Summary
O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.
Abstract
As interações entre matriz celular mediam processos fisiológicos complexos por meio de pistas bioquímicas, mecânicas e geométricas, influenciando mudanças patológicas e respostas terapêuticas. Espera-se que a contabilização dos efeitos matriciais no início do pipeline de desenvolvimento de medicamentos aumente a probabilidade de sucesso clínico de novas terapêuticas. Estratégias baseadas em biomateriais recapitulando microambientes específicos de tecido na cultura celular 3D existem, mas integrar-os com os métodos de cultura 2D usados principalmente para a triagem de medicamentos tem sido desafiador. Assim, o protocolo aqui apresentado detalha o desenvolvimento de métodos para a cultura 3D dentro de matrizes biomateriais miniaturizadas em um formato de placa multi-poço para facilitar a integração com os pipelines de triagem de medicamentos existentes e ensaios convencionais para viabilidade celular. Uma vez que a matriz apresenta características críticas para a preservação de fenótipos clinicamente relevantes em células cultivadas, espera-se que seja altamente específico para tecidos e doenças, a triagem combinatória dos parâmetros matriciais será necessária para identificar condições adequadas para aplicações específicas. Os métodos descritos aqui utilizam um formato de cultura miniaturizada para avaliar as respostas das células cancerosas à variação ortogonal da mecânica matricial e apresentação de ligantes. Especificamente, este estudo demonstra o uso desta plataforma para investigar os efeitos dos parâmetros matriciais sobre as respostas das células glioblastoma derivadas do paciente (GBM) à quimioterapia.
Introduction
O custo esperado para o desenvolvimento de uma nova droga aumentou constantemente na última década, com mais de US $ 1 bilhão em estimativas atuais1. Parte dessa despesa é a alta taxa de falha de medicamentos entrando em ensaios clínicos. Aproximadamente 12% dos candidatos a medicamentos finalmente ganham aprovação da Food & Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos (EUA) em 2019. Muitas drogas falham na Fase I devido à toxicidade inesperada2, enquanto outras que passam por testes de segurança podem falhar devido à falta de eficácia3. Este atrito devido à não eficácia pode ser explicado em parte pelo fato de que os modelos de câncer usados durante o desenvolvimento de medicamentos são notoriamente não preditivos da eficácia clínica4.
Disparidades funcionais entre modelos in vitro e in vivo podem ser atribuídas à remoção de células cancerígenas de seu microambiente nativo, incluindo células não tumorais e o ECM 5,6 físico. Comumente, grupos de pesquisa usam matrizes culturais disponíveis comercialmente, como Matrigel (uma matriz de membrana de porão protéciosa derivada de sarcomas de camundongos) para fornecer células tumorais cultivadas com um microambiente de matriz 3D. Em comparação com a cultura 2D, a cultura 3D na matriz de membrana melhorou a relevância clínica dos resultados in vitro 7,8. No entanto, os biomaterias de cultura de tecidos descelularizados, incluindo a matriz de membrana, normalmente exibem variabilidade em lote que pode comprometer a reprodutibilidade9. Além disso, matrizes derivadas de tumores com diferentes origens teciduais dos estudados podem não fornecer as pistas fisiológicas apropriadas10. Finalmente, os cânceres com altos graus de heterogeneidade intratumoral têm características microambientais que variam em uma escala de tamanho de submicron e que a matriz de membrana não pode ser ajustada para recapitular11.
Glioblastoma (GBM), um tumor cerebral uniformemente letal com um tempo médio de sobrevida de aproximadamente 15 meses, é um câncer para o qual o desenvolvimento do tratamento tem sido particularmente difícil12,13. O padrão atual de cuidado para GBM consiste em ressecção do tumor primário, seguido de radioterapia e quimioterapia usando temozolomide (TMZ)14. No entanto, mais da metade dos tumores clínicos de GBM apresentam resistência ao tratamento através de vários mecanismos 15,16,17. Prever a eficácia de um regime de tratamento para um paciente individual é extremamente difícil. Modelos pré-clínicos padrão usados para prever desfechos individuais consistem em células tumorais derivadas do paciente xenoenxericamente em camundongos imunocomprometidos. Embora os xenoenxertos derivados do paciente possam recapitular muitos aspectos dos tumores clínicos de GBM e são valiosos para modelos pré-clínicos18, eles são inerentemente caros, de baixa produtividade, demorados e envolvem preocupações éticas19. Culturas de células derivadas do paciente, em superfícies plásticas 2D ou como esferoides, evitam principalmente esses problemas. Embora as células derivadas do paciente preservem aberrações genéticas, suas culturas em 2D ou como esferoides suspensos têm sido em grande parte representações ruins de xenoenxertos derivados do paciente em roedores e tumores originaisdo paciente 20. Anteriormente, nós, e outros, mostramos que as células GBM cultivadas em um ECM 3D que imita as propriedades mecânicas e bioquímicas do tecido cerebral podem preservar fenótipos de resistência a drogas 10,21,22,23.
Interações entre o ácido hialurônico (HA), um polissacarídeo abundante no cérebro ECM e superexpresso em tumores GBM, e seu receptor CD44 modulam a aquisição da resistência medicamentosa in vitro 21,24,25,26,27. Por exemplo, a inclusão de HA dentro de culturas 3D suaves aumentou a capacidade das células GBM derivadas do paciente de adquirir resistência terapêutica. Essa mecano-responsividade dependia da vinculação ha aos receptores CD44 em células GBM21. Além disso, a ligação integrin aos peptídeos portadores de RGD, incorporadas em matrizes de cultura 3D, amplificou a chemoresistance mediada pelo CD44 de forma dependente da rigidez21. Além do HA, a expressão de várias proteínas ECM, muitas contendo regiões de RGD, variam entre tumores cerebrais normais e GBM28. Por exemplo, um estudo relatou que 28 proteínas ECM distintas foram regulamentadas em tumores GBM29. Dentro deste complexo microambiente da matriz tumoral, as células cancerígenas integram sinais mecânicos e bioquímicos para produzir um fenótipo de resistência particular, que depende de diferenças relativamente pequenas (por exemplo, menos de uma ordem de magnitude) no modulo de Young ou densidade de peptídeos integrin-binding 28,29,30.
