Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Hydrogel arrays möjliggör ökad genomströmning för screeningeffekter av matriskomponenter och terapier i 3D-tumörmodeller

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63791
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1University of California Los Angeles

Summary

Detta protokoll beskriver en experimentell plattform för att bedöma effekterna av mekaniska och biokemiska ledtrådar på kemoterapeutiska svar från patient-härledda glioblastomceller i 3D-matris-mimetiska kulturer med hjälp av en skräddarsydd UV-belysningsanordning som underlättar fotokorslänkning med hög genomströmning av hydrogeler med avstämbara mekaniska egenskaper.

Abstract

Cellmatrisinteraktioner förmedlar komplexa fysiologiska processer genom biokemiska, mekaniska och geometriska ledtrådar, vilket påverkar patologiska förändringar och terapeutiska svar. Redovisning av matriseffekter tidigare i läkemedelsutvecklingspipelinen förväntas öka sannolikheten för klinisk framgång för nya terapier. Biomaterialbaserade strategier som rekapitulerar specifika vävnadsmikromiljöer i 3D-cellodling finns men att integrera dessa med de 2D-odlingsmetoder som främst används för läkemedelsscreening har varit utmanande. Således beskriver protokollet som presenteras här utvecklingen av metoder för 3D-odling inom miniatyriserade biomaterialmatriser i ett flerbrunnsplattformat för att underlätta integration med befintliga läkemedelsscreeningsrörledningar och konventionella analyser för cellviabilitet. Eftersom matrisens egenskaper som är kritiska för att bevara kliniskt relevanta fenotyper i odlade celler förväntas vara mycket vävnads- och sjukdomsspecifika, kommer kombinatorisk screening av matrisparametrar att vara nödvändig för att identifiera lämpliga förhållanden för specifika tillämpningar. Metoderna som beskrivs här använder ett miniatyriserat odlingsformat för att bedöma cancercellsvar på ortogonal variation av matrismekanik och ligandpresentation. Specifikt visar denna studie användningen av denna plattform för att undersöka effekterna av matrisparametrar på svaren från patient-härledda glioblastom (GBM) celler till kemoterapi.

Introduction

Den förväntade kostnaden för att utveckla ett nytt läkemedel har stadigt ökat under det senaste decenniet, med över 1 miljard dollar i nuvarande uppskattningar1. En del av denna kostnad är den höga felfrekvensen för läkemedel som går in i kliniska prövningar. Cirka 12% av läkemedelskandidaterna får slutligen godkännande från USA (US) Food &Drug Administration (FDA) under 2019. Många läkemedel misslyckas i fas I på grund av oväntad toxicitet2, medan andra som klarar säkerhetsstudier kan misslyckas på grund av brist på effekt3. Denna förslitning på grund av bristande effekt kan delvis förklaras av det faktum att cancermodeller som används under läkemedelsutveckling är notoriskt icke-prediktiva för klinisk effekt4.

Funktionella skillnader mellan in vitro- och in vivo-modeller kan hänföras till att cancerceller avlägsnas från deras ursprungliga mikromiljö, inklusive icke-tumörceller och den fysiska ECM 5,6. Vanligtvis använder forskargrupper kommersiellt tillgängliga odlingsmatriser, såsom Matrigel (en proteinhaltig källarmembranmatris härledd från mussarkom) för att ge odlade tumörceller en 3D-matrismikromiljö. Jämfört med 2D-odling har 3D-odling i membranmatris förbättrat den kliniska relevansen av in vitro-resultat 7,8. Odlingsbiomaterial från decellulariserade vävnader, inklusive membranmatrisen, uppvisar emellertid vanligtvis batch-till-batch-variabilitet som kan äventyrareproducerbarheten 9. Dessutom kan matriser som härrör från tumörer med olika vävnadsursprung än de studerade kanske inte ge lämpliga fysiologiska ledtrådar10. Slutligen har cancer med höga grader av intratumoral heterogenitet mikromiljöegenskaper som varierar på en submikronstorleksskala och som membranmatrisen inte kan ställas in för att rekapitulera11.

Glioblastom (GBM), en enhetligt dödlig hjärntumör med en medianöverlevnadstid på cirka 15 månader, är en cancer för vilken behandlingsutvecklingen har varit särskilt svår 12,13. Den nuvarande vårdstandarden för GBM består av primär tumörresektion, följt av strålbehandling, och sedan kemoterapi med temozolomid (TMZ)14. Ändå uppvisar mer än hälften av kliniska GBM-tumörer behandlingsresistens genom olika mekanismer 15,16,17. Att förutsäga effekten av en behandlingsregim för en enskild patient är extremt svårt. Standard prekliniska modeller som används för att förutsäga individuella utfall består av patient-härledda tumörceller xenograferade ortotopiskt till immunkomprometterade möss. Medan patient-härledda xenografter kan rekapitulera många aspekter av kliniska GBM-tumörer och är värdefulla för prekliniska modeller18, är de i sig dyra, låg genomströmning, tidskrävande och involverar etiska problem19. Kulturer av patient-härledda celler, på 2D-plastytor eller som sfäroider, undviker oftast dessa problem. Medan patient-härledda celler bevarar genetiska avvikelser, har deras kulturer i 2D eller som suspenderade sfäroider till stor del varit dåliga representationer av patient-härledda xenografter hos gnagare och ursprungliga patienttumörer20. Tidigare har vi, och andra, visat att GBM-celler odlade i en 3D ECM som efterliknar de mekaniska och biokemiska egenskaperna hos hjärnvävnad kan bevara läkemedelsresistensfenotyper 10,21,22,23.

