生长培养基并加入500μL HBSS（室温）以洗涤细胞。
- 取出HBSS并加入400μL用于转染的还原血清培养基。将板放回37°C培养箱中。
- 按照制造商转染试剂方案的说明准备转染混合物。制成两种混合物：转染试剂混合物和miRNA混合物（参见 图1B 的插图）。
- 准备转染试剂混合物：对于24孔板，一孔（总共50μL）需要49μL还原血清培养基和1μL转染试剂。对于六个孔，将294μL还原血清培养基和6μL转染试剂混合并通过轻轻上下移液充分混合。
- 制备miRNA模拟混合物：对于24孔板，一个孔需要50μL模拟混合物的总体积。三个孔将接收对照miRNA，其他三个孔将用miR-25处理。对于该协议，使用200 nM的最终浓度。
- 对于miR-25处理（三个孔），通过轻轻地上下移液，将150μL还原血清培养基和3μLmiR-25模拟物（100μM储备溶液）混合并充分混合。孵育5分钟。
对于对照模拟处理（三个孔），将150μL还原的血清培养基和3μL对照-miRNA模拟物（100μM储备溶液）混合并通过轻轻上下移液充分混合。孵育5分钟。
注意：miRNA模拟物的体积取决于稀释因子和所需的浓度（20-500 nM）。也可以使用miRNA抑制剂（抗标记物）或其他分子，包括质粒。此外，分子组合也可以转染。
- 对于miR-25处理（三个孔），通过轻轻地上下移液，将150μL还原血清培养基和3μLmiR-25模拟物（100μM储备溶液）混合并充分混合。孵育5分钟。
- 将miRNA模拟混合物和转染试剂混合物混合。通过轻轻地上下移液缓慢而彻底地移液，小心地混合。在室温下孵育20分钟（根据制造商的说明）。
- 使用20μL移液管将上述转染混合物滴加到细胞顶部，靠近孔中的培养基表面。轻轻摇晃盘子（来回，从左到右）。
- 在37°C培养箱中孵育3小时。
- 3小时后，将神经元培养基加入补充有4-羟基他莫昔芬（5mM储备用2.58mL乙醇重组，250nM终浓度）的孔（每孔50μL）以激活Cre重组酶和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU，10mM储备溶液用2mL DMSO重组，1μM终浓度）以跟踪细胞增殖。
注意：已知 4-羟基他莫昔芬和 EdU 是人类致癌物、致畸剂和诱变剂。使用前请阅读材料安全数据表，并戴上手套、护目镜和实验室外套。根据制造商的建议重新组合两种试剂。不要吸入该物质/混合物。使用后紧闭。废物必须按照国家和地方法规进行处置。使用该物质后洗手和洗脸。 - 在37°C培养箱中孵育2天（图1B）。
8. 单元格转换
注意：细胞转换阶段的持续时间约为5-6天（图1B），但可以延长周期。
- 每天检查细胞是否成功诱导tdTomato表达，潜在的细胞死亡和/或污染。细胞密度不变（图4）。在4-羟基他莫昔芬治疗后1天可以观察到第一个微弱的红色荧光标记的细胞。需要荧光显微镜来监测和成像细胞。
注意：在本研究中，荧光显微镜用于实时成像。使用4倍，10倍或20倍物镜拍摄图像。 - 转染后两天，取出培养基，并在每个孔中加入500μL补充有4-羟基他莫昔芬和EdU的预热神经元培养基。
- 每隔一天用新鲜培养基替换培养基，直到细胞被收获。
- 拍摄实时图像以评估和评估红色荧光（Ascl1表达）细胞的数量及其形态变化（图4和图5A-C）。
9. 细胞收获：免疫荧光标记的固定
注意：细胞可以收获用于其他下游应用，包括散装或scRNA-Seq，RT-qPCR或蛋白质印迹。
- 取出培养基，每孔加入500μL冷HBSS（4°C），轻轻摇动板（来回，从左到右）。移除哈佛商学院。
- 通过加入500μL2%多聚甲醛（PFA）固定细胞，并在室温下孵育20分钟。
- 根据既定方案进行免疫荧光标记。
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Representative Results