O presente protocolo caracteriza como as células tumorais interpretam combinações únicas de sinais matriciais e identificam microambientes matriciais complexos e específicos do paciente que promovem a resistência ao tratamento (Figura 1A). Um método fotoquímico para gerar matrizes miniaturizadas e precisamente sintonizadas para a cultura 3D proporciona um espaço variável grande e ortogonal. Uma matriz personalizada de LEDs, executado por um microcontrolador, foi incorporada a hidrogéis fotocrosslink dentro de um formato de placa de 384 poços para aumentar a automação e a reprodutibilidade. A intensidade de exposição foi variada em todo o bem para alterar as propriedades micromecânicas dos hidrogéis resultantes, conforme avaliado por meio de microscopia de força atômica (AFM). Embora este manuscrito não se concentre na construção da matriz de iluminação em si, um diagrama de circuito (Figura 1B) e lista de peças (Tabela de Materiais) são fornecidos como auxílios para a reprodução do dispositivo.
Este relatório demonstra a rápida geração de uma matriz de células GBM cultivadas em microambientes 3D únicos nos quais o módulo de Young (quatro níveis em uma única ordem de magnitude) e o teor de peptídeos integrin (derivados de quatro proteínas ECM diferentes) foram variados ortogonicamente. A abordagem foi então utilizada para investigar as contribuições relativas da mecânica hidrogel e do engajamento integrin específico do ECM na viabilidade e proliferação de células GBM derivadas do paciente à medida que adquirem resistência à quimioterapia temozolomide (TMZ).
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Protocol
As linhas celulares GBM derivadas do paciente (GS122 e GS304) foram fornecidas pelo professor David Nathanson (nosso colaborador), que desenvolveu essas linhas sob um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UCLA (IRB nº 10-000655). As células foram fornecidas desidentidas para que as linhas celulares não pudessem ser ligadas aos pacientes individuais.
1. Preparação da solução de hidrogel
- Prepare a solução tamponada hepes dissolvendo o pó HEPES a 20 mM na solução de sal balanceada da Hank (HBSS). Ajuste o pH para 7 após a solvação completa.
- Na solução tamponada hepes, dissolva ha (700 kDa peso molecular nominal, ver Tabela de Materiais), preparado após o relatório anterior31, de modo que 6%-8% dos resíduos de ácido carboxílico em cada ácido glucurônico sejam modificados com um tiol, a uma concentração de 10 mg/mL em solução tampão.
NOTA: Recomenda-se um frasco âmbar para evitar a oxidação de tiol por luz ambiente.- Mexa usando uma placa de agitação magnética (<1.000 rpm) à temperatura ambiente até dissolver totalmente, normalmente em torno de 45 min.
- Enquanto a HA estiver dissolvendo, prepare soluções separadas de (1) 100 mg/mL de 8 braço-PEG-Norbornene (20 kDa), (2) 100 mg/mL de 4 braço-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM de peptídeo contendo cisteína ou cisteína (por exemplo, GCGYGRGDSPG) e (4) 4 mg/mL de LAP em tubos de microcentrifuus (ver Tabela de Materiais).
- Prepare cada uma dessas quatro soluções na solução tamponada hepes preparada na etapa 1.1. Vórtice as soluções para garantir a dissolução total de cada reagente antes de realizar a etapa 4.
NOTA: Se testar vários peptídeos diferentes, cada um deve conter uma cisteína ou outra fonte de moiety thiol para esta química de conjugação. - Prepare soluções (thiol disponível de 4 mM) de todos os peptídeos a serem amarrados dentro de um único hidrogel neste momento.
NOTA: As sequências de peptídeos e as proteínas ECM das quais foram derivadas e utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 1. A cisteína-de-n-acetil (ver Tabela de Materiais), à qual as células não se ligam, pode ser substituída por um peptídeo bioativo, contendo tiol, para titular a concentração de um peptídeo adesivo ou agir como um controle negativo31.
- Prepare cada uma dessas quatro soluções na solução tamponada hepes preparada na etapa 1.1. Vórtice as soluções para garantir a dissolução total de cada reagente antes de realizar a etapa 4.
- Misture as soluções individuais de HA, PEG-Norbornene, PEG-thiol e peptídeos contendo cisteína/thiol (ver Tabela de Materiais) para alcançar as concentrações finais para as matrizes de hidrogel finais listadas na Tabela 2. Mexa (<1.000 rpm) em uma placa de agitação magnética por pelo menos 30 minutos para misturar totalmente.
NOTA: As soluções HA são altamente viscosas e melhor manuseadas usando uma pipeta de deslocamento positiva (ver Tabela de Materiais). Se uma pipeta de deslocamento positivo não estiver disponível, as soluções viscosas também podem ser dispensadas com uma micropipette padrão, tubos lentos usando pontas de orifícios largos.
2. Iluminação e fotocrosslinking de hidrogéis através de uma matriz LED
ATENÇÃO: Use óculos de proteção UV e cubra o campo de iluminação com material absorvente de UV.
NOTA: O conjunto led descrito neste protocolo consiste em seis conjuntos de oito LEDs colocados em série, conforme ilustrado pelo diagrama do circuito fornecido (Figura 1A). Cada conjunto de LEDs pode ser alimentado independentemente, o que permite até seis irradiações diferentes por execução. O Arquivo Suplementar 1 contém capturas de tela correspondentes às seguintes instruções para orientação posterior.