Interaktioner mellan hyaluronsyra (HA), en polysackarid som är riklig i hjärnan ECM och överuttryckt i GBM-tumörer, och dess CD44-receptor modulerar förvärvet av läkemedelsresistens in vitro 21,24,25,26,27. Till exempel ökade inkluderingen av HA i mjuka 3D-kulturer förmågan hos patient-härledda GBM-celler att förvärva terapeutisk resistens. Denna mekano-responsivitet var beroende av HA-bindning till CD44-receptorer på GBM-celler21. Dessutom förstärkte integrinbindning till RGD-bärande peptider, införlivade i 3D-odlingsmatriser, CD44-medierad kemoresistans på ett styvhetsberoende sätt21. Utöver HA varierar uttrycket av flera ECM-proteiner, många innehållande RGD-regioner, mellan normal hjärna och GBM-tumörer28. Till exempel rapporterade en studie att 28 distinkta ECM-proteiner uppreglerades i GBM-tumörer29. Inom denna komplexa tumörmatrismikromiljö integrerar cancerceller mekaniska och biokemiska ledtrådar för att ge en viss resistensfenotyp, vilket beror på relativt små skillnader (t.ex. mindre än en storleksordning) i Youngs modul eller densitet av integrinbindande peptider 28,29,30.

Det aktuella protokollet karakteriserar hur tumörceller tolkar unika kombinationer av matrissignaler och identifierar komplexa, patientspecifika matrismikromiljöer som främjar behandlingsresistens (Figur 1A). En fotokemisk metod för att generera miniatyriserade, exakt avstämda matriser för 3D-kultur ger ett stort, ortogonalt variabelt utrymme. En specialbyggd uppsättning lysdioder, som drivs av en mikrokontroller, införlivades med fotocrosslänkhydrogeler i ett 384-brunnsplattformat för att öka automatiseringen och reproducerbarheten. Exponeringsintensiteten varierades över brunnen för att ändra mikromekaniska egenskaper hos resulterande hydrogeler, enligt bedömning med hjälp av atomkraftmikroskopi (AFM). Även om detta manuskript inte fokuserar på att konstruera själva belysningsuppsättningen, tillhandahålls ett kretsschema (figur 1B) och en reservdelslista (materialtabell) som hjälpmedel för enhetsreproduktion.

Denna rapport visar den snabba genereringen av en rad GBM-celler odlade i unika 3D-mikromiljöer där Youngs modul (fyra nivåer över en enda storleksordning) och integrinbindande peptidinnehåll (härledd från fyra olika ECM-proteiner) varierades ortogonalt. Metoden användes sedan för att undersöka de relativa bidragen från hydrogelmekanik och ECM-specifikt integrinengagemang på livskraften och spridningen av patient-härledda GBM-celler när de förvärvar resistens mot temozolomid (TMZ) kemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Patient-härledda GBM-cellinjer (GS122 och GS304) tillhandahölls av professor David Nathanson (vår samarbetspartner), som utvecklade dessa linjer enligt ett protokoll som godkänts av UCLA Institutional Review Board (IRB # 10-000655). Celler avidentifierades så att cellinjerna inte kunde kopplas tillbaka till de enskilda patienterna.

1. Beredning av hydrogellösning

  1. Förbered HEPES-buffrad lösning genom att lösa upp HEPES-pulver vid 20 mM i Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Justera pH till 7 efter full solvation.
  2. Lös upp isolerad HA (700 kDa nominell molekylvikt, se materialtabell), beredd enligt föregående rapport31, i den hepes-buffrade lösningen, så att 6%-8% av karboxylsyraresterna på varje glukuronsyra modifieras med en tiol, i en koncentration av 10 mg / ml i buffertlösning.
    OBS: En bärnstensfärgad injektionsflaska rekommenderas för att förhindra tioloxidation genom omgivande ljus.
    1. Rör om med en magnetisk omrörningsplatta (<1 000 rpm) vid rumstemperatur tills den är helt upplöst, vanligtvis cirka 45 minuter.
  3. Medan HA löses upp, bered separata lösningar av (1) 100 mg/ml 8-arm-PEG-Norbornene (20 kDa), (2) 100 mg/ml 4-arm-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM cystein eller cysteinhaltig peptid (t.ex. GCGYGRGDSPG) och (4) 4 mg/ml LAP i mikrocentrifugrör (se materialtabell).
    1. Förbered var och en av dessa fyra lösningar i den HEPES-buffrade lösningen som bereddes i steg 1.1. Vortex lösningarna för att säkerställa full upplösning av varje reagens innan du utför steg 4.
      OBS: Om du testar flera olika peptider måste var och en innehålla en cystein eller annan källa till tioldel för denna konjugeringskemi.
    2. Förbered lösningar (4 mM tillgänglig tiol) av alla peptider som ska bindas i en enda hydrogel vid denna tidpunkt.
      OBS: Peptidsekvenser och ECM-proteiner från vilka de härleddes och användes i denna studie listas i tabell 1. N-acetylcystein (se materialtabell), till vilken celler inte binder, kan ersättas med en bioaktiv, tiolhaltig peptid för att titrera koncentrationen av en adhesiv peptid eller fungera som en negativ kontroll31.
  4. Blanda de individuella lösningarna av HA, PEG-Norbornene, PEG-tiol och cystein/tiolinnehållande peptider (se materialtabell) för att uppnå de slutliga koncentrationerna för de slutliga hydrogelmatriserna som anges i tabell 2. Rör om (<1 000 rpm) på en magnetrörplatta i minst 30 minuter för att blanda helt.
    OBS: HA-lösningar är mycket viskösa och hanteras bäst med en positiv förskjutningspipett (se materialtabell). Om en positiv förskjutningspipett inte är tillgänglig kan viskösa lösningar också undvikas med en standardmikropipett genom att långsamt pipettera med hjälp av breda öppningsspetsar.

