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Developmental Biology

Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN

Published: March 28, 2022 doi: 10.3791/63651
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

Summary

Los cultivos primarios de Müller glia obtenidos a partir de retinas de ratón representan una herramienta muy robusta y fiable para estudiar la conversión glial en células progenitoras de la retina tras el tratamiento con microARN. Las moléculas individuales o combinaciones pueden ser probadas antes de su posterior aplicación de enfoques in vivo .

Abstract

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural y puede funcionar como una fuente regenerativa para las neuronas retinianas. En vertebrados inferiores como los peces, la regeneración impulsada por MG ocurre naturalmente; en los mamíferos, sin embargo, se requiere estimulación con ciertos factores o manipulación genética/epigenética. Dado que la MG comprende solo el 5% de la población de células de la retina, existe la necesidad de sistemas modelo que permitan el estudio de esta población celular exclusivamente. Uno de estos sistemas modelo son los cultivos primarios de MG que son reproducibles y se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluida la detección e identificación de moléculas / factores, pruebas de compuestos o factores, monitoreo celular y / o pruebas funcionales. Este modelo se utiliza para estudiar el potencial de la MG murina para convertirse en neuronas de la retina después de la suplementación o inhibición de microARN (miARN) a través de la transfección de miARN artificiales o sus inhibidores. El uso de ratones reporteros específicos de MG en combinación con el marcado inmunofluorescente y la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) confirmó que el 80%-90% de las células encontradas en estos cultivos son MG. Usando este modelo, se descubrió que los miRNAs pueden reprogramar MG en células progenitoras de la retina (RPC), que posteriormente se diferencian en células similares a las neuronales. Las ventajas de esta técnica son que los candidatos a miRNA pueden ser probados por su eficiencia y resultado antes de su uso en aplicaciones in vivo .

Introduction

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural. Tienen funciones similares en comparación con otras glías en otras partes del sistema nervioso central, como mantener la homeostasis del agua y los iones, nutrir las neuronas y proteger el tejido. Las MG tienen otra característica fascinante: aunque son glía madura, todavía expresan muchos genes expresados en células progenitoras de la retina (RPC) durante el desarrollo tardío 1,2. Se supone que esta semejanza es la razón de la regeneración neuronal natural basada en MG en la retina de los peces después del daño retiniano 3,4. Durante este proceso, la MG vuelve a entrar en el ciclo celular y se desdiferencia en RPC que luego se diferencian en los seis tipos de neuronas retinianas. Aunque este fenómeno ocurre naturalmente en los peces, las MG de mamíferos no se convierten en neuronas 5,6. Sin embargo, pueden reprogramarse. Se ha demostrado que una variedad de factores reprograman la MG en RPC/neuronas; entre estos factores se encuentra el factor de transcripción básico hélice-bucle-hélice (bHLH) homólogo 1 (Ascl1) que interviene en la regeneración de peces 7,8. En ratones, Ascl1 solo se expresa en RPC durante la retinogénesis, pero está ausente en neuronas maduras mg o retinianas9.

La reprogramación de células directamente in vivo no solo es un desafío metodológico, sino que también requiere la aprobación de un comité institucional de cuidado y uso de animales. Para recibir la aprobación, se requieren datos preliminares sobre los factores utilizados o alterados, las concentraciones, los efectos fuera del objetivo, los mecanismos subyacentes, la toxicidad y la eficiencia. Los sistemas de cultivo celular permiten probar estos criterios antes de su uso en modelos in vivo. Además, dado que la MG solo comprende alrededor del 5% de toda la población de células retinianas10, los cultivos de MG permiten estudiar su función11 así como su comportamiento, incluyendo la migración 12,13, la proliferación14, la reacción al estrés ante una lesión/daño 15,16, su interacción con otros tipos celulares como la microglía17 o las células ganglionares de la retina (RGC)18, o su potencial neurogénico 19,20,21. Muchos investigadores utilizan líneas celulares inmortalizadas para sus estudios, ya que tienen un potencial proliferativo ilimitado y pueden mantenerse y transfectarse fácilmente. Las células primarias, sin embargo, son preferibles para ensayos biológicamente relevantes que las células inmortalizadas, ya que tienen verdaderas características celulares (expresión de genes y proteínas) y, lo que es más importante, representan una cierta etapa en el desarrollo y, por lo tanto, tienen una "edad". La edad de un animal (y en consecuencia de las células obtenidas de un animal) es un factor especialmente crucial en la reprogramación celular, ya que la plasticidad celular se reduce con la etapa avanzada de desarrollo22.

Este protocolo describe en detalle cómo reprogramar la MG primaria con miRNAs como un método in vitro actual para estudiar la regeneración. Este modelo de cultivo primario de MG se estableció en 2012 para evaluar las características de proliferación celular de MG en ratones knock-out P53 (ratones trp53-/-)23. Se demostró que la MG cultivada mantiene sus características gliales (es decir, la expresión de las proteínas S100β, Pax6 y Sox2 evaluadas mediante el etiquetado inmunofluorescente), y que se asemejan a la MG in vivo (microarray de MG purificada por FACS)23. Poco después, la expresión de ARNm glial y proteínas fue validada y confirmada en un enfoque diferente utilizando vectores virales20. Unos años más tarde, se confirmó que la gran mayoría de las células encontradas en estos cultivos son MG mediante el uso del Rlbp1 específico de MGCreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter mouse24. Además, la cuantificación del conjunto de miRNAs tanto en MG purificada por FACS como en MG primaria cultivada mostró que los niveles de mg miRNAs (mGLiomiRs) no varían mucho en MG cultivada durante la fase de crecimiento. Los períodos de cultivo alargados, sin embargo, causan cambios en los niveles de miRNA y, en consecuencia, en los niveles de ARNm y la expresión de proteínas, ya que los miRNAs son reguladores traslacionales25.

En 2013, este modelo de cultivo de MG se utilizó para probar una variedad de factores de transcripción con respecto a su capacidad para reprogramar MG en neuronas retinianas20. Se encontró que Ascl1 era un factor de reprogramación muy robusto y confiable. La sobreexpresión de Ascl1 a través de vectores virales indujo cambios morfológicos, expresión de marcadores neuronales y la adquisición de propiedades electrofisiológicas neuronales. Más importante aún, los conocimientos y resultados obtenidos de estos primeros experimentos in vitro se transfirieron con éxito a aplicaciones in vivo 22,26 demostrando que los cultivos primarios de MG representan una herramienta sólida y confiable para el cribado factorial inicial y la evaluación de las características gliales antes de la implementación in vivo.

Hace unos años, se demostró que el miRNA miR-124 enriquecido con cerebro, que también está altamente expresado en las neuronas de la retina, puede inducir la expresión de Ascl1 en MG21 cultivado. La expresión de Ascl1 en células vivas se visualizó a través de un ratón reportero Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Un ratón reportero es un ratón genéticamente modificado que tiene un gen reportero insertado en su ADN. Este gen reportero codifica para una proteína reportera, que es en este estudio tdTomato, una proteína fluorescente roja. Esta proteína reportera informa de la expresión de un gen de interés, en este caso, Ascl1. En otras palabras, las células que expresan Ascl1 se volverán rojas. Dado que Ascl1 solo se expresa en RPC9, este ratón Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl permite el seguimiento de la conversión de MG en RPC que expresan Ascl1, lo que significa que las células convertidoras expresarán la proteína reportera tdTomato fluorescente roja. Este es un etiquetado irreversible ya que el ADN de estas células está alterado. En consecuencia, cualquier diferenciación neuronal posterior se visualizará porque la etiqueta tdTomato permanece en las células diferenciadoras. Si Ascl1 que expresa RPC derivados de MG (con etiqueta tdTomato) se diferencian en neuronas, estas neuronas aún tendrán su etiqueta roja. Este ratón, por lo tanto, permite no solo el etiquetado de RPC derivados de MG para imágenes de células vivas, sino que también permite el mapeo del destino y el rastreo de linaje de estos RPC derivados de MG (rojos). Más recientemente, se identificó el conjunto de miRNAs en RPC y se utilizaron cultivos MG de ratones Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter para detectar y probar el efecto de estos miRNAs sobre la capacidad de reprogramación y la eficiencia27. Un candidato, el RPC-miRNA miR-25, se encontró capaz de reprogramar la MG cultivada en células que expresan Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Estas células reprogramadas adoptan características neuronales a lo largo del tiempo, incluida la morfología neuronal (somatas pequeños y procesos finos cortos o largos), la expresión de transcripciones neuronales medidas a través de scRNA-Seq, así como la expresión de proteínas neuronales validadas mediante el etiquetado inmunofluorescente27.