- Baixe o arquivo Illumination.zip do Dispositivo de Codificação Suplementar. Este diretório contém os seguintes arquivos: Arduino.zip (Arquivo de Codificação Suplementar 1), Drivers.zip (Arquivo de Codificação Suplementar 2), GUI.zip (Arquivo de Codificação Suplementar 3) e Holder.zip (Arquivo de Codificação Suplementar 4).
NOTA: Imprima em 3D as porções superior e inferior para manter a placa de circuito no lugar (consulte Arquivos de Codificação Suplementar para obter detalhes). - Baixe e instale o software de microcontrolador (ver Tabela de Materiais).
- Baixe e instale o software GUI (ver Tabela de Materiais). Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter instruções de operação de software.
- Abra o processamento e instale a biblioteca controlIP5 clicando em Sketch > Import Library > Add Library. Em seguida, procure o controleIP5 em bibliotecas e clique em Instalar. Faça isso pela primeira vez.
- Ligue o dispositivo de iluminação (ver Tabela de Materiais) usando a fonte de alimentação de 36 Volts e conecte-o a um PC usando um cabo micro-USB.
NOTA: Alguns dispositivos não instalarão drivers automaticamente para várias placas nano Arduino. Um conjunto de drivers é fornecido no arquivo zip do dispositivo. - Abra o arquivo Arduino.ino, localizado na pasta Adruino.zip, usando o IDE Arduino.
- Compile o arquivo Arduino.ino clicando no botão Marcar verificação . Carregue o código compilado clicando no botão Seta .
- Abra o arquivo GUI.pde, localizado na pasta gui.zip, utilizando Processamento.
- Clique em Executar no programa de processamento para iniciar a interface gráfica do usuário para controlar o dispositivo de iluminação.
- Na janela gráfica da interface do usuário, clique em Intensidade para que a coluna contendo solução precursora de hidrogel seja interligada e insira a intensidade desejada. Clique na caixa Hora e na hora desejada. Para a solução fornecida na Tabela 2, este será de 15 s.
NOTA: Os usuários finais precisam calibrar os valores de intensidade digital à irradiação usando um radiômetro. Exemplos de intensidades típicas são fornecidos na Figura 2A. - Alinhe as amostras com o dispositivo de iluminação (Figura 2B) com todos os outros LED em uma única coluna dos moldes de silicone (ver Tabela de Materiais) ou placa de 384 poços. Clique em Terminar para iniciar a iluminação. Repita este processo conforme necessário para a iluminação de vários slides ou outros poços de uma placa de 384 poços.
NOTA: O suporte foi projetado de tal forma que a placa de 384 poços fique alinhada com um canto da câmara interna durante a iluminação.- Seguindo a iluminação, quando colocado em um canto, mova a placa do poço para a próxima curva e repita. Para iluminar os poços na outra metade da placa, levante a placa para fora do suporte e gire 180°.
- Gerar hidrogéis com mecânicas variadas para caracterização mecânica seguindo as etapas abaixo.
- Limpe as lâminas de vidro e os moldes de silicone usando fita adesiva para remover detritos. Adere aos moldes de silicone ao deslizamento de vidro, pressione para baixo para garantir uma boa vedação e desloque quaisquer bolhas de ar.
- Pipeta 80 μL de solução precursora de hidrogel, preparada na etapa 1.4, em cada molde de silicone na lâmina de vidro.
- Coloque o deslizamento de vidro sobre o dispositivo de iluminação alinhado com todos os outros LED em uma única coluna. Exponha os precursores do hidrogel à luz UV por 15 s, conforme descrito na etapa 2, ao fotocrosslink.
- Uma vez que a iluminação tenha parado, recupere os slides e solte os géis dos moldes traçando a circunferência interna do molde com uma ponta fina (ponta de pipeta de 10 μL, agulha de 30 G, etc.). Remova os moldes de silicone com pinças/fórceps.
- Mova hidrogéis cruzados em poços individuais de uma placa de 12 poços, molhando uma espátula e empurrando-os suavemente para fora do escorregador de vidro. Encha cada poço com 2 mL de DPBS (ver Tabela de Materiais) antes de adicionar o hidrogel. Inchar os géis na solução DPBS por pelo menos 12 h (normalmente durante a noite) à temperatura ambiente (para a caracterização mecânica do dia seguinte).
3. Medições de Microscopia da Força Atômica (AFM)
- Ligue o microscópio de força atômica (AFM) de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Este protocolo fornece instruções breves para o uso do instrumento e do software relacionado.
- Instale a sonda AFM (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Para o presente estudo, um nitreto triangular de silício cantilever com uma constante nominal de mola de 0,01 N/m foi modificado com uma partícula de dióxido de silício esférico de 2,5 μm. - Após a instalação, alinhe o laser ao ápice da sonda triangular e, em seguida, ajuste a deflexão do espelho e do laser para maximizar a soma do sinal (tipicamente entre 1,5-2,2 Volts).
- Mergulhe a sonda em DPBS e aguarde até 15 minutos para obter o equilíbrio térmico. Clique no botão Calibração e selecione Calibração dependente de contato . Clique no botão Coletar ajuste térmico e, após a coleta de dados, selecione o pico em torno de 3 kHz para calibração.
NOTA: Um pequeno ajuste do espelho e dos defletores a laser pode ser necessário após a imersão em um líquido devido a alterações de índice refrativo. - Aproxime-se da superfície de uma placa de Petri (plástico) definindo os Parâmetros de Aproximação para Velocidade Constante, uma altura alvo de 7,5 μm e uma velocidade de aproximação de 15 μm/s. Habilite a medição da linha de base por execução para abordagem para que a abordagem seja executada continuamente e não pare cedo devido à deriva no defletor.