该协议描述了如何从P12小鼠视网膜中生长MG，以及如何使用 Ascl1CreERT：td多巴托斯托普/fl RPC报告小鼠将这些细胞用miR-25重新编程为视网膜神经元。该方法在先前的工作中详细报告了其他合适的miRNA（模仿物或抑制剂，作为单分子或组合）以将MG重新编程为RPC，然后采用神经元细胞特征27。该方法已被修改以更快地生长培养物，从而最大限度地减少人工环境随时间24，28，29引起的细胞改变。
原发性MG培养的视网膜解离和生长阶段
第一个MG最早可以在第一天使用光学显微镜在体外发现。MG具有管状，细长的形状和浅灰色的细胞体（图3A-D，红色箭头）。然而，在这些早期阶段，它们中的大多数都被细胞碎片覆盖。来自一只小鼠的两个视网膜的MG，在12孔板的一个孔中生长，在4-5天内达到90%-95%汇合（图3E，F）。随着时间的推移，所有神经元碎片将被清除，并且会出现致密的细胞层。如果孔的底部没有完全汇合，细胞就不能准备好传代。然而，传代不应晚于体外6天进行，因为随着时间的推移，神经胶质细胞在培养物中会失去其神经胶质特征。在转染或任何其他治疗之前，需要检查细胞的密度和活力。转染只能在90%-95%的汇合细胞上进行（图3G）。对于免疫荧光标记和共聚焦显微镜分析，需要将细胞接种在包被的盖玻片上。
细胞转化期的早期和晚期
早在转染和4-羟基他莫昔芬处理后15小时，第一个细胞就开始表达微弱的红色荧光，即在Ascl1前驱下驱动的tdTomato红色荧光报告蛋白。阿斯cl1表达细胞现在进一步被称为Ascl1-Tom+细胞。转染后2天可以观察到更健壮的Ascl1-Tom表达，红色荧光随时间推移而增加（图4）。重编程效应在培养物中约2天变得可见，在重编程miRNA处理中每个场发现许多Ascl1-Tom +细胞：此处显示了对照-miR和miR-25（分别为图4B-B'''和图4C-C'''）。在这两种治疗中，Ascl1-Tom +细胞仍然相当圆且相对较大，具有更多的神经胶质细胞/祖细胞样形态。此外，红色荧光报告的诱导不会影响培养物的细胞密度（仍然是90%-95%汇合物）。
转染后三到五天（图4A和图5A），Ascl1-Tom+细胞数量的增加在miR-25处理的孔中变得更加明显（图5B-D），表明miR-25处理后的数量增加了四倍。此外，最初的形态变化变得可见。这些变化包括细胞体腔尺寸的减小和精细工艺的发展。虽然在对照条件下，绝大多数细胞是大而扁平的（神经胶质/祖细胞样，图-5B-B''），但许多具有小细胞核和几个类似于视网膜神经元的小过程的细胞出现在miR-25治疗中（图-5C-C''）。这些神经元样细胞约占Ascl1-Tom总群体的70%（对照治疗为15%;图 5E）。由于细胞转换，细胞密度较低（较小的单元格需要较少的空间）。有趣的是，这些神经元样细胞甚至似乎形成了微小的网络（图5C''）。此时，可以收获细胞进行免疫荧光标记以确认神经元身份。
确认神经元身份
用针对微管相关蛋白2（Map2）的抗体标记细胞，微管相关蛋白2是神经元特异性细胞骨架蛋白30，31的标记物，以及针对正齿同源盒2（Otx2）的标记物，以验证神经元身份32，33。这两种标记物也用于先前的重编程研究21，27。Otx2是一种转录因子，存在于RPC34，35，36，成熟双极细胞34，35，37，38，39和光感受器35，36，37，38，40中.DAPI核标签用于反染色培养物。免疫荧光标记在对照条件下显示很少或不存在Map2或Otx2表达（图6A-A''，C）。然而，经过 miR-25 处理的样品具有许多 Map2+ 和 Otx2+ 细胞（图 6B-B'）。共聚焦图像的定量表明，在miR-25过表达后，每个场存在约40个神经元细胞，而对照中每个场存在5个神经元细胞（图6C，场大小：630μm x 630μm）。图像是用20倍物镜拍摄的。这些神经元细胞约占miR-25处理样品中Ascl1-Tom+细胞群总数的70%（对照〜20%，图6D）。所有神经元样Ascl1-Tom+细胞均为Map2+和Otx2+，证实了神经元的身份。此外，与对照miRNA处理相比，miR-25处理后Otx2+和Map2+细胞的绝对数量更高（miR-25：每个场60个细胞，对照-miR：每个场10个细胞;图 6E）。