2. Belysning och fotokorslänkning av hydrogeler via en LED-array

VARNING: Använd UV-skyddande glasögon och täck belysningsfältet med UV-absorberande material.

OBS: LED-matrisen som beskrivs i detta protokoll består av sex uppsättningar med åtta lysdioder placerade i serie, vilket illustreras av det medföljande kretsschemat (figur 1A). Varje uppsättning lysdioder kan drivas oberoende, vilket möjliggör upp till sex olika bestrålningar per körning. Tilläggsfil 1 innehåller skärmdumpar som motsvarar följande anvisningar för ytterligare vägledning.

  1. Ladda ner Illumination Device.zip-filen från de kompletterande kodningsfilerna. Den här katalogen innehåller följande filer: Arduino.zip (Supplementary Coding File 1), Drivers.zip (Supplementary Coding File 2), GUI.zip (Supplementary Coding File 3) och Holder.zip (Supplementary Coding File 4).
    OBS: 3D Skriv ut de övre och nedre delarna för att hålla kretskortet på plats (se Kompletterande kodningsfiler för mer information).
  2. Ladda ner och installera programvaran för mikrokontroller (se materialtabell).
  3. Ladda ner och installera GUI-programvaran (se Materialförteckning). Se Tilläggsfil 1 för instruktioner för programvara.
  4. Öppna Bearbetning och installera controlIP5-biblioteket genom att klicka på Skiss > Importera bibliotek > Lägg till bibliotek. Sök sedan efter controlIP5 i bibliotek och klicka på Installera. Utför detta för första gången.
  5. Strömförsörj belysningsenheten (se materialtabell) med 36 Volts strömförsörjning och anslut den till en dator med en mikro-USB-kabel.
    OBS: Vissa enheter installerar inte drivrutiner automatiskt för olika Arduino nano-kort. En uppsättning drivrutiner finns i enhetens zip-fil.
  6. Öppna filen Arduino.ino, som finns i mappen Adruino.zip, med Arduino IDE.
  7. Kompilera filen Arduino.ino genom att klicka på knappen Bock. Ladda upp den kompilerade koden genom att klicka på pilknappen .
  8. Öppna filen GUI.pde, som finns i mappen GUI.zip, med bearbetning.
  9. Klicka på Kör i bearbetningsprogrammet för att starta det grafiska användargränssnittet för att styra belysningsenheten.
  10. I det grafiska användargränssnittsfönstret klickar du på Intensitet för att kolumnen som innehåller hydrogelprekursorlösning ska tvärbindas och mata in önskad intensitet. Klicka på rutan Tid och ange önskad tid. För lösningen i tabell 2 kommer detta att vara 15 s.
    Slutanvändare måste kalibrera digitala intensitetsvärden till bestrålning med hjälp av en radiometer. Exempel på typiska intensiteter ges i figur 2A.
  11. Rikta in proverna med belysningsanordningen (figur 2B) med varannan lysdiod i en enda kolonn av silikonformarna (se materialtabell) eller 384-brunnsplattan. Klicka på Slutför för att börja belysningen. Upprepa denna process vid behov för belysning av flera objektglas eller andra brunnar på en 384-brunnsplatta.
    OBS: Hållaren är utformad så att 384-brunnsplattan sitter i jämnhöjd med ett hörn av den inre kammaren under belysning.
    1. Efter belysning, när den placeras i ett hörn, flytta brunnsplattan till nästa hörn och upprepa. För att belysa brunnar på den andra halvan av plattan, lyft plattan ur hållaren och rotera 180 °.
  12. Generera hydrogeler med varierande mekanik för mekanisk karakterisering enligt stegen nedan.
    1. Rengör glasskivorna och silikonformarna med tejp för att ta bort skräp. Fäst silikonformarna på glasskivan, tryck ner för att säkerställa en bra tätning och förskjut eventuella luftbubblor.
    2. Pipettera 80 μL hydrogelprekursorlösning, som bereddes i steg 1.4, i varje silikonform på glasskivan.
    3. Placera glasskivan på belysningsenheten i linje med varannan lysdiod i en enda kolumn. Utsätt hydrogelprekursorerna för UV-ljus i 15 s, som beskrivs i steg 2, för fotokrysslänk.
    4. När belysningen har upphört, hämta bilderna och lossa gelerna från formarna genom att spåra formens inre omkrets med en fin spets (10 μL pipettspets, 30 G nål, etc.). Ta bort silikonformar med pincett/pincett.
    5. Flytta tvärbundna hydrogeler till enskilda brunnar på en 12-brunnsplatta genom att väta en spatel och försiktigt skjuta dem från glasskivan. Fyll varje brunn med 2 ml DPBS (se materialtabell) innan du tillsätter hydrogelen. Sväll gelerna i DPBS-lösning i minst 12 timmar (vanligtvis över natten) vid rumstemperatur (för nästa dags mekaniska karakterisering).