- Após a aproximação, defina parâmetros de aquisição para mapeamento de força para turnarounds de 4 nN, 2 μm de distância de recuo, velocidade de 1 μm/s e tempo de contato de 0 s. Pressione o botão Iniciar para começar a coletar uma curva de força na superfície de plástico (por exemplo, uma placa de poço).
- Volte para a janela de calibração e selecione a porção da curva de força correspondente ao contato e recuo do plástico. Aceite os valores calculados de sensibilidade e rigidez para que a sonda complete a calibração.
- Após a calibração, levante a sonda AFM e coloque a amostra de hidrogel para interrogatório. Aproxime-se do hidrogel seguindo as configurações fornecidas na etapa 5.
NOTA: Durante o procedimento de aproximação em direção à superfície do hidrogel, a unidade pode acionar erroneamente o estado abordado. Para verificar a abordagem real, obtenha uma curva de força como na etapa 4.6. Repita o procedimento de aproximação se a curva resultante não mostrar contato e resultar em recuo. - Quando a abordagem da superfície for bem sucedida, mude para o modo de mapeamento da força e defina parâmetros de aquisição para um mapa de tamanho 8 x 8 com 40 μm de comprimento por eixo. Obter mapas de força em várias regiões para avaliar a uniformidade das medidas de rigidez.
- Interprete as curvas de força usando o programa de software JPK SPM Data Processing através de um ajuste de modelo Hertz/Sneddon (Equações 1 e 2, ver Tabela 3 para a definição de todas as variáveis) com a geometria esférica selecionada 32,33,3 4.
Equação132
Equação 232
- Interprete as curvas de força usando o programa de software JPK SPM Data Processing através de um ajuste de modelo Hertz/Sneddon (Equações 1 e 2, ver Tabela 3 para a definição de todas as variáveis) com a geometria esférica selecionada 32,33,3 4.
Equação132
Equação 232
4. Configuração e tratamento medicamentoso de culturas 3D, embutidas em matriz
- Prepare células desejadas como uma única solução celular.
NOTA: Diferentes tipos de células podem exigir diferentes métodos de passagem. Um protocolo típico para a passagem de uma cultura de suspensão de spheróides GBM a partir de um frasco T-75 é relatado na referência31. - Colete esferoides GBM (aproximadamente 150 μm de diâmetro) de uma cultura de suspensão de frascos T-75 em um tubo cônico de 15 mL. Enxágüe o frasco de cultura com 5 mL de DPBS para remover quaisquer células residuais e mídia e adicionar este volume ao tubo cônico.
- Centrifugar o tubo cônico contendo células a 200 x g por 5 min a temperatura ambiente. Após a centrifugação, remova o supernasce com uma pipeta serológica de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular, e resuspend em 5 mL de DPBS.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min a temperatura ambiente para lavar células. Aspire o supernasciente com uma pipeta sorológica de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular, e depois resuspend células em 2 mL de reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais).
- Incubar em temperatura ambiente por 10-15 min. Adicione 3 mL de meio completo (ver Tabela de Materiais) e pipeta suavemente 3-5 vezes para quebrar os esferoides a uma única suspensãocelular 31.
- Centrifugar a suspensão unicelular a 400 x g (suspensões unicelulares podem ser giradas mais rapidamente para formação de pelotas) por 5 minutos a células de pelotas à temperatura ambiente. Aspire o supernatante com uma pipeta sorológica de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular. Células resuspendas em 1 mL de meio completo.
NOTA: Se as células permanecerem em aglomerados, em vez de como células únicas em suspensão, após a passagem, as células podem ser passadas através de um coador de células de 40 μm para obter uma única suspensão celular. - Remova uma parte das células para contar usando um hemótmetro. Diluir esta porção duas vezes com o azul trypan, que permeia as células com viabilidade comprometida. Conte apenas as células vivas e incolores. Normalmente, um T-75 semeado a 800.000 células por frasco produz 2-3 milhões de células após uma semana na cultura.
- Determine o número de células necessárias para encapsulamento. Transfira um volume de mídia contendo o número total de células necessárias para um tubo de microcentrifus de 1,7 mL estéril. Gire a 400 x g por 5 min a temperatura ambiente.
NOTA: Por exemplo, um mínimo de 2,5 milhões de células resuspentecidas em 1 mL de volume de gel é necessário para encapsular células a 2,5 milhões de células/mL. Um volume de gel de 1 mL permite que os usuários dispensem 100 gotas de gel, onde cada gota de gel é de 10 μL de volume. A preparação de um volume extra de ~20% de células suspensas na solução de hidrogel é recomendada para contabilizar a perda durante a transferência de pipeta. Assim, prepararia-se 3 milhões de células e 1,2 mL de solução precursora de hidrogel neste exemplo. Recomenda-se uma densidade mínima de 500 mil células/mL. - Aspire o supernatante com uma micropipette, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular. Resuspenque a pelota celular na solução precursora do hidrogel, conforme preparado na etapa 1.4, misturando-se bem por pipetar para cima e para baixo com uma micropipette de 1.000 μL 4-5 vezes.
- Carregue as células em um pipettor repetido (ver Tabela de Materiais) definido para dispensar 10 μL. Para evitar bolhas e dispensação irregular, prime o pipettor repetitivo, distribuindo um adicional de 1-2 vezes em um recipiente de resíduos.
- Em cada poço de uma placa de 384 poços, dispense 10 μL de células suspensas em solução de hidrogel do pipettor repetitivo. Utilizando a matriz LED, ilumine cada poço contendo células (passo 2) para 15 s com intensidades (exemplo resulta na Figura 2A utilizando intensidades de 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/cm2) para alcançar as propriedades mecânicas desejadas.