综上所述，结果表明MG培养物可以用miRNA生长和重编程。miR-25 补充剂诱导原发性 MG 中的 Ascl1-Tom 表达。许多MG转化为采用神经元形态的RPC，并在几天后表达神经元标记物Map2和Otx2。
图1：初级穆勒胶质细胞培养物的实验设计和时间过程 （A） Ascl1CreERT：tdTomatoSTOPFL / fl小鼠的示意图，这是一种视网膜祖细胞报告小鼠，用于跟踪穆勒胶质细胞（MG）转化为视网膜祖细胞（RPC）的转化。（B）培养期的时间过程，包括生长阶段（蓝色， 体外0-4/5天，div），转染阶段（紫色，5/6-7/8除数）和MG转化期（黄色，开始7/8天）。生长阶段：在生长培养基中，在12孔板的一个孔中生长分离的视网膜（一只小鼠的两个视网膜）。在第4/6天左右，将细胞传代到含有涂层盖玻片的24孔板中。转染阶段：用miRNA转染5-7格（传代后1天）细胞在转染培养基中转染2天。 克雷 重组酶被4-羟基他莫昔芬（4-OHT）激活。使用EdU跟踪细胞增殖。MG转化阶段在转染后1天开始。细胞现在在神经元培养基中生长直到收获（转染后6-7天，dpTF）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：视网膜解离和基因分型 （A）眼罩，去除角膜，晶状体，虹膜和玻璃体。（B） 孤立的视网膜;彻底清洗后去除视网膜色素上皮（RPE）细胞。（C）具有解离视网膜的12孔板（每孔两个视网膜）。（D）基因分型凝胶图像示例的切口。需要基因分型来鉴定具有 Ascl1 驱动的 Cre 重组酶表达的小鼠，并将用于跟踪细胞转化。比例尺：1 mm ，请点击此处查看此图的放大图。
图3：生长阶段的初级Müller神经胶质细胞（A）在生长阶段（体外0-4/5天）培养期的时间过程以蓝色突出显示。（B-G）在生长阶段，在培养基变化（C）后2个，3个div（D），通过前4个d（E，F）和5个div，通过后1天和转染前（G）的生长阶段Müller glia（相位）的活图像（阶段）。MG细胞体由红色箭头表示。3天级后，培养物为60%-80%汇合（D），4-5迪拉姆后，培养物为90%-100%汇合并准备通过（E-F）。在盖玻片上传代后，细胞培养物需要80%-90%汇合，以便随后转染（G）。比例尺：50 微米（A-D）、100 微米（E）、200 微米（俄）。请点击此处查看此图的大图。
图4：Müller神经胶质细胞转化阶段的早期阶段（A）转化阶段的培养周期过程以黄色突出显示（体外开始7/8天（div））。该图所示的分析时间点由红星表示：转染后7分，2天（dpTF）。（公元前）缪勒胶质细胞（MG）培养物的相和红色荧光，组合或单一红色荧光的活图像。红色荧光显示阿斯克拉1表达MG（tdTomato+，缩写为Ascl1-Tom），在用对照miRNA模拟物（对照miR，B-B''）或miR-25模拟物（C-C'''）转染2天后。黑白和黑白中的区域以较高的放大倍率显示在黑白、黑白/黑白中。比例尺 200 μm 请点击此处查看此图的大图。
