Summary
マウス網膜から得られたミュラーグリア初代培養物は、マイクロRNA処理後の網膜前駆細胞へのグリア変換を研究するための非常に堅牢で信頼性の高いツールです。単一分子または組み合わせは、 その後のin vivo アプローチの適用前に試験することができる。
Abstract
ミュラーグリア(MG)は、神経網膜における優勢なグリアであり、網膜ニューロンの再生源として機能することができる。魚などの低脊椎動物では、MG駆動の再生が自然に起こります。しかし、哺乳類では、特定の要因による刺激または遺伝的/エピジェネティックな操作が必要です。MGは網膜細胞集団のわずか5%しか含まないので、この細胞集団の研究を排他的に可能にするモデル系が必要である。これらのモデルシステムの1つは、再現性があり、分子/因子のスクリーニングおよび同定、化合物または因子の試験、細胞モニタリング、および/または機能試験を含む様々な用途に使用できる一次MG培養物である。このモデルは、人工miRNAまたはその阻害剤のトランスフェクション を介して マイクロRNA(miRNA)の補充または阻害後に網膜ニューロンに変換するマウスMGの可能性を研究するために使用される。MG特異的レポーターマウスを免疫蛍光標識および単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)と組み合わせて使用することにより、これらの培養物に見られる細胞の80%〜90%がMGであることを確認した。 このモデルを使用して、miRNAがMGを網膜前駆細胞(RPC)に再プログラムし、その後ニューロン様細胞に分化できることが発見された。この技術の利点は、miRNA候補を in vivoアプリケーションで使用する 前に、その効率と結果についてテストできることです。
Introduction
ミュラーグリア(MG)は、神経網膜における優勢なグリアである。それらは、水とイオンの恒常性の維持、ニューロンの栄養補給、組織の保護など、中枢神経系の他の部分の他のグリアと比較して同様の機能を有する。MGにはもう一つの魅力的な特徴があります:成熟したグリアですが、発達後期に網膜前駆細胞(RPC)で発現する多くの遺伝子を発現しています1,2。この類似性は、網膜損傷後の魚網膜における天然に存在するMGベースのニューロン再生の理由であると仮定される3,4。このプロセスの間、MGは細胞周期に再突入し、RPCに脱分化し、その後、6種類の網膜ニューロンすべてに分化する。この現象は魚類では自然に起こるが、哺乳類のMGはニューロン5,6に変換されない。ただし、再プログラムすることはできます。MGをRPC/ニューロンに再プログラムする様々な要因が示されている。これらの因子の中には、魚の再生に関与する基本的なヘリックス・ループ・ヘリックス(bHLH)転写因子アカイテ・スキュートホモログ1(Ascl1)がある7,8。マウスでは、Ascl1は網膜形成中にRPCでのみ発現するが、成熟MGまたは網膜ニューロン9には存在しない。
インビボで細胞を直接リプログラミングすることは、方法論的に難しいだけでなく、施設の動物ケアおよび使用委員会からの承認も必要とします。承認を受けるには、使用または変更された因子、濃度、オフターゲット効果、根底にあるメカニズム、毒性、および効率に関する予備データが必要です。細胞培養システムは、in vivoモデルでの使用前にこれらの基準を試験することを可能にする。さらに、MGは網膜細胞集団10全体の約5%しか占めていないので、MG培養物は、遊走12、13、増殖14、傷害/損傷に対するストレス反応15、16、ミクログリア17または網膜神経節細胞(RGC)などの他の細胞型との相互作用を含む、それらの機能11ならびにそれらの挙動の研究を可能にする18、 またはそれらの神経原性潜在能力19、20、21。多くの研究者は、無限の増殖性を有し、容易に維持およびトランスフェクトすることができるため、不死化細胞株を研究に使用している。しかし、初代細胞は、真の細胞特性(遺伝子およびタンパク質の発現)を有し、さらに重要なことに、それらは発達の特定の段階を表し、したがって「年齢」を有するため、不死化細胞よりも生物学的に関連するアッセイに好ましい。動物の年齢(そしてその結果として動物から得られた細胞の年齢)は、細胞の可塑性が発達段階の進行とともに減少するため、細胞のリプログラミングにおいて特に重要な要素である22。
このプロトコルは、再生を研究するための現在の in vitro 法として、miRNAで原発性MGを再プログラムする方法を詳細に説明しています。このMG初代培養モデルは、P53ノックアウトマウス(trp53-/-マウス)におけるMGの細胞増殖特性を評価するために2012年に設立されました23。培養MGはグリアの特徴(すなわち、免疫蛍光標識 を介して 評価されたS100β、Pax6、およびSox2タンパク質の発現)を維持し、 in vivo MG(FACS精製MGのマイクロアレイ)に類似していることが示された23。その後まもなく、グリアmRNAおよびタンパク質発現が検証され、ウイルスベクター20を用いた別のアプローチで確認された。数年後、MG特異的 Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl レポーターマウス24を用いて、これらの培養物に見られる細胞の大部分がMGであることを確認した。さらに、FACS精製MGおよび培養初代MGの両方におけるmiRNAのセットの定量は、MG miRNA(mGLiomiRs)のレベルが増殖期中の培養MGにおいてあまり変化しないことを示した。しかし、培養期間が細長いと、miRNAが翻訳調節因子であるため、miRNAレベル、ひいてはmRNAレベルおよびタンパク質発現の変化を引き起こす25。
2013年、このMG培養モデルを用いて、MGを網膜ニューロンに再プログラムする能力に関して様々な転写因子を試験した20。Ascl1は非常に堅牢で信頼性の高いリプログラミング因子であることが判明しました。ウイルスベクターを介したAscl1の過剰発現は、形態学的変化、ニューロンマーカーの発現、およびニューロン電気生理学的特性の獲得を誘導した。さらに重要なことに、これらの最初のインビトロ実験から得られた洞察と結果は、インビボアプリケーション22,26に首尾よく転送され、初代MG培養物がインビボ実装前の初期因子スクリーニングおよびグリア特徴の評価のための固体で信頼性の高いツールを表すことを実証した。
数年前、網膜ニューロンでも高発現している脳富化miRNA miR-124が、培養MG21でAscl1発現を誘導できることが示されました。生細胞におけるAscl1発現を、Ascl1レポーターマウス(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)を介して可視化した。レポーターマウスは、DNAにレポーター遺伝子が挿入された遺伝子操作マウスです。このレポーター遺伝子は、本研究における赤色蛍光タンパク質であるtdTomatoであるレポータータンパク質をコードする。このレポータータンパク質は、目的の遺伝子(この場合はAscl1)の発現を報告する。つまり、Ascl1 を発現する細胞は赤色に変わります。Ascl1はRPCs9でのみ発現するため、このAscl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/flマウスは、RPCを発現するAscl1へのMG変換の追跡を可能にし、変換細胞が赤色蛍光tdTomatoレポータータンパク質を発現することを意味する。これらの細胞のDNAが改変されるため、これは不可逆的な標識である。その結果、tdTomato標識が分化細胞に残るため、その後の神経分化は視覚化されます。MG由来RPC(tdTomato標識を有する)を発現するAscl1がニューロンに分化したとしても、これらのニューロンは依然として赤色のラベルを有する。したがって、このマウスは、生細胞イメージングのためのMG由来RPCの標識を可能にするだけでなく、これらのMG由来(赤色)RPCの運命マッピングおよび系統追跡も可能にする。より最近では、RPC中のmiRNAのセットが同定され、Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPCレポーターマウスのMG培養物を用いて、これらのmiRNAがリプログラミング能力および効率に及ぼす影響をスクリーニングおよび試験した27。候補の1つであるRPC-miRNA miR-25は、培養したMGをAscl1発現細胞(Ascl1-Tomato+)にリプログラミングできることを見出した。これらの再プログラムされた細胞は、ニューロンの形態(小さなソマタおよび短いまたは長い微細プロセスのいずれか)、scRNA-Seqを介して測定されたニューロン転写産物の発現、ならびに免疫蛍光標識を介して検証されたニューロンタンパク質の発現を含む、経時的なニューロンの特徴を採用する27。