Aquí, el protocolo detalla cómo cultivar y transfectar MG a partir de ratones P12 adaptados del trabajo anterior 21,24,27. Elegido para este protocolo es el mencionado miRNA miR-25, un miRNA altamente expresado en RPCs, con bajos niveles de expresión en MG o neuronas retinianas. Para sobreexpresar miR-25, se utilizan imitaciones murinas de miR-25, es decir, moléculas artificiales de miRNA. Como control, se eligen imitaciones de un miRNA de Caenorhabditis elegans, que no tienen función en células de mamíferos. La visualización de la conversión de MG en RPC se realizó a través del ratón reportero RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), un ratón con fondo mixto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Sin embargo, este cultivo se puede realizar con todas las cepas de ratón, incluidas las cepas de tipo salvaje. En los últimos años, el protocolo original se ha modificado para reducir la duración de la fase de crecimiento y el período de cultivo general y garantizar un estado de células de la glía más robusto y minimizar el grado de degeneración celular, que ocurre en períodos de cultivo prolongados. La ventana de tiempo de transfección regular también se amplió de 3 h a 2 días. Como se mencionó anteriormente, aunque el protocolo actual describe los cultivos de MG como una herramienta para estudios de regeneración, el método no solo es útil para probar factores de reprogramación, sino que también se puede adaptar para otras aplicaciones, incluidos estudios sobre el comportamiento migratorio o proliferativo de MG, paradigmas relacionados con lesiones / daño celular y / o la identificación de mecanismos y vías subyacentes.

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Protocol

Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en SUNY College of Optometry.

NOTA: Este protocolo de cultivo consta de tres fases: crecimiento, transfección y fase de conversión. En la Figura 1 se ofrece un resumen del protocolo general con la línea de tiempo.

1. Preparación de medios y todos los reactivos requeridos

NOTA: Todos los pasos deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad A2 o B2 (BSC). Durante la fase de crecimiento, se utiliza un medio de crecimiento de alto contenido sérico que consiste en un medio neuronal basal suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF). Para la fase de conversión, se utiliza un medio basal neurofisiológico de bajo sero suplementado con suplementos neuronales para garantizar la diferenciación neuronal y la supervivencia.

  1. Preparar el medio de crecimiento (utilizado durante la fase de crecimiento) complementando 200 ml de medio neuronal basal con 20 ml de suero fetal bovino (FBS, 10%), 1 ml de 200 ml de L-glutamina (0,5%), 2 ml de penicilina/ estreptomicina (1%) y 2 ml de suplemento de N2 (1%). Realizar filtración estéril (unidades de filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm). Precaliente el medio en un baño de perlas metálicas a 37 °C antes de usarlo.
  2. Preparar el medio neuronal (utilizado durante la fase de conversión) siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales) complementando 100 mL de medio basal neurofisiológico libre de suero con 2 mL de suplemento neuronal B27 (2%), 1 mL de suplemento N2 (1%), 20 μL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) de 100 ng/mL, reconstituir en albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS, concentración final 20 ng/mL), 20 μL de factor neurotrófico derivado de células gliales de 100 ng/mL (GDNF, reconstituir en solución salina equilibrada de Hanks estéril [HBSS], concentración final 20 ng/mL), 500 μL de 100 mg/mL de dibutiril-cAMP (reconstituir en DMSO), 70 μL de ácido ascórbico de 50 ng/mL (reconstituir en PBS estériles) y 1,5 mL de penicilina/estreptomicina. Realizar filtración estéril (unidades de filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm). Medio precalentado en baño de perlas metálicas a 37 °C antes de su uso.
    NOTA: Estos medios se pueden almacenar a 4 °C, durante 1 mes.
  3. Reconstituir los reactivos Papain, DNase I y Ovomucoid necesarios para la disociación de la retina siguiendo el protocolo del fabricante. Alícuota 750 μL de papaína en tubos estériles de 1,5 ml, 75 μL de DNasa I en tubos estériles de 0,6 ml y 750 μL de inhibidor de la proteasa ovomucoide en tubos de 2 ml. Congele las alícuotas de papaína y DNasa I a -20 °C y mantenga las alícuotas ovomucoides a 4 °C para evitar la degradación de los reactivos. Descongelar a temperatura ambiente justo antes de su uso.
    NOTA: La papaína, la DNasa I y el ovomucoide se encuentran en un kit llamado Sistema de disociación de papaína (consulte la Tabla de materiales).
  4. Reconstituir poli-L-ornitina (Poly-O) y Laminina para el recubrimiento de la cubierta si se realiza el etiquetado inmunofluorescente siguiendo las instrucciones de la hoja de datos (Poly-O: 0,1 mg/ml en agua estéril; Laminina: diluir 1,2 mg/ml a 1:50 en DMEM). Alícuota Poly-O y Laminina (2,5 mL) y alícuotas congeladas a -20 °C. Descongelar a temperatura ambiente justo antes de su uso.
    NOTA: Paso 1.4. solo se requiere si se realiza el etiquetado inmunofluorescente y la microscopía de escaneo láser.

2. Extracción de ratones y tejidos

NOTA: Para estos estudios de reprogramación, el ratón Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl se creó cruzando un ratón Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) con un ratón tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Este ratón tiene un fondo mixto (C57BL/6, S129 y cepa ICR). El genotipo de este ratón se muestra en la Figura 1A. Todas las cepas se pueden utilizar para este protocolo.