NOTA: Sugere-se começar com cinco réplicas por condição experimental e escalar para cima ou para baixo, dependendo do rendimento e variância desejados do ensaio de ponto final. - Adicione 40 μL de mídia completa a cada poço contendo as células. Adicione 50 μL de DPBS a poços secos não experimentais ao redor dos géis para minimizar as perdas devido à evaporação.
- Para células GBM, adicione 40 μL da droga contendo mídia (por exemplo, TMZ, consulte Tabela de Materiais) para alcançar a concentração final desejada (10 μM-100 μM em dimetilsulfoxida (DMSO) ou veículo (DMSO), consequentemente, a partir de 3 dias após o encapsulamento.
5. Ensaio de proliferação CCK8
- Adicione 10 μL de reagente CCK8 (ver Tabela de Materiais) a cada poço contendo as células.
NOTA: Se realizar este ensaio pela primeira vez, inclua poços de controle negativos, como apenas mídia ou hidrogel sem células na mídia. - Incubar por 1-4 h de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Este tempo pode variar em função do tipo e densidade celular e, portanto, os tempos de incubação precisam ser testados para cada aplicação para que os valores de absorção se recaem dentro de uma faixa linear, um requisito para a aplicação da Lei35 da Cerveja. - Leia absorventes a 450 nm para todos os poços após a incubação.
- Calcule a absorvância média em 450 nm obtida na etapa 3 para a condição do veículo para cada grupo. Divida cada droga tratada bem pela média do controle do veículo por grupo.
- Calcule os intervalos de confiança gerando distribuições de botas (N = 10.000) através do método percentil36.
NOTA: Geralmente, pode-se utilizar intervalos de confiança de 95% e interpretar condições cujos intervalos de confiança não ultrapassam 1 para serem significativos e justificar uma investigação mais aprofundada. Definir intervalos de confiança para 95% é congruente com a definição de um corte de significância de p = 0,05. Para os dados mostrados nos resultados, há utilidade na distinção de condições que promovem ou inibem a resistência a medicamentos mediados por matrizes, exigindo uma análise de dois lados.
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Representative Results
As medições da AFM confirmaram o controle preciso da mecânica de hidrogel em função da irradiação UV (mW/cm2) durante o photo-crosslinking usando uma matriz LED personalizada, controlada por Arduino (Figura 2A). A formulação de hidrogel utilizada neste protocolo pode ser encontrada na Tabela 2. O espaçamento dos LEDs no modelo fornecido corresponde ao espaçamento para todos os outros poços de uma placa de 384 poços, permitindo a formação de géis dentro da placa (Figura 2B). O interrogatório da AFM sobre regiões em escala de micron nas superfícies de hidrogéis únicos mostrou que hidrogéis com moduli médio mais suave de Young também tinham faixas menores de moduli do que hidrogéis mais rígidos (Figura 2C-E).
As densidades de semeadura celular que maximizam a viabilidade devem ser determinadas empiricamente para cada tipo de célula. Este estudo demonstra que as culturas 3D das células GS122 semeadas em densidades de 2.500.000 células/mL apresentaram viabilidades substancialmente maiores quando avaliadas após 7 dias de cultura em comparação com aquelas semeadas em densidades de 500.000 células/mL (Figura 3A). Além disso, as células GS122 e GS304 foram utilizadas como modelos para a cultura de células GBM derivadas do paciente para investigar a dependência da resposta quimioterápica à rigidez e composição bioquímica do microambiente matricial (Figura 3B-D). A viabilidade celular foi avaliada através do ensaio CCK8 após o tratamento com o TMZ por 4 dias, levando a um tempo de cultura total de 7 dias, escalando a medição de OD450 por um controle de veículo correspondente e gerando intervalos de confiança de 95% por bootstrapping (N = 10.000) com o método percentil36. Com essas distribuições, foram consideradas significativas condições em que os intervalos de confiança não se sobrepunham a um valor de 1 (linha tracejada). Em comparação com métodos estatísticos mais comumente utilizados, como testes t ou ANOVA, a estimativa de intervalos de confiança, utilizando bootstrapping para estimar distribuições que estariam presentes para tamanhos amostrais maiores, é preferido para ensaios de triagem cujo objetivo é identificar um subconjunto menor de condições para uma investigação mais aprofundada. Um benefício adicional deste método é que condições com um spread menor em um intervalo de confiança podem ser priorizadas em relação a outras condições com um valor médio semelhante, mas um maior spread no intervalo de confiança. Este estudo indicou que as células GS122 obtiveram benefícios de sobrevivência de interações microambientais (Figura 3B). Esse benefício de sobrevivência foi significativo nas condições de 0,8, 1 e 4 kPa, mas não na condição de 8 kPa para células GS122. As células GS304 eram insensíveis tanto à rigidez quanto ao tratamento do TMZ.
O efeito da composição bioquímica do microambiente matricial foi então examinado variando a inclusão de peptídeos derivados do ECM, integrin-binding (Tabela 1) conhecido por serem regulados no microambiente tumoral GBM em duas rigidezs, 0,8 kPa e 8 kPa. Mais uma vez, as células GS304 não receberam nenhum benefício significativo de sobrevivência da inclusão matricial e foram insensíveis ao TMZ. No entanto, as células GS122 apresentaram ganhos de sobrevivência na condição de 8 kPa quando peptídeos derivados da osteopontina foram incluídos na matriz, enquanto a incorporação de sialoproteína de ligação integrin (IBSP)- ou peptídeos derivados de tenascina-C proporcionaram benefícios mínimos de sobrevivência, como a cultura em matrizes com o peptídeo RGD geral (Figura 3C). Em contraste, nenhum peptídeo conferiu ganhos de sobrevivência na condição de cultura de 0,8 kPa (Figura 3D). Juntos, os resultados sugerem diferenças intrínsecas nas respostas matricial e medicamentos entre as duas linhas celulares derivadas do paciente avaliadas.