ここで、プロトコルは、以前の研究21、24、27から適応したP12マウスからMGを増殖およびトランスフェクトする方法を詳述する。このプロトコールのために選択されたのは、前述のmiRNA miR-25であり、RPCにおいて高発現し、MGまたは網膜ニューロンにおいて低い発現レベルを有するmiRNAである。miR−25を過剰発現させるために、マウスmiR−25模倣体、すなわち、人工miRNA分子が使用される。対照として、Caenorhabditis elegansからのmiRNAの模倣物が選択され、哺乳動物細胞では機能を持たない。MGのRPCへの変換の可視化は、RPCレポーターマウス(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)、バックグラウンドが混在するマウス(C57BL/6、S129、およびICR株)を介して達成された。しかしながら、この培養は、野生型株を含むすべてのマウス株を用いて行うことができる。過去数年間で、元のプロトコルは、成長期の持続時間と全体的な培養期間を短縮し、より堅牢なグリア細胞の状態を確保し、長期の培養期間に起こる細胞変性の程度を最小限に抑えるように変更されました。通常のトランスフェクション時間枠も3時間から2日に延長されました。前述のように、現在のプロトコルはMG培養物を再生研究のためのツールとして記述しているが、この方法は初期化因子の試験に有用であるだけでなく、MG遊走性または増殖性挙動、傷害/細胞損傷関連のパラダイム、および/または根底にあるメカニズムおよび経路の同定に関する研究を含む他の用途にも適応させることができる。
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Protocol
動物被験者を含む手順は、SUNY検眼大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:この培養プロトコルは、成長、トランスフェクション、および変換段階の3つの段階で構成されています。タイムラインを含むプロトコル全体の要約を 図 1 に示します。
1. 培地および必要な試薬の調製
メモ:すべての手順は、A2またはB2バイオセーフティキャビネット(BSC)で実行する必要があります。成長期には、上皮成長因子(EGF)を添加した基礎ニューロン培地からなる高血清増殖培地が使用される。変換段階では、ニューロンサプリメントを補充した低血清神経生理学的基礎培地を使用して、ニューロンの分化と生存を確保します。
- 200 mLの基底ニューロン培地に20 mLのウシ胎児血清(FBS、10%)、1 mLの200 mM L-グルタミン(0.5%)、2 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(1%)、および2 mLのN2サプリメント(1%)を添加して、増殖培地(増殖期に使用)を調製します。滅菌ろ過(孔径0.22μmのフィルターユニット)を行います。使用前に培地を37°Cの金属ビーズ浴中で予備温める。
- 無血清神経生理学的基礎培地100 mLに2 mLのB27ニューロンサプリメント(2%)、1 mLのN2サプリメント(1%)、20 μL の100 ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、 終濃度20 ng/mL)、20 μLの100 ng/mLグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF、滅菌ハンクス平衡塩溶液[HBSS]で再構成、最終濃度20 ng/mL)、100 mg/mLのジブチリル-cAMP(DMSOで再構成)500 μL、50 ng/mLアスコルビン酸70 μL(滅菌PBSで再構成)、およびペニシリン/ストレプトマイシン1.5 mL。滅菌ろ過(孔径0.22μmのフィルターユニット)を行います。使用前に37°Cの金属ビーズ浴中で培地を予め温める。
注:これらのメディアは、4°Cで1ヶ月間保存できます。 - パパイン、DNase I、および網膜解離に必要なオボムコイド試薬を製造業者のプロトコールに従って再構成する。滅菌 1.5 mL チューブに 750 μL のパパイン、滅菌 0.6 mL チューブに 75 μL の DNase I、および 2 mL チューブに 750 μL のオボムコイドプロテアーゼ阻害剤をアリコートします。パパインおよびDNase Iアリコートを-20°Cで凍結し、試薬の分解を避けるためにオボムコイドアリコートを4°Cに保ちます。使用直前に室温で解凍してください。
注:パパイン、DNase I、およびオボムコイドは、パパイン解離システムと呼ばれるキットに含まれています( 材料表を参照)。 - データシートの説明書に従って免疫蛍光標識を行う場合、カバースリップコーティング用のポリ-L-オルニチン(Poly-O)およびラミニンを再構成する(Poly-O:滅菌水中0.1mg / mL;ラミニン:1.2mg/mLをDMEM中1:50で希釈する)。ポリ-Oおよびラミニンのアリコート(2.5 mL)をアリコートし、アリコートを-20°Cで凍結する。 使用直前に室温で解凍してください。
メモ: ステップ 1.4.免疫蛍光標識およびレーザー走査顕微鏡検査が行われる場合にのみ必要である。
2. マウスと組織抽出
注:これらのリプログラミング研究のために、Ascl1 CreERT:tdTomato STOPfl/flマウスは、Ascl1 CreERTマウス(Ascl1-CreERT:Jax # 012882)とtdTomato STOPfl/flマウス(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J:Jax # 007914)を交配することによって作成されました。 このマウスは混合バックグラウンド(C57BL/6、S129、およびICR株)を有する。このマウスの遺伝子型を図1Aに示す。すべての株は、このプロトコルに使用することができます。
- 手袋を着用し、解剖顕微鏡とすべての細かい道具(デュモン#5ファインとデュモン#7湾曲した鉗子、細かいはさみ、そしてVannasはさみ)を含むワークスペースを70%エタノールで消毒します。10cmのシリコーンコーティングされた黒い解剖皿をUV光に20分間さらして消毒します。
- 組織抽出のための皿およびプレートの調製
- 眼球採取およびサンプル分離用の24ウェルプレート(1ウェルにマウス1匹あたり2つの目、マウスIDでラベル付け)を1ウェルあたり約1mLの冷たいHBSS(4°C)で準備します。24ウェルプレートを氷の上に置きます。
- 滅菌した10cmのペトリ皿(洗浄用)と消毒シリコーンコーティングされた解剖皿に数mLの冷たいHBSS(4°C)を入れて、組織がHBSSで完全に覆われていることを確認します。