图5：穆勒神经胶质细胞转化阶段的结束阶段（A）转化阶段的培养周期过程以黄色突出显示（体外开始7/8天（div））。该图所示的分析时间点由红星表示：转染后10迪，5天（dpTF）。（公元前）缪勒胶质细胞（MG）培养物的相和红色荧光，组合或单一红色荧光的活图像。红色荧光显示，在转染 （pTF） 后 5 天，使用对照模拟物（对照 miR，B-B''）或 miR-25 模拟物（C-C''）表达 MG（tdToma+，缩写为 Ascl1-Tom）的 Ascl1。B'/C'中的插页分别以 B''/C'' 的较高放大倍率显示。（D）转染后2天和5天对照-miRNA或miR-25处理后每田的Ascl1-Tomato+细胞的绝对数量（10x;1440μm x 1080μm）（dpTF; n = 1，每孔5张图像计数，平均±SD）。（E）转染后5天（5dpTF，n = 1，平均±SD）后，对照-miRNA或miR-25处理后每田（10x; 1440μm x 1080μm）的神经元样Ascl1-番茄+细胞占每田总Ascl1-番茄+细胞的百分比。.比例尺：100 μm.请点击此处查看此图的大图。
图6：确认重编程细胞的神经元身份。B-B'''）原代小鼠穆勒神经胶质细胞（MG）培养物的免疫荧光标记在转染后5天用对照miRNA模拟物（对照miR，A-A'''）或miR-25模拟物（B-B'''）处理。用2%多聚甲醛（PFA）固定细胞，并与针对RFP的抗体一起孵育以标记tdTomato，Map2和Otx2以标记神经元。DAPI核标记（蓝色）用于染色所有细胞核。（中英）量化（n = 1;每个盖玻片计算五张图像;平均±S.D.）每个场的Ascl1-Tom + Otx2 + Map2 +细胞的绝对数量（C），Ascl1-Tom + Otx2 + Map2 +细胞占总Ascl1-Tom+细胞的百分比（D），以及每个场的Otx2 + Map2 +细胞的绝对数量（E）。结果显示，与对照组相比，miR-25治疗中的神经元数量更多。视场尺寸：630 微米 x 630 微米。比例尺：50 μm.请点击此处查看此图的大图。
补充图1：细胞死亡和细菌污染。（A-A''）穆勒胶质细胞（MG）培养物3 div被细菌污染的实时图像。A 中的插图 1 以 A' 的较高放大倍率显示，并显示萎缩的死神经胶质细胞。A 中的插图 2 在 A'' 中显示，具有活的神经胶质细胞。比例尺：100 μm.请点击这里下载此文件。
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Discussion
该协议描述了如何从解离的小鼠视网膜中生长MG，以使用miRNA进行重编程研究。如先前各种研究所显示和证实的那样，在这些培养物中发现的绝大多数（80%-90%）细胞是MG20，23，24。这种方法是一种非常可靠和可靠的技术，如果正确遵循协议21，27，可以很容易地重现结果。然而，培养物的成功生长和重新编程效率取决于多种因素。
首先，小鼠的年龄在成功的细胞生长中起着重要作用。因此，如果MG培养物是从野生型小鼠或类似于野生型的转基因小鼠（如报告小鼠）中生长的，则生长融合MG单层的最新年龄是P12。在P12处，所有视网膜神经元和MG都是分化的，视网膜中不再存在RPC。MG表达成熟的MG标志物如谷氨酰胺合成酶或谷氨酸天冬氨酸转运蛋白（GLAST）20，23，41，42。当暴露于EGF时，培养的P12 MG仍然可以重新进入细胞周期，但是循环次数有限，尽管足以 在体外形成汇合的细胞层。然而，即使P12 MG也不能很好地生长，因为EGF或培养基中的成分可能会降解。不完全解离（块）也会导致MG生长减少或延迟。不完全解离的主要原因是通过苛刻处理酶（快速移液，涡旋等）来灭活用于视网膜解离的DNA酶I。即使细胞在传代前生长良好，细胞在传代后也会较少汇合。其原因可能是在传代过程中处理苛刻，导致细胞死亡增加，或者因为细胞接种太稀疏。由于神经胶质细胞生长不多，因此应以与生长相同的比例接种细胞，而不是稀释（与永生细胞系的传代程序相反）。值得注意的是，由于MG培养物从孔的中心生长到孔的外围，因此在中心总是会发现更高的细胞密度。因此，在通过之前必须检查每口孔的边缘，以确保整个孔被细胞覆盖。应进行细胞浓度测量以确保处理足够数量的细胞。