Culturas de hidrogel 3D podem ser visualizadas usando microscopia de luz padrão para avaliar como a morfologia celular e comportamentos invasivos são afetados pelas condições de cultura de forma dependente de linhas celulares (Figura 4). Ambas as células GS122 e GS304 se espalham quando cultivadas em matrizes de hidrogel macias ou rígidas, incluindo peptídeos contendo RGD (Figura 4A). Embora os peptídeos afetassem a propagação celular, a capacidade de uma célula se espalhar não necessariamente previu a capacidade da cultura de adquirir resistência ao TMZ. Por exemplo, as células GS122 mostram uma falta semelhante de disseminação em 0,8 e 8 kPa com osteopontina; no entanto, o GS122 só mostrou maior resistência ao TMZ na condição de 8 kPa (Figura 4B). Finalmente, esta plataforma de cultura 3D miniaturizada pode ser usada para cultivar células humanas de outros tipos de tumores, incluindo organoides viáveis de células cancerígenas de próstata neuroendócrinas terminalmente diferenciadas (Figura 4C).
Figura 1: Representação do desenho animado do protocolo. (A) Representação de desenho animado do processo para geração e monitoramento da cultura 3D. (1) São preparadas soluções de hidrogel baseadas em HA. (2) As soluções de hidrogel são então interligadas com intensidade variável através de LEDs controlados por um microcontrolador Arduino. (3) A mecânica de hidrogel resultante é avaliada pela AFM para verificar a diferença na mecânica do gel. (4) As soluções que correspondem à formulação do Passo 1 são então usadas para encapsular células GBM derivadas do paciente e tratadas com a droga. (5) Após 7 dias, a viabilidade celular é lida via assiiz colorimétrico CCK8. (B) Diagrama de circuito para matriz de iluminação LED personalizada utilizada neste protocolo. Os componentes individuais estão listados na Tabela de Materiais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Hidrogéis fabricados com rigidez variada usando LEDs tunable para modificar a irradiação. (A) As tramas de violino mostram o Modulo de Young calculado a partir de curvas de força geradas pela AFM em três regiões de superfície, abrangendo 40 μm x 40 μm, de hidrogéis individuais. O módulo de young de cada hidrogel é mostrado como uma função da irradiação UV durante a fotocrosslinking. Linhas brancas horizontais indicam a mediana para cada grupo experimental. (B) matriz led com espaçamento correspondente ao tom de placas multi-poço (384 poços). (C) Mapa de calor mostrando a variação regional do módulo de Young (média = 0,8 kPa) para um gel típico interligado pela exposição a 1,55 mW/cm2 para 15 s. (D) Mapa de calor mostrando a variação regional do módulo de Young (média = 8 kPa) para um gel típico interligado após exposição a 2,74 mW/cm2 para 15 s. (E) Histograma ilustrando a faixa de medidas de módulo de Young através da superfície de hidrogéis mostrados em C e D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Apresentação ortogonal de rigidez e peptídeo de ligação integrina revela diferenças biológicas intrínsecas entre linhas celulares GBM. (A) Valores típicos de absorção para células GS122 encapsuladas em um hidrogel de 10 μL a uma densidade de 500.000 ou 2.500,00 células por mL. (B) Os dados de resposta a medicamentos para as linhas celulares GS122 e GS304 são visualizados pela normalização do valor OD450 dos poços tratados com drogas (N = 5) pela média dos poços tratados com veículos (N = 5). A viabilidade no contexto do tratamento medicamentoso foi observada para variar quase para rigidez de hidrogel, demonstrando variação entre as linhas celulares. (C,D) Dados de resposta a medicamentos para linhas celulares GS122 e GS304 quando o tipo de peptídeo de ligação integrin foi incluído e a rigidez da matriz foi variada ortogonalmente. Todas as barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% obtidos a partir do bootstrapping cada condição por N = 10.000. A linha tracejada (eixo y = 1) corresponde ao caso em que OD450 para as condições de tratamento é igual ao veículo. Todos os valores experimentais foram obtidos após 7 dias na cultura; O TMZ foi adicionado 3 dias após o encapsulamento inicial para estudos de drogas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diferenças morfológicas entre células encapsuladas em diferentes ambientes de hidrogel baseados em HA. (A) Imagens de contraste de fase de GS122 e GS304, quando cultivadas em um hidrogel (0,8 e 8 kPa), exibiram um motivo RGD. Setas brancas indicam células com morfologias espalhadas. (B) Imagens de fase de GS122 e GS304, quando cultivadas em um hidrogel (0,8 e 8kPa), exibiam um peptídeo derivado da osteopontina. Setas brancas indicam células com morfologias espalhadas. Flechas negras indicam células com morfologias arredondadas. Após 7 dias na cultura, imagens foram tiradas, e o TMZ foi adicionado 3 dias após o encapsulamento inicial. (C) Imagem de fase de um organoide neuroendócrino de próstata terminalmente diferenciado. Barras de escala = 200 μm (para A,B); 100 μm (para C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Proteína | Sequência de Peptídeos |
| RGD | GCGYGRGDSPG |
| Tenascin-C | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV |
| Sialoproteína de ligação integrina (IBSP) | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Osteopontina | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Tabela 1: Proteínas ECM e sequências de peptídeos derivados.
| Reagente | Concentração Inicial | Volume (μL) | Concentração Final |
| Solução HA-SH | 10 mg/mL | 2300 | 5 mg/mL |
| PEG-SH | 100 mg/mL | 503 | Varia por experimento |
| PEG-Norbornene | 100 mg/mL | 443 | Varia por experimento |
| Peptídeo | 4 μM | 288 | 0,250 μM |
| Colo | 4 mg/mL | 288 | 0,25 mg/mL |
| HEPES-HBSS | N/A | 798 |
Tabela 2: Componentes típicos de formulação final para hidrogel.
| Variável | Parâmetro |
| F | Força |
| E | Módulo de Young |
| ν | Razão de Poissons |
| δ | Recuo (posição de ponta vertical) |
| um | Raio do círculo de contato |
| RS | Raio de Esfera |
Tabela 3: Variáveis e parâmetros correspondentes para cálculos AFM.