- 1 mLの70%エタノールを含む滅菌1.5 mLチューブを調製する。
- プレートに培養番号、日付、株、および必要なすべての情報でラベルを付けて、12ウェル培養プレートを作製します。
- 承認された方法を用いてP12マウスを安楽死させる。
- 目の取り外し
- マウスの頭を親指と人差し指で目の周りでそっと持ちます。
- デュモン#7湾曲した鉗子を使用して、眼球の後ろに静かに行き、視神経をクリップします。慎重に目を離してください。
メモ:成体マウスを使用する場合は、湾曲した鉗子を使用せず、目を引かないでください。代わりに、細かいはさみを使って目の地球儀の周りを慎重にカットします。視神経を切断するが、目自体を切断しない。鉗子を使用して眼球を慎重に取り除きます。
- 眼球洗浄
- 動物からの細菌の持ち越しを避けるために、眼球をエタノール含有チューブに短時間浸します。
- 氷の上の24ウェルプレートに入れる前に、10cmのペトリ皿で眼球を少し洗ってください。
- もう一方の目に対して手順 2.4 と 2.5 を繰り返します。プロセス中はウェルプレートを氷の上に保管してください。光源付きの解剖顕微鏡の下に置かれた解剖皿に1匹の動物から2つの目を置きます。
- 網膜抽出
- デュモン#5の細かい鉗子で強膜の周りの視神経と周囲の結合組織をつかんで片方の眼球を固定し、解剖皿(角膜上)に慎重に押し付けます。
- 30Gの針を使って角膜の中央に穴を開けて、Vannasはさみに簡単にアクセスできるようにします。
- Vannasはさみを使用して毛様体周辺の角膜を解剖し、デュモン#5の細かい鉗子で角膜、レンズ、虹彩、ガラス質体を慎重に取り除きます。 図2A は、網膜を内側に持つアイカップを示す。
- 視神経に達するまで、Vannasはさみで強膜を解剖します。視神経をクリップし、デュモン#5の細かい鉗子を使用して網膜を慎重に抽出します。
- デュモン#5の細かい鉗子の2番目のペアを使用して網膜に押し付け、硝子体を完全に除去できるようにします。 図2B は、2つの抽出された網膜を示す。
- 移して洗う
- 滅菌移送ピペットの先端を約2.5cm切断して直径を拡大します。この先端を使用して、組織を傷つけることなく網膜全体を拾い上げます(吸い込みます)。
- 網膜を冷たいHBSS(4°C)で新しい滅菌ペトリ皿に移し、皿を揺らします(前後、左、右)。
- 転写ピペットチップを使用して、網膜を慎重に押し回し、網膜色素上皮(RPE)細胞を洗い流します。
注:または、水晶体と硝子体を備えた網膜全体をアイカップから取り外すこともできます。そして、水晶体及び硝子体を、抽出した網膜から除去することができる。網膜が裂けている場合は、解離のためにすべての部分を集めるようにしてください。さもなければ、コンフルエントな細胞層を増殖させるのに十分な量の組織が存在するであろう。
- 直ちに、単離した網膜を、1mLのHBSSで満たされた24ウェルプレートの新しい清潔なウェルに入れます。解剖プロセス中は、24ウェルプレートを氷上に保管してください。
- 手順2.7-2.9を繰り返して、第2の網膜を単離します。
3. 網膜解離
注:以下のすべてのステップ(セルハーベストまで)は、A2またはB2バイオセーフティキャビネット(BSC)で実行する必要があります。
- パパイン/DNase I解離混合物を以下のようにして調製する。
- 6つの網膜について、750 μLのパパインを含むチューブに75 μLのDNase Iを加え(ステップ1.3から)、慎重に混合する(解離混合物)。
- このプロトコールに必要な個々のサンプル調製のために、825 μLの全容量を3つのアリコートに分割します:275 μLの混合物をマウス1匹あたり1本の1.5 mLチューブ(2本の網膜)に入れます。それに応じてDNase Iとパパインの必要量を計算します。
注:パパイン/DNase I混合物の1本のチューブで最大6つの網膜を解離させることができる。しかし、個々のサンプル調製は、組み合わせたサンプルよりも凝集塊が少なく、細胞増殖が良好になります。
- 2つの網膜をパパイン/DNase I解離混合物に移す。先端の直径を拡大したトランスファーピペットを使用し(ステップ2.8.1)、網膜を拾い上げ、網膜が先端の底に落ち着くまで待ってから、過剰なHBSSなしで網膜をパパイン/DNase I混合物を含むチューブに放出する。
- ヌーテーター上に置き、細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)中で10分間インキュベートする。
- 1mLのピペットで上下に慎重にピペッティング(約20〜30回)して細胞を解離させる。細胞が解離した後(すなわち、チャンクのない均質な溶液を生じる)、パパイン解離キットから275μLのオボムコイドプロテアーゼ阻害剤を加えてパパインを中和する。上下にピペッティングしてやさしく混ぜます。
注:825 μLのパパイン/DNase I混合物で6つの網膜が解離した場合、825 μLのオボムコイドが必要です。 - 混合物を300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
- 上皮成長因子(EGF、増殖培地1 mLあたり1 μL、PBS中200 μg/mLで再構成)を、37°Cで予備加温した増殖培地(マウス1匹あたり1 mL)の計算された体積に加える。
注:実験計画に応じて、増殖マーカーである5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)、ならびに4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)またはその他の必要な因子を培養期間の開始時に添加することができる。 - チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。チューブの底にあるペレットに触れないでください。
- 上清を注意深く完全に取り除きます。細胞ペレットを500 μLのEGF添加増殖培地で再懸濁する。
- 細胞懸濁液を標識12ウェルプレートの1ウェルに移す(図2C)。チューブを別の500 μLのEGFサプリメント増殖培地ですすぎ、ウェルに添加します(ウェルあたり1 mLの全容量)。
- 他のすべてのサンプルで手順 3.8 と 3.9 を繰り返します。
- 井戸のプレートを3回慎重に揺らします(前後、左、右)。プレートをインキュベーター(37°C、CO2)に入れる。
注:トランスジェニックマウスを使用する場合は、すべての動物についてジェノタイピングを実行します(図2D)。 Cre リコンビナーゼ陽性および陰性マウスを同定し、それに応じてプレートに標識する。このプロトコールのために、Cre リコンビナーゼ陽性レポーターマウスの細胞のみを次のステップに使用した。Cre 陰性標本の細胞は凍結され、他の用途に使用される。
4. 成長期
注:成長期の期間は約4〜5日です(図1B)。細胞を含むウェルに液体を加えるには、ピペットがウェルの壁を指し、細胞の剥離を避けるために液体をゆっくりと放出する必要があります。細胞の上に直接ピペットを置かないでください。
- 解離の1日後、培地を取り出し、新鮮なEGF添加増殖培地1mLを加える。
- 3日目に、培地を取り出し、1mLのHBSS(室温)を加えて細胞破片を除去した。左右にゆったりと前後に揺らす。HBSSを除去し、洗浄工程を繰り返し、予め加温したEGF添加増殖培地1mLを加える。
- 毎日細胞を監視し、細胞が90%〜100%のコンフルエントに達するまで増殖状態を評価します。 図3は 、経時的な良好なMG成長の例を示す。汚染または細胞死の可能性を確認します(補足図1)。汚染された文化を捨てる。
メモ: セルの状態を監視および記録するには、カメラが取り付けられた光学顕微鏡と、対物レンズ 4 倍、10 倍、または 20 倍を使用して、さまざまな倍率で画像を撮影します。本研究では、蛍光顕微鏡を用いた。