此外，从P6或更年轻的小鼠获得的原代培养物不会含有任何MG，因为MG在这个时间点即将成熟。这是 通过单细胞RNA-seq分析43显示的。在这个年龄段用成熟的MG标志物进行免疫荧光标记也将证实这一点。然而，在P6中，RPC的比例很大。因此，应仔细解释结果。此外，诸如中间丝状标记物Vimentin和nestin之类的标志物不适合识别原发性MG，因为这些标志物也在星形胶质细胞44，45，46，小胶质细胞47，48，内皮细胞和周细胞49，50，51，52中表达。，并且不是特定于 MG 的。GFAP在视网膜星形胶质细胞中表达，但不在未受损视网膜的MG中表达，不是培养MG的良好标志物。虽然由于解离过程中的机械损伤，它在解离的MG中上调，但在培养物28中3天后下调。
由于MG共享许多RPC标记物，因此确保强大的MG培养物的最安全程序是使用P12或更老的小鼠。虽然该方案描述了从P12小鼠MG获得的培养物，但成年小鼠MG可以培养并重新编程27。然而，每孔需要更多的组织需要电镀（四到六个视网膜）。这是因为成人神经胶质细胞不会分裂太多，即使暴露于EGF和10%的血清。细胞接触减少会导致细胞死亡和细胞变性（细胞伸展，细胞增大）。成体神经胶质细胞是共培养范式18 的好工具，在这些应用中，细胞密度可能并不重要。然而，对于转染或转导等下游应用，需要融合的细胞层。
除了生长受损外，还可能发生细胞死亡。如果细胞死亡时没有任何明显体征，应考虑支原体污染（支原体大小 0.1-0.3 μm），并应使用支原体检测试剂盒。保持每个样品分开（而不是混合样品）也可以降低交叉污染的风险。然而，较大的细菌也可以从动物身上携带过来，即使所有工作都是在干净，无菌的环境中完成的，也可能导致污染。建议在解剖眼睛之前，将眼球短暂浸入70%乙醇中，并在额外的10厘米培养皿中彻底清洗。为了实现成功的培养，必须在无菌条件下工作，因为污染可能很快发生。一旦在平板中发现细菌，酵母或霉菌/真菌，即使并非所有孔都受到影响，培养物也会丢失。污染将导致细胞死亡（补充图1）并会影响细胞，导致数据不具有代表性。
细胞死亡也可能是由下游应用所需的试剂引起的，例如用于涂覆盖玻片的Poly-O（或聚-D-赖氨酸）。这些物质是有毒的，在使用层粘连蛋白之前需要彻底清洗。盖玻片应粘在井底，而不是漂浮在井内。需要避免气泡。此外，用层粘连蛋白进行完全涂层对于确保细胞粘附在盖玻片上至关重要。缺乏层粘连蛋白也会导致细胞密度降低和/或细胞死亡。
为了鉴定真正的重编程神经胶质细胞，应使用报告小鼠和允许细胞跟踪的细胞增殖标记物，例如EdU或BrdU。由于整个视网膜被电镀，神经元幸存者存在于所有培养物中。然而，在大多数情况下，它们在通过后几乎完全被移除。然而，应进行EdU（或BrdU）标记以验证神经元起源于增殖的MG / RPC，而不是神经元幸存者（有丝分裂后）。在这里使用的对照中发现的少量神经元是神经元幸存者。
有趣的是，一些Ascl1-Tom +细胞也存在于对照治疗中，随着时间的推移，数量略有增加。这些细胞在分离和培养时可能是一些相当不成熟的MG表达Ascl1。然而，这个Ascl1-Tom+细胞群的比例很小。此外，在对照治疗中发现的这些Ascl1-Tom +细胞中的大多数不表达Otx2和/或Map2，并保持相当平坦的细胞形状。在受控条件下似乎没有神经元分化发生。似乎形成网络的非常微妙的神经元样细胞仅在miR-25处理后才被发现。
这里描述的方案在以前的研究中用于测试MG重编程21，27的miRNA，并且在过去几年中对孔板进行了轻微修改以生长神经胶质细胞。它们现在生长在12孔板中，而不是6孔板中。4/5天后（6孔板为6/8天），可以在12孔板中获得融合单层，因此，导致细胞改变/变性的总培养期减少。转染时间窗口也变长了。常规转染方案的转染持续时间为3小时，之后需要完全更换培养基以确保细胞存活。所有分子在此培养基改变后被除去。在目前的方案中，通过在转染试剂培养基中加入50%的神经元培养基（补充Cre诱导和细胞增殖跟踪所需的因素），延长了时间窗口，并允许更长时间地暴露于miRNA。细胞是健康的，这种修饰没有遇到任何问题。随着转染时间的延长，转染结果似乎更好，但需要更多的数据来证实这一观察结果。