Arquivo suplementar 1: Orientação sobre o uso do Array LED para iluminação e fotocrosslinking de hidrogéis. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 1: arquivo Arduino para microcontrolador de matriz LED (Arduino.zip). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 2: Drivers terceirizados para Arduino nano (Drivers.zip). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 3: Arquivo de processamento para controle de GUI do microcontrolador de matriz LED (GUI.zip). Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 4: Arquivo para suporte externo de impressão 3D para microcontrolador de matriz LED (Holder.zip). Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
O trabalho atual apresenta métodos para gerar culturas miniaturizadas em 3D dentro da HA, alterando simultaneamente a rigidez matricial e peptídeos disponíveis para engajamento integrin. Essa técnica permite o estudo sistemático de como os parâmetros matriciais afetam fenótipos celulares (por exemplo, a viabilidade das células cancerígenas expostas à quimioterapia) com aumento do rendimento. Abordagens anteriores, incluindo as aqui apresentadas, têm afinado a rigidez do hidrogel variando a porcentagem de polímero total na formulação final, onde hidrogéis mais rígidos têm um teor de polímero mais alto21,31. No entanto, essa abordagem requer a preparação de uma formulação única de hidrogel para cada rigidez desejada, um processo que intrinsecamente reduz o throughput. Aqui, a rigidez do hidrogel é ajustada pela irradiação UV variada durante a ligação cruzada para que hidrogéis de múltiplas rigidezs possam ser obtidos a partir de uma única solução precursora. Os futuros praticantes que podem não ter a oportunidade de construir o iluminador personalizado descrito aqui podem facilmente substituir um dispositivo de cura de ponto UV comercialmente disponível e ajustar a iluminação à medida que diferentes setores de uma placa de poço são curados. A desvantagem de usar um dispositivo comercial de cura de manchas é a diminuição do rendimento em comparação com o iluminador personalizado. Uma limitação dos métodos atuais é que soluções únicas ainda devem ser preparadas para cada condição de peptídeo. Métodos semelhantes têm sido usados anteriormente por outros grupos para produzir hidrogéis contendo gradiente de rigidez37,38. No entanto, este estudo demonstra como o fotocrosslinking pode permitir a miniaturização de amostras experimentais e reduzir a complexidade das configurações experimentais. No geral, essas melhorias permitirão que os pesquisadores aumentem o throughput experimental ao conduzir culturas 3D em biomateriais matricéticos e tenham utilidade em vários campos da ciência biomédica além da neuro-oncologia.
Os resultados representativos demonstram como essa técnica pode ser usada para configurar culturas 3D miniaturizadas de células GBM derivadas do paciente em matrizes definidas, nas quais peptídeos e rigidezs disponíveis são variados, dentro de uma placa padrão 384-well apropriada para vários ensaios padrão. Este método apresenta resultados representativos para examinar como os parâmetros matriciais afetam as respostas à quimioterapia TMZ em células GBM derivadas de dois pacientes únicos, denotados como células GS122 e GS304. Das duas linhas celulares derivadas do paciente aqui avaliadas, a resposta das células GS122 ao tratamento do TMZ foi sensível ao microambiente matricial, enquanto a das células GS304 foi insensível. Em relação à rigidez matricial, as células GS122 cultivadas em hidrogéis 3D com um módulo micro-compressivo de 4 kPa maximizaram a resistência ao TMZ, sob a qual as células tratadas de condição aumentaram em número mais do que células não tratadas durante um curso experimental de 7 dias. As propriedades mecânicas tiveram efeitos maiores na resistência do TMZ do que os peptídeos de ligação integrin incluídos. Assim, espera-se que o impacto de diferentes concentrações de peptídeos, isoladas e em combinação, possibilite a descoberta de condições matriciais que promovam a resistência às drogas no futuro. A insensibilidade das células GS304 à sua matriz circundante pode indicar que a matriz é mais influente nas células, como as células GS122, que são originalmente sensíveis ao TMZ e ainda adquirem resistência durante o tratamento. Em contraste, não está claro até que ponto as pistas matriciais afetam as células que já são resistentes ao tratamento no início do experimento, como acontece com as células GS304.