5. ポリ-L-オルニチン(Poly-O)とラミニンコートを使用したカバースリップの準備
注:このステップは、免疫蛍光標識および共焦点レーザー走査顕微鏡検査が実施される場合にのみ必要です。適切なイメージングには、丸いガラスカバースリップ(直径12mm)が必要です。コーティングプロトコルは、ニューロン培地のデータシート( 材料表を参照)にも記載されています。
- 滅菌カバースリップを、滅菌デュモン#2AP鉗子を使用して、24ウェルプレートのすべてのウェルの中央に慎重に置きます。
メモ: カバースリップを井戸の中央に置きます。カバースリップを井戸の壁の近くに配置すると、次の手順で表面張力の問題が発生します。 - 室温で2.5 mLのPoly-Oアリコートを解凍し、各カバースリップの中央に100 μLを置きます。
- ウェルプレートを37°Cのインキュベーター内で30分間インキュベートする。
- Poly-Oを取り出し、カバースリップでウェルを約1mLの滅菌水で3回洗浄します。
- ウェルプレートをBSCで一晩乾燥させます。2.5 mLのラミニンを4°Cで一晩解凍する。
- 翌朝、各カバースリップの中央に100μLのラミニンを加え、37°Cのインキュベーター内で4時間インキュベートする。
- ラミニンを注意深くそして完全に取り除きます。
- 継代がすぐに行えない場合は、プレートを4°Cに保ちます。
注:準備されたプレートのコーティングされたカバースリップは、4°Cで数日間保持することができます。
6. ニューロン生存者を除去するための細胞継代
注:細胞通過は、細胞集団を増加させるためではなく、神経細胞を除去するために必要である。グリアは数回しか分裂せず、通過後にそれ以上成長しません。細胞懸濁液を希釈しないでください。12ウェルプレートの1つのコンフルエントウェルの細胞は、12ウェルプレートの1つのウェルまたは24ウェルプレートの2つのウェルに分配することができる。コーティングされたカバースリップを使用する場合、カバースリップの約3分の1のみがコーティングされます。したがって、コンフルエント細胞(〜80%〜90%)を有する24ウェルプレートに座っている6つのカバーグラスを、12ウェルプレートのコンフルエント細胞の1ウェルから得ることができる。他の比率も同様に選択して、細胞密度を増減させることができる。このプロトコールでは、1匹 のCre+レポーターマウスが使用される[1回の実験、2回の処置:miR-25またはcontrol-miR;技術的複製n=3(処置あたり3つのカバースリップ)、生物学的複製n=1]。技術的および生物学的複製の数は、実験計画に応じて異なる方法で定義することができます。
- 細胞が90%〜100%コンフルエントであるかどうかを確認します(ウェルのマージンでも;図3E,F)。
- 培地を取り出し、1mLのHBSS(室温)を加えて洗浄する。プレートを静かに揺らします(前後、左右)。HBSSを完全に取り外します。
- 予め加温したトリプシン含有溶液(金属ビーズ浴中で37°Cで予め加温)を500μL加え、ウェルから細胞を剥離する。穏やかに(前後、左から右に)揺らし、37°Cのインキュベーター内で2分間インキュベートする。
- プレートをインキュベーターからBSCに移動します。傾けながら、トリプシン含有溶液を吸引し、細胞が完全に剥離するまで数回ウェル上に注意深くゆっくりと分散させる。プレートをライトに当て、下部にセルが残っていないことを確認します。
- この細胞懸濁液を滅菌1.5mLチューブに移す。遠心分離機を300 x g で4°Cで8分間遠心分離する。
- 上清を除去し、予め温めた増殖培地(EGFを添加;1:1000)を600μL(6ウェル/カバースリップで1ウェルあたり100μL)加えて細胞ペレットを慎重に再懸濁する。〜30〜40回上下にピペッティングします。
注:細胞は、この時点で-80°Cまたは液体窒素中で凍結し、細胞株を解凍するための標準プロトコルに従って解凍することができます。細胞が凍結された場合、それらはEGF補充培地(増殖培地)に再懸濁されない。それらは、基本培地(EGFなし)および凍結溶液(1/1比)に再懸濁されるであろう。ステップ 6.1.1 から 6.6.2 では、セルをフリーズするステップについて説明します。フリーズしているセルがない場合は、ステップ 6.7 に進みます。- DMSO100 μLとFBS400 μL(1ウェルあたり500 μL/サンプルの合計容量)を混合して凍結液を調製します。
- 細胞ペレットを500 μLの予め加温した増殖培地に再懸濁する。細胞懸濁液を 500 μL の DMSO/FBS 凍結溶液 (全容量 1 mL) に加えます。すべてのサンプルが処理されるまで、チューブを氷上に保ちます。-20 °C で 1 時間細胞を凍結し、-80 °C で保存します。
- 600 μL の細胞/培地懸濁液 100 μL を 24 ウェルプレートの 6 つのコーティングされたカバーグラス (ステップ 5 を参照) の中央に配置して、細胞をシードします。プレートをインキュベーターに慎重に置き、細胞を沈降させます。
注: 600 μL の細胞懸濁液 100 μL (12 ウェルプレートの 1 ウェルから回収) は、トランスフェクションに必要な 90% ~ 100% の細胞コンフルエンシーをもたらします。 - 3 時間後にセルがカバースリップに落ち着いたかどうかを確認します。EGFを添加した400μLの増殖培地を加える。
注:細胞は通常、翌日にトランスフェクションの準備が整います(図3G)。コンフルエントでない場合(90%-100%)は、別の日に放置してください。それでもコンフルエントでない場合は、トランスフェクションに使用しないでください。miRNA プロファイリング、RNA-Seq、RT-qPCR、ウェスタンブロットなど、他の下流アプリケーションを実施する場合は、細胞を 12 ウェルプレート (1:1 比、プレート処理不要) に継代し、RNA/タンパク質抽出のために回収する必要があります。
7. トランスフェクション
注:トランスフェクションフェーズは、トランスフェクション培地のみの3時間フェーズ(トランスフェクション手順はトランスフェクション試薬に付属のトランスフェクションマニュアルに記載されています)と、トランスフェクション試薬とmiRNAがまだ存在するが、必要なサプリメントを含むニューロン培地が追加される細長いフェーズで構成されています(合計持続時間は2日間です。 図1B)。このプロトコールでは、6つのウェルがトランスフェクトされます:3つのウェルがリプログラミングmiRNA miR-25を受け取り、3つのウェルがコントロールmiRNAを受け取ります。
- 細胞が90%のコンフルエントに達したかどうかを確認し、トランスフェクション前に細胞を記録/画像化します。
- 増殖培地を取り出し、500 μLのHBSS(室温)を加えて細胞を洗浄する。
- HBSSを除去し、トランスフェクションに使用する400μLの還元血清培地を加える。プレートを37°Cのインキュベーターに戻します。
- メーカーのトランスフェクション試薬プロトコールの指示に従ってトランスフェクション混合物を調製します。トランスフェクション試薬ミックスとmiRNAミックスの2つの混合物を作ります(図 1B の図を参照)。
- トランスフェクション試薬混合物の調製: 24 ウェルプレートの場合、1 ウェルに対して 49 μL の還元血清培地と 1 μL のトランスフェクション試薬が必要です (合計 50 μL)。6ウェルについて、294 μLの還元血清培地と6 μLのトランスフェクション試薬を組み合わせ、上下に穏やかにピペッティングしてウェル混合します。
- miRNA 模倣混合物の調製: 24 ウェルプレートの場合、1 つのウェルに対して 50 μL の模倣混合物の全容量が必要です。3つのウェルは対照miRNAを受け取り、他の3つのウェルはmiR-25で処理されます。このプロトコルでは、200nMの最終濃度が使用されます。