3. Mätningar av atomkraftsmikroskopi (AFM)

  1. Slå på atomkraftmikroskopet (AFM) enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). Detta protokoll innehåller korta instruktioner för användning av instrumentet och tillhörande programvara.
  2. Installera AFM-sonden (se materialtabell).
    OBS: För den aktuella studien modifierades en triangulär kiselnitrid cantilever med en nominell fjäderkonstant på 0,01 N / m med en sfärisk 2,5 μm kiseldioxidpartikel.
  3. Efter installationen justerar du lasern till toppen av den triangulära sonden och justerar sedan spegel- och laserböjningen för att maximera signalsumman (vanligtvis mellan 1,5-2,2 volt).
  4. Sänk ner sonden i DPBS och vänta i upp till 15 minuter för att uppnå termisk jämvikt. Klicka på knappen Kalibrering och välj Kontaktberoende kalibrering. Klicka på knappen Samla in termisk inställning och välj toppen runt 3 kHz efter datainsamling för kalibrering.
    OBS: Liten justering av spegeln och laseravvisarna kan vara nödvändig efter nedsänkning i en vätska på grund av förändringar i brytningsindex.
  5. Närma dig ytan på en petriskål (plast) genom att ställa in inflygningsparametrarna till konstant hastighet, en målhöjd på 7,5 μm och en inflygningshastighet på 15 μm / s. Aktivera baslinjemätning per körning för inflygning så att metoden körs kontinuerligt och inte stoppas tidigt på grund av drift i deflektorn.
  6. Vid inflygning ställer du in förvärvsparametrar för kraftmappning till 4 nN-vändningar, 2 μm indragningsavstånd, 1 μm / s hastighet och 0 s kontakttid. Tryck på Start-knappen för att börja samla upp en kraftkurva på plastytan (t.ex. en brunnsplatta).
  7. Återgå till kalibreringsfönstret och välj den del av kraftkurvan som motsvarar plastens kontakt och indragning. Acceptera de beräknade känslighets- och styvhetsvärdena för att sonden ska slutföra kalibreringen.
  8. Efter kalibrering, höj AFM-sonden och placera hydrogelprovet för förhör. Närma dig hydrogel enligt inställningarna i steg 5.
    OBS: Under inflygningsproceduren mot hydrogelytan kan enheten felaktigt utlösa det närmade tillståndet. För att verifiera det faktiska tillvägagångssättet, få en kraftkurva som i steg 4.6. Upprepa inflygningsproceduren om den resulterande kurvan inte visar kontakt och resulterande indrag.
  9. När ytmetoden är framgångsrik växlar du till Force Mapping-läget och ställer in förvärvsparametrar till en karta med 8 x 8 storlek med 40 μm längd per axel. Skaffa kraftkartor i olika regioner för att bedöma enhetligheten i styvhetsmätningar.
    1. Tolka kraftkurvor med hjälp av programvaran JPK SPM Data Processing genom en Hertz/Sneddon-modellpassning (ekvationerna 1 och 2, se tabell 3 för definitionen av alla variabler) med den sfäriska geometrin vald 32,33,3 4.
      Equation 1Ekvation 132
      Equation 2Ekvation 232

4. Upprättande och läkemedelsbehandling av 3D, matrisinbäddade kulturer

  1. Förbered önskade celler som en enda celllösning.
    OBS: Olika celltyper kan kräva olika passeringsmetoder. Ett typiskt protokoll för att överföra en suspensionskultur av GBM-sfäroider från en T-75-kolv rapporteras i referens31.
  2. Samla GBM-sfäroider (ungefär 150 μm i diameter) från en T-75-kolvsuspensionskultur till ett 15 ml koniskt rör. Skölj odlingskolven med 5 ml DPBS för att avlägsna eventuella kvarvarande celler och medier och tillsätt denna volym till det koniska röret.
  3. Centrifugera det koniska röret som innehåller celler vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugering, ta bort supernatanten med en 5 ml serologisk pipett, var noga med att inte störa cellpelleten och återsuspendera i 5 ml DPBS.
  4. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid rumstemperatur för att tvätta cellerna. Aspirera supernatanten med en 5 ml serologisk pipett, var noga med att inte störa cellpelleten och sedan återsuspendera celler i 2 ml celldissociationsreagens (se materialtabell).
  5. Inkubera vid rumstemperatur i 10-15 min. Tillsätt 3 ml komplett medium (se materialtabell) och pipettera försiktigt 3-5 gånger för att bryta ner sfäroiderna till en enda cellsuspension31.
  6. Centrifugera encellssuspensionen vid 400 x g (encellssuspensioner kan snurras snabbare för pelletsbildning) i 5 min till pelletsceller vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten med en 5 ml serologisk pipett, var noga med att inte störa cellpelleten. Resuspend celler i 1 ml komplett medium.
    OBS: Om cellerna förblir i klumpar, snarare än som enskilda celler i suspension, efter passaging, kan celler passera genom en 40 μm cellsil för att uppnå en enda cellsuspension.
  7. Ta bort en del av cellerna för räkning med hjälp av en hemocytometer. Späd denna del tvåfaldigt med trypanblå, som genomtränger celler med nedsatt livskraft. Räkna bara de levande, färglösa cellerna. Vanligtvis ger en T-75 sådd vid 800 000 celler per kolv 2-3 miljoner celler efter en vecka i odling.
  8. Bestäm antalet celler som är nödvändiga för inkapsling. Överför en volym media som innehåller det totala antalet celler som behövs till ett sterilt 1,7 ml mikrocentrifugrör. Snurra ner vid 400 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    OBS: Till exempel behövs minst 2,5 miljoner celler som återförstå i 1 ml gelvolym för att kapsla in celler vid 2,5 miljoner celler / ml. En gelvolym på 1 ml gör det möjligt för användare att dispensera 100 geldroppar, där varje geldroppe har en volym på 10 μl. Att förbereda en extra ~ 20% volym celler suspenderade i hydrogellösning rekommenderas för att redovisa förlust under pipettöverföring. Således skulle man förbereda 3 miljoner celler och 1,2 ml hydrogelprekursorlösning i detta exempel. En minsta densitet på 500 tusen celler / ml rekommenderas.
  9. Aspirera supernatanten med en mikropipett, var noga med att inte störa cellpelleten. Resuspendera cellpelleten i hydrogelprekursorlösningen, som bereddes i steg 1.4, blanda väl genom att pipettera upp och ner med en 1 000 μL mikropipett 4-5 gånger.
  10. Ladda cellerna i en upprepad pipettor (se materialtabell) inställd på att dosera 10 μL. För att undvika bubblor och ojämn dosering, fyll på den upprepade pipetten genom att dosera ytterligare 1-2 gånger i en avfallsbehållare.
  11. I varje brunn på en 384-brunnsplatta, dispensera 10 μL celler suspenderade i hydrogellösning från den upprepade pipettorn. Använd LED-matrisen och belys varje brunn som innehåller celler (steg 2) i 15 s med intensiteter (exempelresultat i figur 2A utnyttjade intensiteter på 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW / cm2) för att uppnå önskade mekaniska egenskaper.
    Vi rekommenderar att du börjar med fem replikat per experimentellt tillstånd och skalar upp eller ned beroende på önskat dataflöde och varians för slutpunktsanalysen.
  12. Tillsätt 40 μl komplett media till varje brunn som innehåller cellerna. Tillsätt 50 μL DPBS till icke-experimentella, torra brunnar som omger gelerna för att minimera förluster på grund av avdunstning.
  13. För GBM-celler, tillsätt 40 μL av det medieinnehållande läkemedlet (t.ex. TMZ, se materialtabell) för att uppnå den slutliga önskade koncentrationen (10 μM-100 μM i dimetylsulfoxid (DMSO) eller vehikel (DMSO), följaktligen med början 3 dagar efter inkapsling.