  1. Use guantes y desinfecte el espacio de trabajo, incluido el microscopio de disección y todas las herramientas finas (fórceps curvas Dumont # 5 fine y Dumont # 7, tijeras finas y tijeras Vannas) con etanol al 70%. Desinfecte un plato de disección negra recubierto de silicona de 10 cm exponiéndolo a la luz UV durante 20 minutos.
  2. Preparación de platos y platos para la extracción de tejidos
    1. Prepare una placa de 24 pocillos para la recolección de ojos y la separación de muestras (dos ojos por ratón en un pozo, etiquetados con identificaciones de ratón) con ~ 1 ml de HBSS frío (4 ° C) por pozo. Coloque la placa de 24 pocillos sobre hielo.
    2. Llene una placa de Petri estéril de 10 cm (para lavar) y la placa de disección recubierta de silicona desinfectada con varios ml de HBSS frío (4 ° C) para asegurarse de que el tejido esté completamente cubierto con HBSS.
    3. Preparar un tubo estéril de 1,5 ml con 1 ml de etanol al 70%.
    4. Prepare una placa de cultivo de 12 pocillos etiquetando la placa con el número de cultivo, la fecha, la cepa y toda la información requerida.
  3. Sacrificar ratones P12 utilizando cualquier método aprobado.
  4. Extirpación de los ojos
    1. Sostenga suavemente la cabeza del mouse con el pulgar y el dedo índice alrededor del ojo.
    2. Usando pinzas curvas Dumont #7, vaya suavemente detrás del globo ocular y corte el nervio óptico. Saque con cuidado el ojo.
      NOTA: Si se usan ratones adultos, no use fórceps curvos y no tire del ojo. En su lugar, corte cuidadosamente alrededor del globo ocular con tijeras finas; corte el nervio óptico pero no corte el ojo en sí. Use fórceps para quitar cuidadosamente el globo ocular.
  5. Limpieza del globo ocular
    1. Sumerja el globo ocular brevemente en un tubo que contenga etanol para evitar el arrastre de bacterias del animal.
    2. Lave el globo ocular brevemente en la placa de Petri de 10 cm antes de colocarlo en la placa de 24 pocillos sobre hielo.
  6. Repita los pasos 2.4 y 2.5 para los otros ojos. Mantenga la placa del pozo en el hielo durante el proceso. Coloque dos ojos de un animal en el plato de disección colocado bajo un microscopio de disección con una fuente de luz.
  7. Extracción de retina
    1. Fije un globo ocular agarrando el nervio óptico y el tejido conectivo circundante alrededor de la esclerótica con fórceps finos Dumont # 5 y presiónelo cuidadosamente contra el plato de disección (córnea hacia arriba).
    2. Haga un agujero en el centro de la córnea con una aguja de 30 G para permitir un acceso más fácil para las tijeras Vannas.
    3. Diseccionar la córnea alrededor del cuerpo ciliar usando tijeras Vannas y extirpar la córnea, el cristalino, el iris y el cuerpo vítreo con cuidado con las pinzas finas Dumont #5. La figura 2A ilustra una copa del ojo con la retina dentro.
    4. Diseccionar la esclerótica con tijeras Vannas hasta alcanzar el nervio óptico. Recorte el nervio óptico y extraiga cuidadosamente la retina usando fórceps finos Dumont #5.
    5. Use un segundo par de fórceps finos Dumont # 5 para empujar contra la retina y permitir la eliminación completa del cuerpo vítreo. La figura 2B ilustra dos retinas extraídas.
  8. Transferir y lavar
    1. Corte unos 2,5 cm de la punta de una pipeta de transferencia estéril para ampliar el diámetro. Con este consejo, recoja (aspire) retinas enteras sin dañar el tejido.
    2. Transfiera las retinas a una nueva placa de Petri estéril con HBSS frío (4 °C) y balancee la placa (hacia adelante y hacia atrás, izquierda y derecha).
    3. Usando la punta de la pipeta de transferencia, empuje cuidadosamente las retinas para lavar las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR).
      NOTA: Alternativamente, toda la retina con lente y cuerpo vítreo se puede extraer de la copa del ojo. Luego, el cristalino y el cuerpo vítreo se pueden extraer de la retina extraída. Si la retina está rasgada, asegúrese de recoger todas las piezas para su disociación; de lo contrario, habrá cantidades insuficientes de tejido para hacer crecer capas celulares confluentes.
  9. Coloque inmediatamente la retina aislada en un pozo nuevo y limpio de la placa de 24 pocillos llena de 1 ml de HBSS. Mantenga la placa de 24 pocillos en el hielo durante el proceso de disección.
  10. Repita los pasos 2.7-2.9 para aislar la segunda retina.

3. Disociación de la retina

NOTA: Todos los pasos siguientes (hasta la recolección celular) deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad A2 o B2 (BSC).

  1. Prepare la mezcla de disociación Papaína/DNasa I de la siguiente manera.
    1. Para seis retinas, añadir 75 μL de DNasa I en el tubo que contiene 750 μL de papaína (a partir del paso 1.3) y mezclar con cuidado (mezcla de disociación).
    2. Para la preparación de muestras individuales que se requieren para este protocolo, divida el volumen total de 825 μL en tres alícuotas: 275 μL de la mezcla en un tubo de 1,5 ml por ratón (dos retinas). Calcule las cantidades requeridas de DNasa I y Papaína en consecuencia.
      NOTA: Se pueden disociar hasta seis retinas en un tubo de mezcla de papaína/DNasa I. Sin embargo, la preparación de muestras individuales da como resultado menos grupos y un mejor crecimiento celular que en muestras combinadas.
  2. Transfiera dos retinas a la mezcla de disociación Papaína/DNasa I. Use una pipeta de transferencia con un diámetro de punta agrandado (paso 2.8.1), recoja las retinas, espere hasta que las retinas se asienten en la parte inferior de la punta y luego libere las retinas sin exceso de HBSS en el tubo que contiene la mezcla de papaína / DNasa I.
  3. Colocar en un nutator e incubarlo durante 10 min en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% CO2).
  4. Disociar las células canalizando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo (aproximadamente 20-30 veces) con una pipeta de 1 ml. Después de que las células se disocien (es decir, que resulten en una solución homogénea sin trozos), agregue 275 μL de inhibidor de la proteasa ovomucoide del kit de disociación de papaína para neutralizar la papaína. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Si se disociaron seis retinas en 825 μL de mezcla de papaína/DNasa I, se requieren 825 μL de ovomucoide.
  5. Centrifugar la mezcla a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
  6. Añadir el factor de crecimiento epidérmico (EGF, 1 μL por 1 mL del medio de crecimiento, reconstituido a 200 μg/mL en PBS) al volumen calculado del medio de crecimiento (1 mL por ratón) precalentado a 37 °C.
    NOTA: Dependiendo del diseño experimental, el marcador de proliferación 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), así como el 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) u otros factores requeridos se pueden agregar al comienzo del período de cultivo.
  7. Retire los tubos con cuidado de la centrífuga. No toque el pellet en la parte inferior del tubo.
  8. Retire el sobrenadante con cuidado y por completo. Resuspend el pellet celular con 500 μL de medio de crecimiento suplementado con EGF.
  9. Transfiera la suspensión celular a un pocillo de la placa de 12 pocillos etiquetada (Figura 2C). Enjuague el tubo con otros 500 μL del medio de crecimiento suplementado con EGF y agréguelo al pozo (volumen total de 1 ml por pozo).
  10. Repita los pasos 3.8 y 3.9 con todas las demás muestras.
  11. Balancee la placa del pozo tres veces con cuidado (hacia adelante y hacia atrás; izquierda y derecha). Coloque la placa en la incubadora (37 °C, CO2).
    NOTA: Si se utilizan ratones transgénicos, realice el genotipado para cada animal (Figura 2D). Identifique los ratones Cre recombinas positivos y negativos y etiquete la placa en consecuencia. Para este protocolo, solo se utilizaron células de ratones reporteros positivos de Cre recombinasa para los siguientes pasos. Las células de muestras de Cre negativo se congelan y se utilizan para otras aplicaciones.

4. Fase de crecimiento

NOTA: La fase de crecimiento tiene una duración de aproximadamente 4-5 días (Figura 1B). Para agregar líquidos a los pozos que contienen células, la pipeta debe apuntar a la pared del pozo y el líquido debe liberarse lentamente para evitar el desprendimiento de la célula. No pipetee directamente sobre las células.

  1. Un día después de la disociación, retire el medio y agregue 1 ml de medio de crecimiento fresco suplementado con EGF.
  2. El día 3, retire el medio y agregue 1 ml de HBSS (temperatura ambiente) para eliminar los desechos celulares. Balancea suavemente hacia adelante y hacia atrás de izquierda a derecha. Retire el HBSS, repita el paso de lavado y agregue 1 ml de medio de crecimiento suplementado con EGF precalentado.
  3. Monitoree las células todos los días y evalúe su estado de crecimiento hasta que las células alcancen una confluencia del 90% al 100%. La Figura 3 muestra un ejemplo de buen crecimiento de MG a lo largo del tiempo. Comprobar si hay una posible contaminación o muerte celular (Figura suplementaria 1). Deseche los cultivos contaminados.
    NOTA: Para monitorear y registrar el estado de la célula, tome imágenes a varios aumentos usando un microscopio de luz con una cámara conectada y objetivos 4x, 10x o 20x. En este estudio, se utiliza un microscopio de fluorescencia.