- miR-25 処理 (3 ウェル) の場合、150 μL の還元血清培地と 3 μL の miR-25 模倣物 (100 μM ストック溶液) を組み合わせ、上下に穏やかにピペッティングすることによりよく混合します。5分間インキュベートする。
コントロール模倣処理(3ウェル)の場合、150 μLの還元血清培地と3 μLのコントロールmiRNA模倣物(100 μMストック溶液)を組み合わせ、上下に穏やかにピペッティングすることによりよく混合します。5分間インキュベートする。
注:miRNA模倣物の量は、必要な希釈係数および濃度(20〜500nM)に依存する。miRNA阻害剤(antagomiRs)、またはプラスミドを含む他の分子も同様に使用することができる。また、分子の組み合わせもトランスフェクトすることが可能である。
- miR-25 処理 (3 ウェル) の場合、150 μL の還元血清培地と 3 μL の miR-25 模倣物 (100 μM ストック溶液) を組み合わせ、上下に穏やかにピペッティングすることによりよく混合します。5分間インキュベートする。
- miRNA模倣混合物とトランスフェクション試薬混合物を組み合わせる。ゆっくりとピペッティングし、上下に優しくピペッティングして慎重に混ぜます。室温で20分間インキュベートする(製造業者の指示による)。
- 上記のトランスフェクション混合物を細胞の上に滴下し、ゆっくりと加え、20 μLピペットを用いてウェル内の培地表面に近い。プレートを優しく揺らします(前後、左から右へ)。
- 37°Cのインキュベーター内で3時間インキュベートする。
- 3時間後、4-ヒドロキシタモキシフェン(2.58 mLのエタノールで再構成された5 mMストック、250 nM最終濃度)を添加したニューロン培地(ウェルあたり500 μL)を加えてCreリコンビナーゼを活性化し、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU、2 mLのDMSOで再構成された10 mMストック溶液、1 μM最終濃度)細胞増殖を追跡した。
注意:4-ヒドロキシタモキシフェンおよびEdUは、ヒト発癌物質、催奇形物質、および変異原体であることが知られています。使用前に製品安全データシートをお読みになり、手袋、ゴーグル、ラボコートを着用してください。製造業者の推奨に従って両方の試薬を再構成する。物質/混合物を吸い込まないでください。使用後はしっかりと閉じてください。廃棄物は、国および地域の規制に従って処分する必要があります。物質を扱った後、手と顔を洗ってください。 - 37°Cのインキュベーター内で2日間インキュベートする(図1B)。
8. 細胞変換
注:細胞変換フェーズの期間は約5~6日ですが(図1B)、より長い期間が可能です。
- tdTomato発現の誘導、潜在的な細胞死、および/または汚染の成功について、細胞を毎日チェックしてください。セル密度は変化しません(図4)。最初のかすかな赤色蛍光標識細胞は、4-ヒドロキシタモキシフェン処理の1日後に観察することができる。蛍光顕微鏡は、細胞を監視し、画像化するために必要とされます。
注:この研究では、蛍光顕微鏡がライブイメージングに使用されます。画像は、4倍、10倍、または20倍の目標で撮影されます。 - トランスフェクションの2日後、培地を取り出し、各ウェルに4-ヒドロキシタモキシフェンおよびEdUを添加した予め温めたニューロン培地500μLを加える。
- 細胞が回収されるまで、1日おきに培地を新鮮な培地に交換します。
- 赤色蛍光(Ascl1発現)細胞の数とその形態変化(図4および図5A-C)の評価および評価のためにライブ画像を撮影する。
9.細胞回収:免疫蛍光標識のための固定
注: 細胞は、バルクまたは scRNA-Seq、RT-qPCR、またはウェスタンブロットなど、他のダウンストリームアプリケーション用に回収できます。
- 培地を取り出し、1ウェルあたり500μLの冷たいHBSS(4°C)を加え、プレートを穏やかに(前後に、左から右に)揺さぶる。HBSSを取り外します。
- 2%パラホルムアルデヒド(PFA)を500μL加えて細胞を固定し、室温で20分間インキュベートする。
- 確立されたプロトコールに従って免疫蛍光標識を行う。
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Representative Results
このプロトコルは、P12マウス網膜からMGを増殖させる方法と、Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPCレポーターマウスを使用して、miR-25でこれらの細胞を網膜ニューロンに再プログラムする方法を説明しています。この方法は、MGをRPCに再プログラムし、次いでニューロン細胞特性を採用するために、他の適切なmiRNA(模倣物または阻害剤、単一分子として、または組み合わせて)を詳細に報告する以前の研究で使用された27。この方法は、培養物をより速く増殖させ、したがって時間の経過とともに人工環境によって引き起こされる細胞変化を最小限に抑えるように改変されている24、28、29。
初代MG培養物の網膜解離および成長期
最初のMGは、光学顕微鏡を用いて インビトロで 1日目に早くも発見することができる。MGは、管状、細長い形状および明るい灰色の細胞体を有する(図3A−D、赤い矢印)。しかし、それらのほとんどは、これらの初期段階で細胞破片で覆われています。12ウェルプレートの1ウェルで増殖した1匹のマウスの2つの網膜由来のMGは、4〜5日以内に90%〜95%のコンフルエントに達する(図3E、F)。時間が経つにつれて、すべてのニューロン破片が取り除かれ、高密度の細胞層が存在するでしょう。ウェルの底が完全にコンフルエントでない場合、細胞は継代の準備ができていません。しかし、継代は、グリアが時間の経過とともに培養中のグリアの特徴を失うので、 インビトロ で6日より後に行うべきではありません。トランスフェクションまたは他の治療の前に、細胞の密度および活力をチェックする必要があります。トランスフェクションは、90%~95%のコンフルエント細胞に対してのみ行うべきである(図3G)。免疫蛍光標識および共焦点顕微鏡分析のためには、コーティングされたカバーグラスに細胞を播種する必要があります。
細胞変換期間の初期段階および後期
トランスフェクションおよび4-ヒドロキシタモキシフェン処理後15時間で早くも、最初の細胞はかすかな赤色蛍光、すなわち、(活性化された)Ascl1プロモータの下で駆動されるtdTomato赤色蛍光レポータータンパク質を発現し始める。Ascl1発現細胞は現在、さらにAscl1-Tom+細胞と呼ばれる。より堅牢なAscl1-Tom発現は、トランスフェクションの2日後に、時間の経過とともに赤色蛍光が増加するとともに観察することができる(図4)。リプログラミング効果は、リプログラミングmiRNA処理で見出されたフィールドごとに多くのAscl1-Tom+細胞を用いた培養では、約2日間で目に見えるようになる:コントロール-miRおよびmiR-25についてここに示した(それぞれ図4B-B'''および図4C-C''')。どちらの治療でも、Ascl1-Tom+細胞はまだかなり丸く、比較的大きく、よりグリア/前駆細胞様の形態を有する。さらに、赤色蛍光レポーターの誘導は、培養物の細胞密度に影響を及ぼさない(依然として90%〜95%コンフルエント)。