5. CCK8 spridningsanalys

  1. Tillsätt 10 μL CCK8-reagens (se materialtabell) till varje brunn som innehåller cellerna.
    OBS: Om du utför denna analys för första gången, inkludera negativa kontrollbrunnar som endast media eller cellfri hydrogel i media.
  2. Inkubera i 1-4 timmar enligt tillverkarens instruktioner.
    OBS: Denna tid kan variera som en funktion av celltyp och densitet, och därför måste inkubationstiderna testas för varje applikation så att absorbansvärdena faller inom ett linjärt intervall, ett krav för att tillämpa Öls lag35.
  3. Avläs absorbanser vid 450 nm för alla brunnar efter inkubation.
  4. Beräkna den genomsnittliga absorbansen vid 450 nm som erhålls i steg 3 för vehikeltillståndet för varje grupp. Dela varje läkemedelsbehandling väl med genomsnittet av vehikelkontrollen per grupp.
  5. Beräkna konfidensintervall genom att generera bootstrapfördelningar (N = 10 000) genom percentilmetoden36.
    OBS: I allmänhet kan man använda 95% konfidensintervall och tolka förhållanden vars konfidensintervall inte passerar över 1 för att vara signifikanta och motivera ytterligare undersökning. Att ställa in konfidensintervall till 95% är kongruent med att ställa in en signifikansavgränsning på p = 0,05. För de data som visas i resultaten finns det nytta i att särskilja förhållanden som antingen främjar eller hämmar matrismedierad läkemedelsresistens, vilket kräver en tvåsidig analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AFM-mätningar bekräftade exakt kontroll av hydrogelmekanik som en funktion av UV-bestrålning (mW / cm2) under fotokorsbindning med hjälp av en specialbyggd, Arduino-styrd LED-array (figur 2A). Hydrogelformuleringen som används i detta protokoll finns i tabell 2. Avståndet mellan lysdioderna på den medföljande mallen matchar avståndet för varannan brunn på en 384-brunnsplatta, vilket möjliggör bildning av geler inuti plattan (figur 2B). AFM-förhör av mikronskala regioner vid ytorna av enstaka hydrogeler visade att hydrogeler med mjukare medelvärde Youngs moduli också hade mindre moduliområden än styvare hydrogeler (figur 2C-E).