5. Preparación de fundas con poli-L-ornitina (Poly-O) y capa de laminina

NOTA: Este paso solo es necesario si se realiza el etiquetado inmunofluorescente y la microscopía de barrido láser confocal. Se requieren cubiertas redondas de vidrio (12 mm de diámetro) para obtener imágenes adecuadas. El protocolo de recubrimiento también se puede encontrar en la hoja de datos del medio neuronal (consulte la Tabla de materiales).

  1. Coloque las fundas estériles cuidadosamente en el centro de cada pozo de una placa de 24 pocillos con pinzas #2AP Estériles Dumont.
    NOTA: Coloque los cubrehojas en el centro del pozo. Colocar cubiertas cerca de la pared de un pozo causará problemas de tensión superficial para los siguientes pasos.
  2. Descongele una alícuota poly-O de 2,5 ml a temperatura ambiente y coloque 100 μL de ella en el centro de cada funda.
  3. Incubar la placa del pozo durante 30 min en una incubadora de 37 °C.
  4. Retire Poly-O y lave el pozo con la funda tres veces con ~ 1 ml de agua estéril.
  5. Deje que la placa del pozo se seque durante la noche en el BSC. Descongelar 2,5 ml de laminina a 4 °C durante la noche.
  6. A la mañana siguiente, agregue 100 μL de Laminina en el centro de cada funda e incube durante 4 h en una incubadora de 37 ° C.
  7. Retire la laminina con cuidado y por completo.
  8. Mantenga la placa a 4 °C si no se puede realizar el pasaje inmediatamente.
    NOTA: Los recubiertos de las placas preparadas se pueden mantener durante unos días a 4 °C.

6. Paso celular para eliminar sobrevivientes neuronales

NOTA: El paso celular es necesario para eliminar las células neuronales, no para aumentar la población celular. La glía se divide solo unas pocas veces y no crecerá más después del paso. No diluya las suspensiones celulares. Las células de un pozo confluente de una placa de 12 pocillos se pueden distribuir en un pozo de una placa de 12 pocillos o dos pocillos de una placa de 24 pocillos. Cuando se utilizan fundas recubiertas, solo alrededor de un tercio de la cubierta está recubierta. Por lo tanto, se pueden obtener seis hojas de cubierta en una placa de 24 pocillos, con células confluentes (~ 80% -90%) de un pozo de células confluentes de una placa de 12 pocillos. También se pueden elegir otras proporciones para aumentar o disminuir la densidad celular. Para este protocolo, se utiliza un ratón reportero Cre+ [un experimento, dos tratamientos: miR-25 o control-miR; réplicas técnicas n = 3 (tres coverslips por tratamiento), replicación biológica n = 1]. El número de réplicas técnicas y biológicas se puede definir de manera diferente dependiendo del diseño experimental.

  1. Compruebe si las células son 90%-100% confluentes (también en el margen del pozo; Figura 3E,F).
  2. Retire el medio y agregue 1 ml de HBSS (temperatura ambiente) para lavar. Mece suavemente el plato (hacia adelante y hacia atrás, izquierda y derecha). Elimine HBSS por completo.
  3. Agregue 500 μL de una solución que contenga tripsina precalentada (precalentada a 37 °C en un baño de perlas de metal) para separar las células del pozo. Balancee suavemente (hacia adelante y hacia atrás, de izquierda a derecha) e incube durante 2 min en una incubadora de 37 °C.
  4. Mueva la placa de la incubadora al BSC. Mientras se inclina, aspire la solución que contiene tripsina y disperse con cuidado y lentamente sobre el pozo varias veces hasta que las células se desprendan por completo. Sostenga la placa contra la luz y asegúrese de que no queden células en la parte inferior.
  5. Transfiera esta suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 ml. Centrifugar a 300 x g durante 8 min a 4 °C.
  6. Retire el sobrenadante y resuspenda cuidadosamente el pellet celular agregando 600 μL (100 μL por pocillo para 6 pocillos / fundas) de medio de crecimiento precalentado (complementado con EGF; 1: 1000). y pipetear hacia arriba y hacia abajo ~ 30-40 veces.
    NOTA: Las células se pueden congelar en este momento a -80 °C o en nitrógeno líquido y descongelar siguiendo los protocolos estándar para descongelar líneas celulares. Si las células se congelan, no se resuspendirán en medio suplementado con EGF (medio de crecimiento). Se resuspendirán en medio básico (sin EGF) y solución de congelación (relación 1/1). Los pasos 6.1.1 a 6.6.2 describen los pasos para congelar las células. Si no hay celdas congeladas, continúe con el paso 6.7.
    1. Preparar la solución de congelación mezclando 100 μL de DMSO y 400 μL de FBS (volumen total de 500 μL por pocillo/muestra).
    2. Resuspend el pellet celular en 500 μL de medio de crecimiento precalentado. Añadir la suspensión celular a 500 μL de solución de congelación DMSO/FBS (volumen total de 1 ml). Mantenga los tubos en hielo hasta que se procesen todas las muestras. Congelar las células a -20 °C durante 1 h y, a continuación, conservar a -80 °C.
  7. Células de semilla colocando 100 μL de la suspensión de células/medios de 600 μL (paso 6.6) en el centro de seis fundas recubiertas (ver paso 5) de la placa de 24 pocillos. Coloque la placa con cuidado en la incubadora y deje que las células se asienten.
    NOTA: 100 μL de la suspensión celular de 600 μL (cosechada de un pocillo de una placa de 12 pocillos) dará como resultado una confluencia celular del 90%-100%, que se requiere para la transfección.
  8. Compruebe las celdas después de 3 h para ver si se han asentado en el cubrehojas. Añadir 400 μL de medio de crecimiento suplementado con EGF.
    NOTA: Las células generalmente están listas para la transfección al día siguiente (Figura 3G). Si no son confluentes (90%-100%), déjalos para otro día. Si aún no son confluentes, no los use para la transfección. Si se realizan otras aplicaciones aguas abajo, como el perfil de miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR o western blot, las células deben pasarse a placas de 12 pocillos (proporción 1: 1; no se requiere tratamiento de placas) y cosecharse para la extracción de ARN / proteína.

7. Transfección

NOTA: La fase de transfección consiste en una fase de 3 h solo en medio de transfección (los procedimientos de transfección se describen en el manual de transfección que viene con el reactivo de transfección) y una fase alargada en la que el reactivo de transfección y los miRNAs todavía están presentes, pero se agrega un medio neuronal con los suplementos requeridos (la duración total es de 2 días; Figura 1B). En este protocolo se transfectarán seis pozos: tres pozos recibirán el miRNA miR-25 de reprogramación y tres pozos recibirán el miRNA de control.