トランスフェクションの3〜5日後(図4Aおよび図5A)、Ascl1-Tom+細胞数の増加は、miR-25処置ウェル(図5B-D)においてより明白になり、対照と比較してmiR-25処置後の数の4倍の増加を示す。さらに、最初の形態学的変化が目に見えるようになる。これらの変化には、細胞ソーマのサイズの減少および微細プロセスの開発が含まれる。対照条件下では、大多数の細胞は大きくて平坦であるが(グリア/前駆細胞様、図-5B-B'')、miR-25治療では、小さな核と網膜ニューロンに似たいくつかの小さなプロセスを持つ多くの細胞が現れる(図-5C-C'')。これらのニューロン様細胞は、全Ascl1-Tom集団の約70%(対照治療において15%)を占める。図5E)。細胞変換により、細胞の密度は低くなります(細胞が小さいほど、必要なスペースが少なくて済みます)。興味深いことに、これらのニューロン様細胞は小さなネットワークを形成しているようにさえ見えます(図5C'')。このとき、免疫蛍光標識のために細胞を回収して、ニューロンの同一性を確認することができる。
ニューロンの正体確認
細胞を、ニューロン特異的細胞骨格タンパク質30,31のマーカーである微小管関連タンパク質2(Map2)および正歯列ホメオボックス2(Otx2)に対する抗体で標識し、ニューロン同一性32,33を検証する。両方のマーカーは、以前のリプログラミング研究21、27においても使用された。Otx2は、RPCs34、35、36、成熟双極性細胞34、35、37、38、39、および光受容体35、36、37、38、40に見られる転写因子である.DAPI核標識は、培養物を遮染するために使用されます。免疫蛍光標識は、対照条件においてMap2またはOtx2発現をほとんどまたは存在しないことを示す(図6A−A''',C)。しかし、miR-25処理サンプルは、多くのMap2+およびOtx2+細胞を有する(図6B-B''')。共焦点画像の定量化は、miR−25過剰発現後、対照において、1視野当たり5個のニューロン細胞と比較して、1視野当たり約40個のニューロン細胞が存在することを示している(図6C、視野サイズ:630μm x 630μm)。画像は20倍の目的で撮影されました。これらのニューロン細胞は、miR−25処理サンプルの全Ascl1−Tom+細胞集団の約70%を構成する(対照〜20%、図6D)。すべてのニューロン様Ascl1-Tom+細胞はMap2+およびOtx2+であり、ニューロンの同一性を確認した。さらに、Otx2+およびMap2+細胞の絶対数は、コントロール-miRNA処理と比較してmiR-25処理後に高かった(miR-25:1フィールドあたり60細胞;コントロール-miR:1フィールドあたり10細胞;図6E)。
まとめると、結果はMG培養物をmiRNAで増殖させ、再プログラムすることができることを示している。miR-25補充は、原発性MGにおいてAscl1-Tom発現を誘導する。多くのMGは、ニューロン形態を採用し、数日後にニューロンマーカーMap2およびOtx2を発現するRPCに変換される。
図1:初代ミュラーグリア培養物の実験計画と経時変化 (A)ミュラーグリア(MG)の網膜前駆細胞(RPC)への変換を追跡するために使用される網膜前駆レポーターマウスである Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/flマウスの概略図。(B)増殖期(青色、 インビトロで0~4/5日、div)、トランスフェクション期(紫色、5/6~7/8div)、MG変換期(黄色、開始7/8div)からなる培養期間の経時変化。増殖期:解離した網膜(1匹のマウスの2つの網膜)を、増殖培地中の12ウェルプレートの1ウェルで増殖させる。4/6日目頃、細胞はコーティングされたカバースリップを含む24ウェルプレートに継代されます。トランスフェクション段階:5~7 div(継代後1日)の細胞をトランスフェクション培地中で2日間miRNAでトランスフェクションします。 Cre リコンビナーゼは、4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)で活性化される。細胞増殖はEdUで追跡される。MG変換フェーズは、トランスフェクションの1日後に開始する。細胞は、収穫までニューロン培地中で増殖する(トランスフェクション後6〜7日後、dpTF)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:網膜解離と遺伝子型決定 (A) 角膜、水晶体、虹彩、硝子体を除去したアイカップ。(B)単離された網膜;網膜色素上皮(RPE)細胞は、徹底的な洗浄後に除去される。(c)解離した網膜を有する12ウェルプレート(ウェルあたり2つの網膜)。(d)ジェノタイピングゲル画像例の切り抜き。ジェノタイピングは、 Ascl1 駆動 Cre リコンビナーゼ発現を有するマウスを同定するために必要であり、細胞変換の追跡に使用される。スケール バー: 1 mm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:成長期の初代ミュラーグリア。(A)成長期(インビトロでの0-4/5日(div))の培養期間の経時変化を青色で強調表示した。(B-G)1 div(B)、培地交換後の2 div(C)、3 div(D)、4 div前(E、F)および5 div、1日後およびトランスフェクション前(G)の成長期のミュラーグリア(MG)のライブ画像(フェーズ)。MG細胞体は赤い矢印で示されている。3 div後、培養物は60%〜80%コンフルエント(D)、4〜5 div後、培養物は90%〜100%コンフルエントであり、継代する準備ができている(E-F)。カバースリップで継代した後、細胞培養物は、その後のトランスフェクション(G)のために80%〜90%コンフルエントである必要があります。スケールバー:50 μm (A-D)、100 μm (E)、200 μm (F)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ミュラーグリア変換期の初期段階(A)変換期の培養期間の経時変化は黄色で強調表示(インビトロで7/8日目に開始(div))。この図に示す分析の時点は、赤い星で示されています:トランスフェクション後2日(dpTF)の7div。(B-C''')ミュラーグリア(MG)培養の相および赤色蛍光のライブ画像は、組み合わせた、または単一の赤色蛍光である。赤色蛍光は、コントロールmiRNA模倣体(コントロールmiR、B-B')またはmiR-25模倣体(C-C')のいずれかによるトランスフェクションの2日後に、MG(tdTomato+、略称Ascl1-Tomと略記)を発現するAscl1を可視化する。B/B' および C/C' の領域は、B''/B'、C''/C' のより高い倍率で表示されます。スケール バー 200 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)変換段階における培養期間の経時変化は、黄色で強調表示された変換段階(インビトロで7/8日目に開始(div))である。この図に示す分析の時点は、赤い星で示されています:トランスフェクション後5日(dpTF)の10 div。(B-C'')ミュラーグリア(MG)培養の相および赤色蛍光のライブ画像は、組み合わせた、または単一の赤色蛍光である。赤色蛍光は、コントロールmiRNA模倣体(control-miR、B-B'')またはmiR-25模倣体(C-C'')のいずれかによるトランスフェクション(pTF)の5日後に、MG(tdTomato+、略称Ascl1-Tom)を発現するAscl1を可視化する。B'/C' のインセットは、それぞれ B''/C'' の倍率が高く表示されます。(D) コントロール-miRNAまたはmiR-25処理後、トランスフェクション後2日および5日後の1視野あたりのAscl1-Tomato+細胞の絶対数(10x;1440μm x 1080μm)(dpTF;n = 1、ウェルあたり5枚の画像をカウント;平均±S.D.)。(E)コントロール-miRNAまたはmiR-25処理後、トランスフェクション後5日後の1視野あたりの総Ascl1-トマト+細胞(10x;1440 μm x 1080 μm)に対するニューロン様Ascl1-Tomato+細胞の割合(5dpTF、n = 1、平均± S.D.)