Cell sådddensiteter som maximerar livskraften bör bestämmas empiriskt för varje celltyp. Denna studie visar att 3D-kulturer av GS122-celler som såddes vid densiteter på 2 500 000 celler/ml uppvisade väsentligt högre viabilitet när de bedömdes efter 7 dagar i odling jämfört med de som såddes vid densiteter på 500 000 celler/ml (figur 3A). Vidare användes GS122- och GS304-celler som modeller för odling av patient-härledda GBM-celler för att undersöka beroendet av kemoterapisvar på styvheten och den biokemiska sammansättningen av matrismikromiljön (figur 3B-D). Cellviabiliteten bedömdes genom CCK8-analysen efter behandling med TMZ i 4 dagar vilket ledde till en total odlingstid på 7 dagar genom skalning av OD450-mätning med motsvarande vehikelkontroll och genererade 95% konfidensintervall genom bootstrapping (N = 10 000) med percentilmetoden36. Med dessa fördelningar ansågs förhållanden där konfidensintervall inte överlappade med ett värde på 1 (streckad linje) vara signifikanta. Jämfört med mer vanliga statistiska metoder som t-tester eller ANOVA är uppskattning av konfidensintervall, med hjälp av bootstrapping för att uppskatta fördelningar som skulle finnas för större provstorlekar, att föredra för screeninganalyser vars mål är att identifiera en mindre delmängd av förhållanden för vidare undersökning. En ytterligare fördel med denna metod är att förhållanden med en mindre spridning i ett konfidensintervall kan prioriteras framför andra förhållanden med ett liknande medelvärde men en högre spread i konfidensintervallet. Denna studie indikerade att GS122-celler fick överlevnadsfördelar från mikromiljöinteraktioner (figur 3B). Denna överlevnadsfördel var signifikant i 0,8, 1 och 4 kPa tillstånd men inte i 8 kPa-tillståndet för GS122-celler. GS304-cellerna var okänsliga för både stelhet och TMZ-behandling.

Effekten av den biokemiska sammansättningen av matrismikromiljön undersöktes sedan genom att variera inkluderingen av ECM-härledda, integrinbindande peptider (tabell 1) som är kända för att vara uppreglerade i GBM-tumörmikromiljön vid två styvheter, 0,8 kPa och 8 kPa. Återigen fick GS304-celler ingen signifikant överlevnadsfördel av matrisinkludering och var okänsliga för TMZ. GS122-celler visade emellertid överlevnadsvinster i 8 kPa-tillståndet när osteopontin-härledda peptider inkluderades i matrisen, medan införlivandet av integrinbindande sialoprotein (IBSP) - eller tenascin-C-härledda peptider gav minimala överlevnadsfördelar, såsom odling i matriser med den allmänna RGD-peptiden (figur 3C). Däremot gav inga peptider överlevnadsvinster i odlingstillståndet 0,8 kPa (figur 3D). Tillsammans tyder resultaten på inneboende skillnader i både matris- och läkemedelssvar mellan de två patienthärledda cellinjerna som utvärderats.

3D-hydrogelkulturer kan visualiseras med hjälp av standardljusmikroskopi för att bedöma hur cellmorfologi och invasiva beteenden påverkas av odlingsförhållanden på ett cellinjeberoende sätt (Figur 4). Både GS122- och GS304-celler sprids när de odlas i mjuka eller styva hydrogelmatriser inklusive RGD-innehållande peptider (figur 4A). Medan peptider påverkade cellspridning, förutsade en cells förmåga att sprida sig inte nödvändigtvis kulturens förmåga att förvärva TMZ-resistens. Till exempel visar GS122-celler en liknande brist på spridning i både 0,8 och 8 kPa med osteopontin; GS122 visade dock endast förbättrad resistens mot TMZ i 8 kPa-tillståndet (figur 4B). Slutligen kan denna miniatyriserade 3D-odlingsplattform användas för att odla mänskliga celler från andra tumörtyper, inklusive livskraftiga organoider av terminalt differentierade, neuroendokrina prostatacancerceller (Figur 4C).

Figure 1
Bild 1: Tecknad avbildning av protokollet. (1) HA-baserade hydrogellösningar framställs. (2) Hydrogellösningar tvärbinds sedan med variabel intensitet genom lysdioder som styrs av en Arduino-mikrokontroller. (3) Resulterande hydrogelmekanik bedöms av AFM för att verifiera skillnaden i gelmekanik. (4) Lösningar som matchar formuleringen från steg 1 används sedan för att kapsla in patient-härledda GBM-celler och behandlas med läkemedlet. (5) Efter 7 dagar läses cellviabiliteten ut via CCK8 kolorimetrisk analys. (B) Kretsschema för anpassad LED-belysningsmatris som används i detta protokoll. De enskilda komponenterna listas i materialförteckningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Hydrogeler tillverkade med varierande styvhet med hjälp av avstämbara lysdioder för att modifiera bestrålning. Youngs modul för varje hydrogel visas som en funktion av UV-bestrålning under fotokorslänkning. Horisontella vita linjer anger medianen för varje experimentgrupp. (B) LED-matris med avstånd som matchar tonhöjden på flerbrunnsplattor (384 brunnar). (C) Värmekarta som visar den regionala variationen av Youngs modul (medelvärde = 0,8 kPa) för en typisk gel tvärbunden genom exponering för 1,55 mW/cm2 i 15 s. (D) Värmekarta som visar den regionala variationen av Youngs modul (medelvärde = 8 kPa) för en typisk gel tvärbunden vid exponering för 2,74 mW/cm2 i 15 s. (E) Histogram som illustrerar intervallet för Youngs modulmätningar över ytan av hydrogeler som visas i C och D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Ortogonal presentation av styvhet och integrinbindande peptid avslöjar inneboende biologiska skillnader mellan GBM-cellinjer. (B) Läkemedelssvarsdata för GS122- och GS304-cellinjer visualiseras genom att normalisera OD450-värdet för de läkemedelsbehandlade brunnarna (N = 5) med genomsnittet av de vehikelbehandlade brunnarna (N = 5). Livskraften i samband med läkemedelsbehandling observerades variera nonli nästan för hydrogelstyvhet, vilket visar variation mellan cellinjer. (C,D) Läkemedelssvarsdata för GS122- och GS304-cellinjer när typen av integrinbindande peptid inkluderades och matrisstyvheten varierades ortogonalt. Alla felstaplar representerar de 95% konfidensintervall som erhålls från bootstrapping av varje villkor med N = 10 000. Den streckade linjen (y-axeln = 1) motsvarar det fall där OD450 för behandlingsförhållandena är lika med fordonet. Alla experimentella värden erhölls efter 7 dagar i kulturen; TMZ tillsattes 3 dagar efter initial inkapsling för läkemedelsstudier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Morfologiska skillnader mellan celler inkapslade i olika HA-baserade hydrogelmiljöer. Vita pilar indikerar celler med spridda morfologier. (B) Fasbilder av GS122 och GS304, när de odlades i en hydrogel (0,8 och 8 kPa), visade en peptid härledd från osteopontin. Vita pilar indikerar celler med spridda morfologier. Svarta pilar indikerar celler med rundade morfologier. Efter 7 dagar i kultur togs bilder och TMZ lades till 3 dagar efter den första inkapslingen. (C) Fasbild av en terminalt differentierad neuroendokrin prostataorganoid. Skalstaplar = 200 μm (för A,B); 100 μm (för C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protein Peptid sekvens
RGD GCGYGRGDSPG
Tenascin-C GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV
Integrinbindande sialoprotein (IBSP) GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Osteopontin GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG

Tabell 1: ECM-proteiner och härledda peptidsekvenser.

Reagens Initial koncentration Volym (μl) Slutlig koncentration
HA-SH-lösning 10 mg/ml 2300 5 mg/ml
PEG-SH 100 mg/ml 503 Varierar per experiment
PEG-Norbornene 100 mg/ml 443 Varierar per experiment
Peptid 4 μM 288 0,250 μM
Varv 4 mg/ml 288 0,25 mg/ml
HEPES-HBSS Ej tillämpligt 798

Tabell 2: Typiska slutliga formuleringskomponenter för hydrogel.

Variabel Parameter
F Kraft
E Youngs modul
ν Poissons förhållande
δ Indrag (lodrät spetsposition)
a Kontaktcirkelns radie
RS Sfärens radie

Tabell 3: Variabler och motsvarande parametrar för AFM-beräkningar.

Kompletterande fil 1: Vägledning angående användning av LED-arrayen för belysning och fotocrosslänkning av hydrogeler. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 1: Arduino-fil för LED-arraymikrokontroller (Arduino.zip). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 2: Drivrutiner från tredje part för Arduino nano (drivrutiner.zip). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 3: Bearbetningsfil för GUI-kontroll av LED-arraymikrokontroller (GUI.zip). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 4: Fil för 3D-utskrift extern hållare för LED-array mikrokontroller (hållare.zip). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det aktuella arbetet presenterar metoder för att generera 3D, miniatyriserade kulturer inom HA-baserade samtidigt som matrisstyvhet och peptider som är tillgängliga för integrinengagemang förändras. Denna teknik möjliggör systematisk studie av hur matrisparametrar påverkar cellulära fenotyper (t.ex. livskraften hos cancerceller som utsätts för kemoterapi) med ökad genomströmning. Tidigare tillvägagångssätt, inklusive det som presenteras här, har justerat hydrogelstyvheten genom att variera procenten total polymer i den slutliga formuleringen, där styvare hydrogeler har ett högre polymerinnehåll21,31. Detta tillvägagångssätt kräver emellertid att man förbereder en unik hydrogelformulering för varje önskad styvhet, en process som i sig sänker genomströmningen. Här ställs hydrogelstyvhet in genom varierande UV-bestrålning under tvärbindning så att hydrogeler med flera styvheter kan erhållas från en enda prekursorlösning. Framtida utövare som kanske inte har möjlighet att konstruera den anpassade belysningen som beskrivs här kan enkelt ersätta en kommersiellt tillgänglig UV-punkthärdningsanordning och justera belysningen när olika sektorer på en brunnsplatta härdas. Nackdelen med att använda en kommersiell spothärdningsanordning är minskad genomströmning jämfört med den anpassade belysningen. En begränsning med de nuvarande metoderna är att unika lösningar fortfarande måste förberedas för varje peptidtillstånd. Liknande metoder har tidigare använts av andra grupper för att producera styvhetsgradientinnehållande hydrogeler 37,38. Denna studie visar dock hur fotokorslänkning kan möjliggöra miniatyrisering av experimentella prover och minska komplexiteten i experimentella inställningar. Sammantaget kommer dessa förbättringar att göra det möjligt för forskare att öka experimentell genomströmning när de genomför 3D-kulturer i matrismimetiska biomaterial och har nytta inom flera områden inom biomedicinsk vetenskap utöver neuro-onkologi.

De representativa resultaten visar hur denna teknik kan användas för att ställa in miniatyriserade 3D-kulturer av patient-härledda GBM-celler i definierade matriser, där tillgängliga integrinbindande peptider och styvheter varieras, inom en standard 384-brunnsplatta som är lämplig för flera standardanalyser. Denna metod presenterar representativa resultat för att screena hur matrisparametrar påverkar svar på TMZ-kemoterapi i GBM-celler härledda från två unika patienter, betecknade som GS122- och GS304-celler. Av de två patient-härledda cellinjerna som utvärderades här var GS122-cellernas svar på TMZ-behandling känsligt för matrismikromiljön, medan GS304-cellernas var okänsligt. När det gäller matrisstyvhet maximerade GS122-celler odlade i 3D-hydrogeler med en 4 kPa mikrokompressiv modul TMZ-motstånd, under vilket tillstånd behandlade celler ökade i antal mer än obehandlade celler under en 7-dagars experimentell kurs. Mekaniska egenskaper hade större effekter på TMZ-resistens än de integrinbindande peptiderna inkluderade. Således förväntas effekten av varierande peptidkoncentrationer, ensam och i kombination, möjliggöra upptäckten av matrisförhållanden som främjar läkemedelsresistens i framtiden. GS304-cellernas okänslighet för deras omgivande matris kan indikera att matrisen är mer inflytelserik för celler, som GS122-celler, som ursprungligen är känsliga för TMZ men ändå får resistens under behandlingen. Däremot är det oklart i vilken utsträckning matrissignaler påverkar celler som redan är behandlingsresistenta i början av experimentet, som med GS304-celler.