  1. Compruebe si las células alcanzaron el 90% de confluencia y registre/obtenga una imagen de las células antes de la transfección.
  2. Retire el medio de crecimiento y agregue 500 μL de HBSS (temperatura ambiente) para lavar las células.
  3. Retire el HBSS y agregue 400 μL de medio sérico reducido utilizado para las transfecciones. Vuelva a colocar la placa en una incubadora de 37 °C.
  4. Prepare la mezcla de transfección siguiendo las instrucciones del protocolo de reactivo de transfección del fabricante. Haga dos mezclas: mezcla de reactivos de transfección y mezcla de miRNA (ver Figura 1B para ilustración).
    1. Preparar la mezcla de reactivos de transfección: Para una placa de 24 pocillos, se requieren 49 μL de medio sérico reducido y 1 μL de reactivo de transfección para un pocillo (50 μL en total). Para seis pocillos, 294 μL de medio sérico reducido y 6 μL de reactivo de transfección se combinan y mezclan bien mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo.
    2. Preparar la mezcla mímica de miRNA: Para una placa de 24 pocillos, se requiere un volumen total de 50 μL de la mezcla mímica para un pozo. Tres pozos recibirán el miRNA de control y los otros tres pozos serán tratados con miR-25. Para este protocolo, se utiliza una concentración final de 200 nM.
      1. Para el tratamiento con miR-25 (tres pocillos), se combinan y mezclan bien 150 μL de medio sérico reducido y 3 μL de imitadores de miR-25 (solución madre de 100 μM) y se mezclan bien mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5 min.
        Para el tratamiento de imitadores de control (tres pocillos), 150 μL de medio sérico reducido y 3 μL de imitadores de miARN de control (solución madre de 100 μM) se combinan y mezclan bien canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5 min.
        NOTA: El volumen de imitadores de miRNA depende del factor de dilución y la concentración necesaria (20-500 nM). También se pueden usar inhibidores de miRNA (antagomiRs) u otras moléculas, incluidos los plásmidos. Además, las combinaciones de moléculas son posibles de ser transfectadas.
  5. Combine la mezcla imitadora de miRNA y la mezcla de reactivos de transfección. Mezclar con cuidado pipeteando lenta y completamente mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente (según las instrucciones del fabricante).
  6. Agregue la mezcla de transfección anterior gota a gota y lentamente sobre las células, cerca de la superficie del medio en el pozo utilizando una pipeta de 20 μL. Balancee el plato suavemente (hacia adelante y hacia atrás, de izquierda a derecha).
  7. Incubar en una incubadora de 37 °C durante 3 h.
  8. Después de 3 h, agregue medio neuronal a los pocillos (500 μL por pozo) suplementado con 4-hidroxitamoxifeno (stock de 5 mM reconstituido con 2,58 mL de etanol, concentración final de 250 nM) para activar la recombinasa cre y 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU, solución madre de 10 mM reconstituida con 2 ml de DMSO, concentración final de 1 μM) para rastrear la proliferación celular.
    PRECAUCIÓN: Se sabe que el 4-hidroxitamoxifeno y la EdU son carcinógenos humanos, teratógenos y mutágenos. Lea la hoja de datos de seguridad del material antes de usar y use guantes, gafas y bata de laboratorio. Reconstituya ambos reactivos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. No inhale la sustancia/mezcla. Cierre hermético después de su uso. El material de desecho debe eliminarse siguiendo las regulaciones nacionales y locales. Lávese las manos y la cara después de trabajar con la sustancia.
  9. Incubar en una incubadora de 37 °C durante 2 días (Figura 1B).

8. Conversión de celdas

NOTA: La fase de conversión celular tiene una duración de aproximadamente 5-6 días (Figura 1B), pero son posibles períodos más largos.

  1. Revise las células diariamente para detectar la inducción exitosa de la expresión de tdTomato, la posible muerte celular y / o la contaminación. La densidad celular no cambia (Figura 4). Las primeras células rojas marcadas con fluorescentes débiles se pueden observar 1 día después del tratamiento con 4-hidroxitamoxifeno. Se requiere un microscopio fluorescente para monitorear y obtener imágenes de las células.
    NOTA: En este estudio, se utiliza un microscopio de fluorescencia para imágenes en vivo. Las imágenes se toman con objetivos de 4x, 10x o 20x.
  2. Dos días después de la transfección, retire el medio y agregue 500 μL de medio neuronal precalentado suplementado con 4-hidroxitamoxifeno y EdU en cada pozo.
  3. Reemplace el medio con un medio fresco cada dos días hasta que se recolecten las células.
  4. Tome imágenes en vivo para la evaluación y evaluación del número de células fluorescentes rojas (que expresan Ascl1) y sus cambios morfológicos (Figura 4 y Figura 5A-C).

9. Cosecha celular: fijación para el etiquetado inmunofluorescente

NOTA: Las células se pueden cosechar para otras aplicaciones posteriores, incluidas las de carga masiva o scRNA-Seq, RT-qPCR o western blot.

  1. Retire el medio y agregue 500 μL de HBSS frío (4 °C) por pozo y balancee la placa suavemente (hacia adelante y hacia atrás, de izquierda a derecha). Elimine el HBSS.
  2. Fije las células agregando 500 μL de paraformaldehído al 2% (PFA) e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
  3. Realizar el etiquetado inmunofluorescente según los protocolos establecidos.

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Representative Results

Este protocolo describe cómo cultivar MG a partir de retinas de ratón P12 y cómo reprogramar estas células con miR-25 en neuronas retinianas utilizando el ratón reportero Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Este método fue utilizado en trabajos previos reportando en detalle otros miRNAs adecuados (imitadores o inhibidores, como moléculas individuales o en combinación) para reprogramar MG en RPC que luego adoptan características celulares neuronales27. Este método ha sido modificado para cultivar cultivos más rápido y así minimizar las alteraciones celulares causadas por el medio artificial a lo largo del tiempo 24,28,29.

Fase de disociación y crecimiento retiniano de cultivos primarios de MG
El primer MG se puede detectar desde el primer día in vitro utilizando un microscopio de luz. Los MG tienen una forma tubular alargada y cuerpos celulares de color gris claro (Figura 3A-D, puntas de flecha rojas). La mayoría de ellos están, sin embargo, cubiertos por desechos celulares en estas primeras etapas. La MG de dos retinas de un ratón, cultivada en un pocillo de una placa de 12 pocillos, alcanza una confluencia del 90%-95% en 4-5 días (Figura 3E, F). Con el tiempo, todos los desechos neuronales se limpiarán y una capa celular densa estará presente. Las células no están listas para el paso si el fondo del pozo no es completamente confluente. Sin embargo, el paso no debe hacerse después de 6 días in vitro, ya que la glía pierde sus características gliales en el cultivo con el tiempo. Antes de la transfección o cualquier otro tratamiento, las células deben ser revisadas para determinar su densidad y vitalidad. La transfección solo debe realizarse en células confluentes del 90% al 95% (Figura 3G). Para el etiquetado inmunofluorescente y el análisis de microscopía confocal, las células deben sembrarse en fundas recubiertas.

Fase temprana y tardía del período de conversión celular
Tan pronto como 15 h después de la transfección y el tratamiento con 4-hidroxitamoxifeno, las primeras células comienzan a expresar fluorescencia roja débil, es decir, la proteína fluorescente roja tdTomato impulsada bajo el promotor Ascl1 (activado). Las células que expresan Ascl1 ahora se conocen como células Ascl1-Tom +. Se puede observar una expresión más robusta de Ascl1-Tom 2 días después de la transfección con un aumento de la fluorescencia roja con el tiempo (Figura 4). El efecto de reprogramación se hace visible alrededor de 2 días en cultivo con muchas células Ascl1-Tom+ por campo encontrado en el tratamiento de reprogramación de miRNA: se muestra aquí para control-miR y miR-25 (Figura 4B-B''' y Figura 4C-C''', respectivamente). En ambos tratamientos, las células Ascl1-Tom+ siguen siendo bastante redondas y relativamente grandes, con una morfología más parecida a la glía/célula progenitora. Además, la inducción del fluorescente rojo no influye en la densidad celular del cultivo (todavía 90%-95% confluente).

De tres a cinco días después de la transfección (Figura 4A y Figura 5A), el aumento en el número de células Ascl1-Tom+ se hace más evidente en los pocillos tratados con miR-25 (Figura 5B-D) mostrando un aumento de cuatro veces en el número después de los tratamientos con miR-25 en comparación con los controles. Además, los primeros cambios morfológicos se hacen visibles. Estos cambios incluyen la reducción del tamaño del soma celular y el desarrollo de procesos finos. Mientras que en condiciones de control la gran mayoría de las células son grandes y planas (glial/progenitor-like, Figura-5B-B''), muchas células con núcleos pequeños y varios procesos pequeños que se asemejan a las neuronas retinianas aparecen en el tratamiento miR-25 (Figura-5C-C''). Estas células neuronales representan aproximadamente el 70% de la población total de Ascl1-Tom (15% en tratamiento de control; Figura 5E). Las células son menos densas debido a la conversión celular (las células más pequeñas requieren menos espacio). Curiosamente, estas células neuronales incluso parecen formar pequeñas redes (Figura 5C''). En este momento, las células se pueden cosechar para el etiquetado inmunofluorescente para confirmar la identidad neuronal.