Os resultados deste estudo desviaram-se um pouco dos resultados relatados anteriormente. Os hidrogéis mais macios baseados em HA avaliados (1 kPa bulk Young's modulus, imitando a rigidez do cérebro nativo) promoveram células GBM de resistência máxima TMZ derivadas de quatro tumores de pacientes diferentes do que o avaliado aqui21. Há várias razões possíveis para essa discrepância. Primeiro, uma gama expandida de rigidezs de hidrogel foi interrogada no presente estudo, que comparou hidrogéis em uma faixa de 0,8 kPa a 8 kPa micro-compressivo moduli, enquanto estudos anteriores compararam apenas hidrogéis com 1 kPa e moduli de 2 kPa Young. Além disso, nos estudos anteriores, a caracterização mecânica foi feita na escala a granel utilizando compressão mecânica linear para estimar o módulo de Young, enquanto, neste estudo, a AFM foi utilizada para medir um módulo microcomprimirpressor. Para pesquisadores que buscam implementar os métodos aqui presentes que não requerem medições mecânicas em microes em escala, moduli em escala a granel, utilizando reometria ou teste mecânico linear, são substitutos perfeitamente aceitáveis para a AFM. Notavelmente, análises micromecânicas revelaram o moduli heterogêneo através da superfície de um único gel. Medidas comparáveis da AFM sobre os hidrogéis formulados em estudos anteriores não foram feitas, mas espera-se que a variância das rigidezs apresentadas dentro de um único hidrogel tenha sido maior do que as do presente estudo. Hidrogéis nos estudos anteriores foram gerados utilizando-se uma adição do tipo Michael, dependente da mistura cinética a 37 graus C 10,21,24. Em contraste, o fotocrosslinking permite a mistura completa de precursores de hidrogel antes da exposição à luz, o que melhora a homogeneidade dentro do hidrogel 3D e, por sua vez, reduz a variabilidade das respostas celulares. Finalmente, os tumores GBM apresentam comportamento notoriamente heterogêneo e imprevisível39 e, portanto, é razoável esperar que as células derivadas de tumores individuais também tenham propriedades únicas. Essa falta de consistência entre as amostras de pacientes motiva a necessidade de uma plataforma de alto rendimento para elucidar características tumorais específicas do paciente.
As armadilhas comuns ao realizar o procedimento de fotocrosslinking de hidrogel miniaturizado incluem a mistura incompleta de precursores de hidrogel, resultando em baixa reprodutibilidade e gelação espontânea da solução HA durante a mistura. Essas questões podem ser atenuadas agitando o HA-thiol por um mínimo de 45 min e a solução precursora completa por pelo menos 30 minutos adicionais enquanto monitora de perto o pH de soluções precursoras de hidrogel para garantir que ele permaneça abaixo de 7 para evitar a oxidação de tiol e a formação de dissulfeto para crosslinks. Em contraste com os métodos de crosslinking usando um mecanismo de adição cinético do tipo Michael10,21, o método de fotocrosslinking usado neste protocolo reduz a probabilidade de gelação espontânea quando todos os reagentes são combinados21. Os pontos de verificação de qualidade são altamente recomendados, como medir a porcentagem de tiaolaçãoHA 31 e fazer hidrogéis extras para testes mecânicos paralelos a cada lote de culturas 3D. Finalmente, as densidades de semeadura para encapsulamento 3D em hidrogéis precisam ser identificadas para cada tipo de célula ou linha utilizada. Geralmente, os resultados mostram que uma concentração mínima de 1 milhão de células/mL é suficiente para a cultura 3D da maioria das células, que formam esferoides, incluindo células GBM derivadas do paciente, células-tronco embrionárias humanas (H9) e células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (dados não mostrados). A inclusão do tratamento inibidor de ROCHA antes do encapsulamento (etapa 4.1) ao usar células particularmente sensíveis também é recomendada40.
No contexto do desenvolvimento de novas abordagens de tratamento para o GBM, o protocolo aqui apresentado fornece métodos para triagem funcional das respostas medicamentosas de células GBM derivadas do paciente dentro de um microambiente fisiologicamente relevante. Um rico repositório de dados de expressão genética, epigenética e clínica de mRNA para GBM (e outros cânceres) está disponível publicamente graças aos esforços do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) e outros15. Utilizadas em conjunto com esses grandes conjuntos de dados, espera-se que os dados gerados a partir de telas funcionais de culturas 3D miniaturizadas possam revelar novas correlações, melhorando a previsão de desfechos clínicos em pacientes individuais. Por exemplo, podem ser identificadas subpopulações de tumores de pacientes para os quais algum tratamento, como compostos que interrompem a matriz, como o cilengitide, podem melhorar os resultados clínicos41. Além da resposta a medicamentos, esta plataforma de cultura permite avaliações de invasão de células tumorais usando imagens compatíveis com placas de alto conteúdo. A flexibilidade desta plataforma para incorporar muitos peptídeos diferentes, sozinhos ou em combinação, enquanto rigidezs ortogonalmente variadas podem ajudar a identificar características matriciais que conduzem a agressão tumoral GBM.
Além do GBM, esses métodos podem ser adaptados para investigar os efeitos dos parâmetros matriciais em outros tipos celulares no contexto de outras doenças, desenvolvimento tecidual e função tecidual normal. No futuro, será simples aumentar ainda mais o throughput desses métodos, uma vez que eles foram especificamente projetados para serem executados no contexto de placas multi-poços para facilitar a adoção em fluxos de trabalho existentes para a descoberta de medicamentos, utilizando manipuladores líquidos automatizados comercialmente disponíveis e imagers de alto conteúdo. A integração fácil com a infraestrutura existente e o aumento da automação, que diminui as habilidades técnicas necessárias para produzir e manter culturas de hidrogel 3D carregadas de células, diminuirão significativamente as barreiras à adoção desse método. Embora o trabalho aqui apresente especificamente culturas dentro de hidrogéis baseados em HA, espera-se que este método possa ser facilmente traduzido para outros materiais fotocrosslinkáveis comumente usados para a cultura celular 3D, como a gelatina metacrilatada, e que os métodos aqui relatados fornecerão uma diretriz útil para aplicações adicionais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer especificamente Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore e Itay Solomon por suas contribuições para iterações anteriores do esquema de fotogelação. As linhas de celular GS122 e GS304 foram generosamente fornecidas por David Nathanson. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. As instalações centrais da UCLA, os Recursos Compartilhados de Triagem Molecular e o Laboratório de Caracterização de Nano e Pico foram fundamentais para o trabalho. Chen Chia-Chun foi apoiado pelo UCLA Eli e Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Program. Grigor Varuzhanyan foi apoiado por um programa de treinamento de biologia celular tumoral NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM - F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
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