。スケール バー: 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:再プログラムされた細胞のニューロン同一性の確認(A-A'''; B−B''')初代マウスミュラーグリア(MG)培養物の免疫蛍光標識を、トランスフェクションの5日後にコントロールmiRNA模倣体(control−miR、A−A''')またはmiR−25模倣体(B−B''')で処理した。細胞を2%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、RFPに対する抗体と共にインキュベートして、tdTomato、Map2、およびOtx2を標識してニューロンを標識した。DAPI核標識(青色)は、全ての細胞核を染色するために使用した。(C-E)フィールドあたりの Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ セルの絶対数 (C)、合計 Ascl1-Tom+ Otx2+ Map2+ セルの割合 (D)、およびフィールドあたりの Otx2+Map2+ セルの絶対数 (E) の定量化 (n = 1; カバースリップあたり 5 つの画像がカウントされ、平均 ± S.D.) されます。結果は、対照と比較してmiR-25治療におけるニューロンの数が多いことを示している。フィールドサイズ:630 μm x 630 μm。スケール バー: 50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:細胞死と細菌汚染。(A-A'')ミュラーグリア(MG)培養物3 divのライブ画像は、細菌で汚染されています。Aの挿入図1は、A'のより高い倍率で示され、萎縮性、死んだグリアを表示する。Aの挿入図2は、生きているグリアとともにA''に示されている。スケールバー:100 μm。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、miRNAを用いたリプログラミング研究のために、解離したマウス網膜からMGを増殖させる方法を記載している。様々な先行研究で示され、確認されたように、これらの培養物中に見出された細胞の大多数(80%〜90%)はMG20、23、24である。この方法は非常に堅牢で信頼性の高い技術であり、プロトコルが正しく守られていれば結果を簡単に再現できます21,27。しかし、文化の成長と再プログラミングの効率化は、さまざまな要因に依存します。
第一に、マウスの年齢は、細胞増殖の成功に重要な役割を果たしている。したがって、MG培養物がレポーターマウスなどの野生型に類似した野生型マウスまたはトランスジェニックマウスから増殖する場合、コンフルエントなMG単層を増殖させる最新の年齢はP12である。P12では、すべての網膜ニューロンとMGが分化し、網膜にはRPCはもう存在しません。MGは、グルタミン合成酵素またはグルタミン酸アスパラギン酸トランスポーター(GLAST)20、23、41、42などの成熟MGマーカーを発現する。培養P12 MGは、EGFに曝露された場合でも細胞周期に再突入することができるが、インビトロでコンフルエントな細胞層を形成するのに十分ではあるが、サイクル数は限られている。それにもかかわらず、P12 MGでさえ、培地中のEGFまたは成分が分解される可能性があるため、うまく成長しないことが起こり得る。不完全な解離(チャンク)はまた、MG成長の減少または遅延をもたらし得る。不完全解離の主な原因は、酵素の過酷な取り扱い(高速ピペッティング、ボルテックスなど)による網膜解離に用いたDNaseIの不活性化である。細胞が継代までよく成長しても、細胞は継代後にコンフルエントでなくなる可能性があります。この理由は、細胞死の増加につながる継代プロセス中の過酷な取り扱い、または細胞がまばらに播種されすぎたためであり得る。グリアはあまり増殖しないので、細胞は希釈されずに増殖したのと同じ比率で播種されるべきである(不死化細胞株の継代手順に反して)。注目すべきは、MG培養物はウェルの中心から周辺まで成長するので、より高い細胞密度が常に中心に見られることである。したがって、通過前にすべてのウェルのマージンをチェックして、ウェル全体が細胞で覆われていることを確認することが不可欠です。細胞濃度測定は、十分な量の細胞の処理を確実にするために実施されるべきである。
さらに、P6以下のマウスから得られた初代培養物は、MGがこの時点で成熟しそうになっているため、MGを含まないであろう。これは、単一細胞RNA-seq分析43を介して示された。この年齢での成熟MGマーカーによる免疫蛍光標識もこれを確認するでしょう。しかし、RPCの割合はP6で相当です。したがって、結果は慎重に解釈されるべきです。さらに、中間フィラメントマーカーであるビメンチンやネスチンなどのマーカーは、アストロサイト44、45、46、ミクログリア47、48、内皮細胞、および周皮細胞49、50、51、52でも発現しているため、初代MGの同定には適していません。であり、MG 固有ではありません。GFAPは、網膜アストロサイトでは発現するが、損傷を受けていない網膜のMGでは発現せず、培養MGの良好なマーカーではない。解離時の機械的損傷により解離したMGではアップレギュレートされるが、培養28では3日後にダウンレギュレートされる。
MGは多くのRPCマーカーを共有するので、堅牢なMG培養を確実にするための最も安全な手順は、P12またはそれより古いマウスでマウスを使用することである。このプロトコールはP12マウスMGから得られた培養物を記載しているが、成体マウスMGは培養および再プログラムすることができる27。しかし、ウェルあたりより多くの組織を播種する必要があります(4〜6本の網膜)。これは、成体グリアがEGFおよび10%血清に曝露されても、あまり分裂しないからである。減少した細胞接触は、細胞死および細胞変性(伸張された細胞、拡大された細胞)につながる。成体グリアは共培養パラダイム18 のための優れたツールであり、細胞密度はこれらの用途ではそれほど重要ではないかもしれません。しかし、トランスフェクションや形質導入などの下流アプリケーションでは、コンフルエントな細胞層が要件となります。
増殖障害に加えて、細胞死が起こり得る。明らかな兆候なしに細胞死が起こる場合は、マイコプラズマ汚染(マイコプラズマサイズ0.1〜0.3μm)を考慮し、マイコプラズマ検出キットを使用する必要があります。すべてのサンプルを別々に(サンプルをプールしない)しておくことで、交差汚染のリスクを減らすこともできます。しかし、より大きな細菌は動物から持ち越される可能性もあり、すべての作業が清潔で無菌の環境で行われているにもかかわらず、汚染を引き起こす可能性があります。眼球を70%エタノールに短時間浸し、さらに10cmのペトリ皿に徹底的に洗うことをお勧めします。培養を成功させるためには、汚染が迅速に起こる可能性があるため、無菌条件下で作業することが不可欠です。細菌、酵母、またはカビ/真菌がプレート内で見つかると、すべてのウェルが影響を受けるわけではない場合でも、培養物は失われます。汚染は細胞死を引き起こし(補足図1)、細胞に影響を与え、非代表的なデータをもたらす。
細胞死は、カバースリップをコーティングするために使用されるPoly-O(またはPoly-D-リジン)などの下流用途に必要な試薬によっても引き起こされる可能性があります。これらの物質は有毒であり、ラミニンを使用する前に徹底的な洗浄が必要です。カバースリップは井戸の底にくっついて、井戸の中に浮かんではいけません。気泡は避ける必要があります。さらに、ラミニンによる完全なコーティングは、カバースリップへの細胞接着を確実にするために不可欠です。ラミニンの欠乏はまた、より少ない細胞密度および/または細胞死につながる.