Confirmación de la identidad neuronal
Las células están marcadas con anticuerpos contra la proteína 2 asociada a microtúbulos (Map2), un marcador para las proteínas citoesqueléticas específicas de la neurona 30,31, y contra Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) para validar la identidad neuronal 32,33. Ambos marcadores también fueron utilizados en estudios previos de reprogramación21,27. Otx2 es un factor de transcripción que se encuentra enRPC 34,35,36, células bipolares maduras 34,35,37,38,39 y fotorreceptores 35,36,37,38,40 . El etiquetado nuclear DAPI se utiliza para contrarrestar los cultivos. El etiquetado inmunofluorescente muestra poca o ninguna expresión de Map2 u Otx2 en condiciones de control (Figura 6A-A''', C). Las muestras tratadas con miR-25, sin embargo, tienen muchas células Map2+ y Otx2+ (Figura 6B-B'''). La cuantificación de las imágenes confocales muestra que después de la sobreexpresión de miR-25, alrededor de 40 células neuronales por campo están presentes en comparación con cinco células neuronales por campo en los controles (Figura 6C, tamaño del campo: 630 μm x 630 μm). Las imágenes fueron tomadas con un objetivo 20x. Estas células neuronales constituyen aproximadamente el 70% de la población total de células Ascl1-Tom+ de las muestras tratadas con miR-25 (control ~ 20%, Figura 6D). Todas las células neuronales ascl1-Tom+ fueron Map2+ y Otx2+, confirmando la identidad neuronal. Además, el número absoluto de células Otx2+ y Map2+ fue mayor después de los tratamientos con miR-25 en comparación con el tratamiento con miRNA de control (miR-25: 60 células por campo; control-miR: 10 células por campo; Figura 6E).

En conjunto, los resultados demuestran que los cultivos de MG se pueden cultivar y reprogramar con miRNAs. La suplementación con miR-25 induce la expresión de Ascl1-Tom en la MG primaria. Muchos MG se convierten en RPC que adoptan una morfología neuronal y expresan los marcadores neuronales Map2 y Otx2 después de unos días.

Figure 1
Figura 1: Diseño experimental y curso temporal de un cultivo primario de glía de Müller. (A) Esquema del ratón Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl, un ratón reportero progenitor retiniano utilizado para rastrear la conversión de la glía de Müller (MG) en células progenitoras de la retina (RPC). (B) Curso temporal de los períodos de cultivo que consisten en fase de crecimiento (azul, 0-4/5 días in vitro, div), fase de transfección (púrpura, 5/6-7/8 div) y fase de conversión de MG (amarillo, comienza 7/8 div). Fase de crecimiento: las retinas disociadas (dos retinas de un ratón) se cultivan en un pocillo de una placa de 12 pocillos en un medio de crecimiento. Alrededor del día 4/6, las células se pasan a una placa de 24 pocillos que contiene hojas de cubierta recubiertas. Fase de transfección: 5-7 células div (1 día después del paso) se transfectan con miRNAs durante 2 días en medio de transfección. La cre recombinasa se activa con 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). La proliferación celular se rastrea con EdU. La fase de conversión de MG comienza 1 día después de la transfección. Las células ahora se cultivan en el medio neuronal hasta la cosecha (6-7 días después de las transfecciones, dpTF). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Disociación y genotipado de la retina. (A) Copa del ojo con córnea, cristalino, iris y vítreo eliminados. (B) Retinas aisladas; Las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) se eliminan después de un lavado a fondo. (C) Placa de 12 pocillos con retinas disociadas (dos retinas por pozo). (D) Recorte de un ejemplo de imagen de gel de genotipado. El genotipado es necesario para identificar a los ratones que tienen expresión de Recombinasa Cre impulsada por Ascl1 y se utilizará para rastrear la conversión celular. Barras de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Glía de Müller primaria durante la fase de crecimiento. (A) Curso temporal de los períodos de cultivo durante la fase de crecimiento (0-4/5 días in vitro (div)) resaltado en azul. (B-G) Imágenes en vivo (fase) de la glía de Müller (MG) durante la fase de crecimiento después de 1 div (B), 2 div después del cambio medio (C), 3 div (D), 4 div antes del paso (E, F) y 5 div, 1 día después del paso y antes de la transfección (G). Los cuerpos celulares MG están indicados por puntas de flecha rojas. Después de 3 div, los cultivos son 60%-80% confluentes (D), después de 4-5 div, los cultivos son 90%-100% confluentes y listos para ser pasados (E-F). Después del paso en los cubrehojas, los cultivos celulares deben ser 80% -90% confluentes para la transfección posterior (G). Barras de escala: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Primeras etapas en la fase de conversión de la glía de Müller. (A) Curso temporal de los períodos de cultivo durante la fase de conversión resaltados en amarillo (comienza 7/8 días in vitro (div)). El punto temporal de análisis que se muestra en esta figura está indicado por la estrella roja: 7 div, 2 días después de la transfección (dpTF). (B-C''') Imágenes en vivo de cultivos de glía de Müller (MG) en fase y fluorescencia roja, fluorescencia roja combinada o simple. La fluorescencia roja visualiza Ascl1 expresando MG (tdTomato+, abreviado Ascl1-Tom), 2 días después de la transfección con imitadores de miRNA de control (control-miR, B-B''') o imitadores de miR-25 (C-C'''). Las áreas en B/B' y C/C' se muestran en mayor aumento en B''/B''', C''/C'''. Barras de escala 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Etapas finales en la fase de conversión de la glía de Müller. (A) Curso temporal de los períodos de cultivo durante la fase de conversión resaltados en amarillo (comienza 7/8 días in vitro (div)). El punto de tiempo de análisis que se muestra en esta figura está indicado por la estrella roja: 10 div, 5 días después de la transfección (dpTF). (B-C'') Imágenes en vivo de cultivos de glía de Müller (MG) en fase y fluorescencia roja, fluorescencia roja combinada o simple. La fluorescencia roja visualiza Ascl1 expresando MG (tdTomato+, abreviado Ascl1-Tom), 5 días después de la transfección (pTF) con imitadores de miRNA de control (control-miR, B-B'') o imitadores de miR-25 (C-C''). Los recuadros en B'/C' se muestran en mayor aumento en B''/C'', respectivamente. (D) El número absoluto de células Ascl1-Tomate+ por campo (10x; 1440 μm x 1080 μm) después del tratamiento con miRNA control o miR-25, 2 y 5 días después de la transfección (dpTF; n = 1, se cuentan cinco imágenes por pozo; media ± S.D.). (E) Porcentaje de células ascl1-tomate+ de tipo neuronal del total de células Ascl1-Tomate+ por campo (10x; 1440 μm x 1080 μm) después del tratamiento con miRNA control o miR-25, 5 días después de la transfección (5dpTF, n = 1, media ± S.D.). Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Confirmación de la identidad neuronal de las células reprogramadas. (A-A'''; B-B''') Marcado inmunofluorescente de cultivos primarios de Müller glia (MG) de ratón 5 días después de la transfección tratados con imitadores de miRNA de control (control-miR, A-A''') o imitadores de miR-25 (B-B'''). Las células se fijaron con paraformaldehído al 2% (PFA) y se incubaron con anticuerpos contra RFP para etiquetar tdTomato, Map2 y Otx2 para etiquetar las neuronas. El etiquetado nuclear DAPI (azul) se utilizó para teñir todos los núcleos celulares. (C-E) Cuantificación (n = 1; se cuentan cinco imágenes por coverslip; media ± S.D.) del número absoluto de celdas Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ por campo (C), porcentaje de celdas Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ del total de celdas Ascl1-Tom+ (D), y el número absoluto de celdas Otx2+Map2+ por campo (E). Los resultados muestran un mayor número de neuronas en el tratamiento con miR-25 en comparación con los controles. Tamaño del campo: 630 μm x 630 μm. Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Muerte celular y contaminación bacteriana. (A-A'') Imágenes en vivo de cultivos de Müller glia (MG) 3 div contaminados con bacterias. El recuadro 1 en A se muestra en mayor aumento en A' y muestra glía atrófica y muerta. El recuadro 2 en A se muestra en A'' con glía viva. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este protocolo describe cómo cultivar MG a partir de retinas de ratón disociadas para estudios de reprogramación utilizando miRNAs. Como se muestra y confirma en una variedad de estudios previos, la gran mayoría (80%-90%) de las células encontradas en estos cultivos son MG 20,23,24. Este método es una técnica muy robusta y fiable y los resultados se pueden reproducir fácilmente si se sigue correctamente el protocolo21,27. El crecimiento exitoso y la eficiencia de reprogramación de la cultura, sin embargo, dependen de una variedad de factores.