此外，此处描述了免疫荧光标记以进行共聚焦激光扫描显微镜所需的所有步骤。因此，MG需要在玻璃盖玻片上通过。由于盖玻片小于24孔板的面积，因此只有大约三分之一的细胞可以覆盖24孔板的全孔适合涂层盖玻片。对于其他应用，如qPCR，RNA-Seq或蛋白质印迹，细胞以1：1的比例传代，在所需的时间点处理和收获。
如前所述，该培养系统也可用于其他应用，例如，研究神经胶质行为，包括神经保护机制，胶质细胞增生和/或分析mRNA，miRNA或培养的神经胶质细胞的蛋白质，类似于使用略有不同的培养范式或物种的研究11，28，29，54.这些应用既不需要神经元培养基来确保重编程后的神经元存活，也不需要添加EdU来可视化细胞增殖。应改用不含神经元补充剂的低血清培养基。
虽然这种方法是稳健可靠的，但与所有主要培养系统类似，它有局限性;这些是细胞的有限寿命，随着时间28的进行性细胞变性，以及它是一个2维的人工培养系统，不能模仿其他视网膜细胞类型和细胞外基质的生理背景。因此，在 MG 原代培养物中鉴定出最佳候选者及其最有效浓度后，应进行视网膜外植体培养，即类似于视网膜组织的 3D 培养系统。外植体培养物的培养期也有限，外植体中的细胞也会随着时间的推移而退化。然而，它们允许在它们的天然3D环境中研究MG，并且可以在不同年龄进行，以反映动物23，32，55，56的发育阶段。
总而言之，本研究报告了用于监测RPC miRNA miR-25将MG重新编程为神经元样细胞的潜力的MG培养物，并通过免疫荧光标记验证。该协议用于以前的工作21，24，27，并且是当前研究MG再生潜力的体外方法。虽然这里专门描述了用于MG重编程的miRNA过表达，但在MG原代培养物中可以使用/测试其他因素，例如小分子，DNA（质粒或包装成病毒载体），用于蛋白质抑制32的抗体或特定化合物。还有广泛的下游应用，包括miRNA分析24，scRNA-seq27，RT-qPCR20，21或蛋白质印迹20。此外，MG原代培养物允许对细胞进行日常观察和监测。这对于确定时间点（例如，确定某个反应或细胞反应的开始，持续时间和/或结束）可能是一个实质性的优势。可以在MG原代培养物中研究和分析迁移或增殖行为以及损伤/细胞损伤相关范例（例如，MG培养物中的全局miRNA缺失）32，以确定潜在的机制和途径。因此，MG培养物是一种非常强大的工具，用于在体内系统中实施之前在分子和细胞水平上研究MG。
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Disclosures
华盛顿大学已经与发明人尼古拉斯·约斯塔德，斯蒂芬妮·沃尔和托马斯·雷赫申请了包括本报告中一些发现的专利。该专利的标题为“刺激视网膜再生的方法和组合物”。
Acknowledgments
作者感谢Ann Beaton博士和所有实验室成员对手稿的意见。特别感谢Tom Reh博士，朱莉娅·波拉克博士和Russ Taylor博士在西雅图华盛顿大学的博士后培训期间将MG主要文化作为筛选工具介绍给S.G.W.。该研究由帝国创新计划（EIP）资助给S.G.W.和纽约州立大学验光学院向S.G.W.的启动资金资助，以及美国国家眼科研究所（NEI）向S.G.W.颁发的R01EY032532奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
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