真の再プログラムされたグリアの同定のためには、レポーターマウスおよび細胞追跡を可能にする細胞増殖マーカー(EdUまたはBrdUなど)を使用すべきである。網膜全体が播種されているので、ニューロン生存者はすべての培養物に存在する。しかし、ほとんどの場合、それらは通過後にほぼ完全に除去される。それにもかかわらず、ニューロンが増殖するMG/RPCに由来し、ニューロン生存者(有糸分裂後)ではないことを検証するために、EdU(またはBrdU)標識を実施すべきである。ここで使用されるコントロールで見つかった少数のニューロンは、ニューロン生存者です。
興味深いことに、いくつかのAscl1-Tom+細胞もコントロール治療に存在し、時間の経過とともにわずかに数が増加します。これらの細胞は、単離および培養されたときにAscl1を発現するかなり未熟なMGであり得る。しかし、このAscl1-Tom+細胞集団の割合は小さい。さらに、対照治療で見出されたこれらのAscl1-Tom+細胞のほとんどは、Otx2および/またはMap2を発現せず、かなり平坦な細胞形状を保っている。制御条件下ではニューロン分化は起こらないようである。ネットワークを形成するように見える非常に繊細なニューロン様細胞は、miR-25治療後にのみ見出される。
ここで記載したプロトコルは、MGリプログラミング21,27のmiRNAを試験するために以前の研究で使用され、グリアを成長させるためにウェルプレートに関して過去数年間にわずかに修正されています。それらは現在、6ウェルプレートの代わりに12ウェルプレートで栽培されています。コンフルエントな単層は、12ウェルプレートでは4/5日後(6ウェルプレートでは6/8日)に得られるため、細胞の変化/変性につながる全体的な培養期間が短縮されます。トランスフェクションの時間窓も細長い。通常のトランスフェクションプロトコルには3時間のトランスフェクション期間があり、その後、細胞の生存を確保するために完全な培地交換を行う必要があります。すべての分子は、この培地交換後に除去される。現在のプロトコールでは、トランスフェクション試薬培地に50%ニューロン培地(Cre誘導および細胞増殖追跡に必要な因子を補充)を添加することにより、時間枠を延長し、miRNAへのより長い曝露を可能にした。細胞は健康であり、この改変に問題はなかった。トランスフェクションの結果は、長いトランスフェクション時間の方が優れているように見えますが、その観察結果を確認するにはより多くのデータが必要です。
さらに、共焦点レーザー走査顕微鏡検査を行う免疫蛍光標識に必要なすべてのステップがここで説明される。したがって、MGはガラスカバースリップに通す必要があります。カバースリップは24ウェルプレートの面積よりも小さいため、24ウェルプレートのフルウェルを覆う細胞の約3分の1のみがコーティングされたカバースリップに収まります。qPCR、RNA-Seq、またはウェスタンブロットなどの他の用途では、細胞を1:1の比率で継代し、処理し、所望の時点で回収する。
前述のように、この培養系は、例えば、神経保護機構、神経膠症を含むグリア挙動の研究、および/またはわずかに異なる培養パラダイムまたは種を使用した研究と同様のmRNA、miRNA、または培養グリアのタンパク質をプロファイルするために、他の用途にも使用することができる11,28,29,54.これらの用途は、リプログラミング後のニューロン生存を保証するためのニューロン培地も、細胞増殖を視覚化するためのEdUの添加も必要としない。代わりに、ニューロンサプリメントを含まない低血清培地を使用する必要があります。
この方法は堅牢で信頼性が高いが、すべての初代培養システムと同様に限界がある。これらは、細胞の限られた寿命、経時的な進行性細胞変性28、および他の網膜細胞型および細胞外マトリックスの両方に関して生理学的文脈を模倣することができない2次元の人工培養系であるという事実である。したがって、MG初代培養における最上位候補およびそれらの最も効率的な濃度を同定した後、網膜組織に似た3次元培養系である網膜外植培養を実施すべきである。外植培養はまた、限られた培養期間を有し、外植体の細胞は時間の経過とともに同様に退化する。しかし、それらはそれらの自然な3次元環境でのMGの研究を可能にし、動物の発達段階を反映した様々な年齢で行うことができる23,32,55,56。
まとめると、この研究は、免疫蛍光標識によって検証されたMGをニューロン様細胞に再プログラムするRPC miRNA miR-25の可能性を監視するために使用されるMG培養物について報告する。このプロトコルは、以前の研究21、24、27で使用され、MGの再生可能性を研究するための現在のin vitro法であり、全体的に、MG初代培養は堅牢な技術であり、再現可能な結果を可能にする20、21。MGリプログラミングのためのmiRNA過剰発現がここで排他的に説明されていますが、小分子、DNA(プラスミドまたはウイルスベクターに詰められたもの)、タンパク質阻害のための抗体32、または特定の化合物などの他の要因をMG初代培養物で使用/試験することができます。また、miRNA プロファイリング 24、scRNA-seq 27、RT-qPCR 20、21、またはウェスタンブロット 20 など、幅広いダウンストリームアプリケーションもあります。さらに、MG初代培養は、細胞の毎日の観察および監視を可能にする。これは、例えば、特定の反応または細胞応答の開始、持続時間、および/または終了について、時点を決定するための実質的な利点であり得る。遊走的または増殖的挙動、ならびに傷害/細胞損傷に関連するパラダイム(例えば、MG培養におけるグローバルmiRNA欠失)32をMG初代培養において研究および分析して、根底にあるメカニズムおよび経路を同定することができる。したがって、MG培養は、in vivoシステムで実施する前に分子および細胞レベルでMGを研究するための非常に強力なツールです。
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Disclosures
この報告書の調査結果の一部を含む特許は、ワシントン大学によって発明者ニコラス・ジョルスタッド、ステファニー・G・ウォル、トーマス・A・レーと共に出願されました。特許のタイトルは「網膜再生を刺激する方法および組成物。
Acknowledgments
著者らは、Ann Beaton博士とすべての研究室メンバーに原稿へのインプットに感謝します。シアトルのワシントン大学でのポスドク研修中に、MG初代文化をスクリーニングツールとしてS.G.W.に紹介してくれたTom Reh博士、Julia Pollak博士、Russ Taylor博士に特に感謝します。この研究は、S.G.W.へのEmpire Innovation Program(EIP)グラントとSUNY検眼からS.G.W.へのスタートアップ資金、およびNational Eye Institute(NEI)からS.G.W.へのR01EY032532賞によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
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