En primer lugar, la edad del ratón juega un papel importante en el crecimiento celular exitoso. Por lo tanto, si los cultivos de MG se cultivan a partir de ratones de tipo salvaje o ratones transgénicos que se asemejan a tipos silvestres como los ratones reporteros, la última edad para cultivar monocapas de MG confluentes es P12. En P12, todas las neuronas de la retina y la MG se diferencian, y ya no hay RPC presentes en la retina. Las MG expresan marcadores maduros de MG como la glutamina sintetasa o el transportador de aspartato de glutamato (GLAST)20,23,41,42. La MG P12 cultivada aún puede volver a entrar en el ciclo celular cuando se expone a EGF, pero el número de ciclos es limitado, aunque lo suficiente como para formar capas celulares confluentes in vitro. Sin embargo, puede ocurrir que incluso P12 MG no crezca bien porque el EGF o los componentes en el medio pueden degradarse. La disociación incompleta (trozos) también puede resultar en un crecimiento menor o retardado de mg. Una causa importante de disociación incompleta es la inactivación de la DNasa que utilicé para la disociación retiniana mediante el manejo severo de la enzima (pipeteo rápido, vórtice, etc.). Incluso si las células crecen bien hasta el paso, las células pueden ser menos confluentes después del paso. Las razones de esto pueden ser el manejo severo durante el proceso de paso que conduce a un aumento de la muerte celular o porque las células se sembraron demasiado escasamente. Dado que la glía no crece mucho, las células deben estar chapadas en la misma proporción que las cultivadas, no diluidas (contrariamente a los procedimientos de pasaje de líneas celulares inmortalizadas). Cabe destacar que, debido a que los cultivos de MG crecen desde el centro hasta la periferia de un pozo, siempre se encontrarán densidades celulares más altas en el centro. Por lo tanto, es imperativo verificar los márgenes de cada pozo antes del paso para asegurarse de que todo el pozo esté cubierto por células. Las mediciones de la concentración celular deben realizarse para garantizar el procesamiento de cantidades suficientes de células.

Además, los cultivos primarios obtenidos de ratones con P6 o menos no contendrán ningún MG, ya que los MG están a punto de madurar en este punto de tiempo. Esto se demostró a través del análisis de ARN-sequnicelular 43. El etiquetado inmunofluorescente con marcadores maduros de MG a esta edad también confirmará esto. La fracción de RPC es, sin embargo, sustancial en P6. Por lo tanto, los resultados deben interpretarse cuidadosamente. Además, marcadores como los marcadores de filamento intermedio vimentina y nestina no son apropiados para identificar la MG primaria, ya que estos marcadores también se expresan en astrocitos 44,45,46, microglia 47,48, células endoteliales y pericitos 49,50,51,52 , y no son específicos de MG. La GFAP, expresada en astrocitos de retina pero no en MG de retinas no dañadas, no es un buen marcador de MG cultivada. Aunque está regulado al alza en la MG disociada debido al daño mecánico durante la disociación, se regula a la baja después de 3 días en cultivo28.

Dado que la MG comparte muchos marcadores RPC, el procedimiento más seguro para garantizar un cultivo robusto de MG es usar ratones en P12 o ratones más viejos. Aunque este protocolo describe cultivos obtenidos a partir de MG de ratón P12, la MG de ratón adulto puede ser cultivada y reprogramada27. Sin embargo, es necesario enchapar más tejido por pozo (de cuatro a seis retinas). Esto se debe a que la glía adulta no se divide mucho, incluso si se expone al EGF y al 10% de suero. La reducción de los contactos celulares conducirá a la muerte celular y la degeneración celular (células estiradas, células agrandadas). La glía adulta es una gran herramienta para los paradigmas de co-cultivo18 y la densidad celular puede no importar tanto en estas aplicaciones. Sin embargo, para aplicaciones posteriores, como la transfección o la transducción, las capas celulares confluentes son un requisito.

Además del deterioro del crecimiento, puede ocurrir la muerte celular. Si la muerte celular ocurre sin signos evidentes, se debe considerar la contaminación por micoplasma (tamaño de micoplasma 0.1-0.3 μm) y se debe usar un kit de detección de micoplasma. Mantener cada muestra separada (no agrupar muestras) también puede reducir el riesgo de contaminación cruzada. Sin embargo, las bacterias más grandes también pueden ser transferidas del animal y pueden causar contaminación a pesar de que todo el trabajo se realiza en un ambiente limpio y estéril. Se recomienda sumergir el globo ocular brevemente en etanol al 70% y lavar a fondo en una placa de Petri adicional de 10 cm antes de diseccionar el ojo. Para lograr una cultura exitosa, es imperativo trabajar en condiciones estériles, ya que la contaminación puede ocurrir rápidamente. Una vez que se encuentran bacterias, levaduras o moho / hongos en un plato, incluso si no todos los pozos se ven afectados, el cultivo se pierde. Las contaminaciones causarán la muerte celular (Figura suplementaria 1) y afectarán a las células, lo que dará lugar a datos no representativos.

La muerte celular también puede ser causada por reactivos necesarios para aplicaciones posteriores como Poly-O (o Poly-D-Lysine) utilizados para recubrir los cubrecubiertos. Estas sustancias son tóxicas y se requieren lavados minuciosos antes de usar Laminin. Los cubrebocas deben adherirse al fondo del pozo, no flotar dentro de un pozo. Las burbujas de aire deben evitarse. Además, el recubrimiento completo con laminina es crucial para garantizar la adhesión celular a la cubierta. La falta de laminina también conducirá a una menor densidad celular y / o muerte celular.

Para la identificación de la verdadera glía reprogramada, se deben utilizar ratones reporteros y marcadores de proliferación celular que permitan el seguimiento celular, como EdU o BrdU. Dado que las retinas enteras están chapadas, los sobrevivientes neuronales están presentes en todas las culturas. Sin embargo, se eliminan casi por completo después del paso en la mayoría de los casos. Sin embargo, el etiquetado de EdU (o BrdU) debe realizarse para validar que las neuronas se originaron a partir de MG / RPC en proliferación y no son sobrevivientes neuronales (post-mitóticos). El pequeño número de neuronas que se encuentran en los controles utilizados aquí son sobrevivientes neuronales.

Curiosamente, algunas células Ascl1-Tom+ también están presentes en el tratamiento de control con un número ligeramente mayor con el tiempo. Estas células podrían ser algunas bastante inmaduras MG expresan Ascl1 cuando se aíslan y cultivan. La fracción de esta población celular ascl1-Tom+ es, sin embargo, pequeña. Además, la mayoría de estas células Ascl1-Tom+ que se encuentran en el tratamiento de control no expresan Otx2 y / o Map2 y mantienen una forma de célula bastante plana. Ninguna diferenciación neuronal parece ocurrir bajo condiciones de control. Las células neuronales muy delicadas que parecen formar redes solo se encuentran después del tratamiento con miR-25.

El protocolo aquí descrito se utilizó en estudios previos para probar miRNAs para la reprogramación de MG21,27 y se ha modificado ligeramente en los últimos años con respecto a las placas de pozo para cultivar la glía. Ahora se cultivan en placas de 12 pocillos, en lugar de placas de 6 pocillos. Las monocapas confluentes se pueden obtener en placas de 12 pocillos después de 4/5 días (frente a 6/8 días con placas de 6 pocillos) y, por lo tanto, se reduce el período de cultivo general que conduce a la alteración/degeneración celular. La ventana de tiempo de transfección también es alargada. Los protocolos de transfección regulares tienen una duración de transfección de 3 h después de lo cual se debe realizar un cambio completo de medio para garantizar la supervivencia celular. Todas las moléculas se eliminan después de este cambio de medio. En el protocolo actual, la ventana de tiempo se extendió y se permitió una exposición más prolongada a los miRNAs agregando un medio neuronal del 50% (complementado con los factores requeridos para la inducción de Cre y el seguimiento de la proliferación celular) al medio reactivo de transfección. Las células estaban sanas y no se encontraron problemas con esta modificación. Parece que los resultados de la transfección son mejores con el tiempo de transfección alargado, pero se requieren más datos para confirmar esa observación.

Además, aquí se describen todos los pasos necesarios para que el etiquetado inmunofluorescente realice la microscopía de barrido láser confocal. Por lo tanto, el MG debe pasarse sobre cubiertas de vidrio. Dado que los cubrecolchas son más pequeños que el área de una placa de 24 pocillos, solo alrededor de un tercio de las células que cubrirían un pozo completo de una placa de 24 pocillos encajan en el la cubierta recubierta. Para otras aplicaciones como qPCR, RNA-Seq o western blots, las células se pasan en una proporción de 1: 1, se tratan y se cosechan en el punto de tiempo deseado.

Como se mencionó anteriormente, este sistema de cultivo también se puede utilizar para otras aplicaciones, por ejemplo, para estudiar el comportamiento glial, incluidos los mecanismos neuroprotectores, la gliosis y / o para perfilar ARNm, miARN o proteínas de glía cultivada similar a los estudios que utilizaron paradigmas de cultivo o especies ligeramente diferentes 11,28,29,54 . Estas aplicaciones no requerirían un medio neuronal para garantizar la supervivencia neuronal después de la reprogramación, ni la adición de EdU para visualizar la proliferación celular. En su lugar, se debe usar un medio de bajo sero sin suplementos neuronales.

Aunque este método es robusto y confiable, similar a todos los sistemas de cultivo primario tiene limitaciones; Estos son la vida útil limitada de las células, la degeneración celular progresiva a lo largo del tiempo28 y el hecho de que es un sistema de cultivo artificial de 2 dimensiones que no puede imitar el contexto fisiológico con respecto a otros tipos de células de la retina y la matriz extracelular. Por lo tanto, después de identificar los mejores candidatos y sus concentraciones más eficientes en cultivos primarios de MG, se deben realizar cultivos de explante de retina, un sistema de cultivo de 3 dimensiones que se asemeja al tejido de la retina. Los cultivos de explantes también tienen períodos de cultivo limitados y las células en los explantes también se degeneran con el tiempo. Sin embargo, permiten el estudio de la MG en su entorno natural de 3 dimensiones y se pueden realizar a diversas edades reflejando la etapa de desarrollo del animal 23,32,55,56.

En conjunto, este estudio informa sobre cultivos de MG utilizados para monitorear el potencial del RPC miRNA miR-25 para reprogramar MG en células similares a las neuronales, validados por el etiquetado inmunofluorescente. Este protocolo fue utilizado en los trabajos anteriores 21,24,27 y es un método in vitro actual para estudiar el potencial regenerativo de la MG. En general, los cultivos primarios de MG son una técnica robusta y permiten resultados reproducibles20,21. Aunque la sobreexpresión de miRNA para la reprogramación de MG se describe aquí exclusivamente, otros factores como moléculas pequeñas, ADN (ya sea plásmidos o empaquetados en vectores virales), anticuerpos para la inhibición de proteínas32 o compuestos específicos se pueden usar / probar en cultivos primarios de MG. También hay un amplio espectro de aplicaciones aguas abajo, incluyendo miRNA profiling24, scRNA-seq27, RT-qPCR20,21 o western blots20. Además, los cultivos primarios de MG permiten la observación y vigilancia diaria de las células. Esto puede ser una ventaja sustancial para determinar los puntos de tiempo, por ejemplo, para el inicio, la duración y / o el final de una determinada reacción o respuesta celular. El comportamiento migratorio o proliferativo, así como los paradigmas relacionados con lesiones/daño celular (por ejemplo, la deleción global de miRNA en cultivos de MG)32 pueden estudiarse y analizarse en cultivos primarios de MG para identificar mecanismos y vías subyacentes. Por lo tanto, los cultivos de MG son una herramienta muy poderosa para estudiar la MG a nivel molecular y celular antes de la implementación en sistemas in vivo.

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Disclosures

La Universidad de Washington ha solicitado una patente que incluye algunos de los hallazgos de este informe con los inventores Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl y Thomas A. Reh. La patente se titula "Métodos y composiciones para estimular la regeneración de la retina.

Acknowledgments

Los autores agradecen a la Dra. Ann Beaton y a todos los miembros del laboratorio por su aporte sobre el manuscrito. Tom Reh, Julia Pollak y Russ Taylor por presentar los cultivos primarios de MG como una herramienta de detección a S.G.W. durante la capacitación postdoctoral en la Universidad de Washington en Seattle. El estudio fue financiado por la subvención del Programa de Innovación Empire (EIP) a S.G.W. y fondos de puesta en marcha de SUNY Optometry a S.G.W., así como el premio R01EY032532 del National Eye Institute (NEI) a S.G.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J Jax laboratories #012882 Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J Jax laboratories #007914 Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer Sigma-Aldrich H7904-5MG reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution VWR 100504-782 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-546-152 dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 705-606-147 dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems Fisher Scientific AF1979 dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody Sigma-Aldrich M9942-200UL dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody Antibodies-Online ABIN334653 dilution 1:500
Ascorbic Acid STEMCELL Technologies 72132 reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement Fisher Scientific 17-504-044 frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium STEMCELL Technologies 05790 used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Fisher Scientific C10340 reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP STEMCELL Technologies 73886 reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific MT35010CV frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Fisher Scientific 51-985-034 store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Fisher Scientific 12-605-028 used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS Fisher Scientific 14-025-134 store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural Fisher Scientific 23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
L-Glutamine Fisher Scientific 25-030-081 frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control Horizon CN-001000-01-50 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic Horizon C-310564-05-0050 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement Fisher Scientific 17-502-048 frozen aliquots
Neurobasal Medium Fisher Scientific 21-103-049 used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System Worthington Biochemical LK003153 reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific 20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P4538-50MG reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein R&D Systems 248-BDB-050/CF reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein Fisher Scientific 2028EG200 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein Fisher Scientific 512GF010 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 712-296-150 dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) Fisher Scientific L3000015 store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) Eppendorf 2231300008
Disposable Transfer Pipets Fisher Scientific 13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 Fisher Scientific 08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 Fisher Scientific 08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves Fisher Scientific 19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) Fisher Scientific 22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm Fisher Scientific 09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet Thermo Scientific 1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 Keyence 9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope Vision Scientific VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) VWR 25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium Fine Science Tools 11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium Fine Science Tools 11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R Eppendorf 2231000508
Fine Scissors-sharp Fine Science Tools 14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm World Precision Instruments 14124
Metal bead bath Lab Armor 74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm VWR 82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) Living Systems Instrumentation DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5 World Precision Instruments 501979
Water Jacketed CO2 Incubator VWR 10810-744

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References

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Biología del Desarrollo Número 181
Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN
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Kang, S., Wohl, S. G. Primary Cell… More

Kang, S., Wohl, S. G. Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine Müller Glia after MicroRNA Treatment. J. Vis. Exp. (181), e63651, doi:10.3791/63651 (2022).

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