Resultaten från denna studie avvek något från tidigare rapporterade resultat. De mjukaste HA-baserade hydrogelerna som utvärderades (1 kPa bulk Youngs modul, som efterliknar styvheten hos den infödda hjärnan) främjade maximal TMZ-resistens GBM-celler härledda från fyra tumörer från olika patienter än den som utvärderas här21. Det finns flera möjliga orsaker till denna skillnad. Först undersöktes ett utökat intervall av hydrogelstyvheter i den aktuella studien, som jämförde hydrogeler över ett intervall av 0,8 kPa till 8 kPa mikrokompressiv moduli, medan tidigare studier endast jämförde hydrogeler med 1 kPa och 2 kPa Youngs moduli. Dessutom gjordes i de tidigare studierna mekanisk karakterisering i bulkskala med linjär mekanisk kompression för att uppskatta Youngs modul, medan AFM i denna studie användes för att mäta en mikrokompressiv modul. För forskare som vill implementera de metoder som finns här och som inte kräver mikroskaliga mekanikmätningar, är bulkskala moduli, med hjälp av reometri eller linjär mekanisk testning, helt acceptabla substitut för AFM. I synnerhet avslöjade mikromekaniska analyser den heterogena modulen över ytan av en enda gel. Jämförbara AFM-mätningar på de hydrogeler som formulerats i tidigare studier har inte gjorts, men det förväntas att variansen av styvheter som presenteras i en enda hydrogel har varit större än de i den aktuella studien. Hydrogeler i de tidigare studierna genererades med hjälp av en michael-typ addition tvärbindning beroende av kinetisk blandning vid 37 grader C 10,21,24. Däremot tillåter fotocrosslänkning grundlig blandning av hydrogelprekursorer före ljusexponering, vilket förbättrar homogeniteten i 3D-hydrogelen och i sin tur minskar variationen i cellsvar. Slutligen uppvisar GBM-tumörer notoriskt heterogent och oförutsägbart beteende39 och det är därför rimligt att förvänta sig att celler som härrör från enskilda tumörer också skulle ha unika egenskaper. Denna brist på konsekvens mellan patientprover motiverar behovet av en plattform med hög genomströmning för att belysa patientspecifika tumöregenskaper.

Vanliga fallgropar vid utförande av den miniatyriserade hydrogelfotocrosslänkningsproceduren inkluderar ofullständig blandning av hydrogelprekursorer, vilket resulterar i dålig reproducerbarhet och spontan gelering av HA-lösningen under blandning. Dessa problem kan mildras genom att omröra HA-tiolen i minst 45 minuter och den fullständiga prekursorlösningen i minst ytterligare 30 minuter samtidigt som pH-värdet för hydrogelprekursorlösningar noggrant övervakas för att säkerställa att det förblir under 7 för att förhindra tioloxidation och bildning av disulfid till tvärbindningar. Till skillnad från tvärbindningsmetoder som använder en kinetisk michael-typ additionsmekanism 10,21, sänker fotocrosslänkningsmetoden som används i detta protokoll sannolikheten för spontan gelering när alla reagens kombineras21. Kontrollpunkter för kvalitetskontroll rekommenderas starkt, såsom att mäta HA-tioleringsprocent31 och göra extra hydrogeler för parallell mekanisk testning till varje sats 3D-kulturer. Slutligen måste sådddensiteter för 3D-inkapsling i hydrogeler identifieras för varje celltyp eller linje som används. Generellt visar resultaten att en minsta koncentration på 1 miljon celler/ml är tillräcklig för 3D-odlingen av de flesta celler, som bildar sfäroider, inklusive patient-härledda GBM-celler, mänskliga embryonala stamceller (H9) och humaninducerade pluripotenta stamceller (data visas inte). Inkludering av ROCK-hämmare behandling före inkapsling (steg 4.1) vid användning av särskilt känsliga celler rekommenderas också40.

I samband med utvecklingen av nya behandlingsmetoder för GBM tillhandahåller protokollet som presenteras här metoder för funktionell screening av läkemedelssvar hos patient-härledda GBM-celler i en fysiologiskt relevant mikromiljö. Ett rikt förråd av genetiska, epigenetiska och kliniska mRNA-uttrycksdata för GBM (och andra cancerformer) är offentligt tillgängligt tack vare ansträngningarna från The Cancer Genome Atlas (TCGA) och andra15. Används tillsammans med dessa stora datamängder förväntas data som genereras från funktionella skärmar av miniatyriserade 3D-kulturer avslöja nya korrelationer, vilket förbättrar förutsägelsen av kliniska resultat hos enskilda patienter. Till exempel kan subpopulationer av patienttumörer identifieras för vilka viss behandling, som matrisstörande föreningar såsom cilengitid, kan förbättra kliniska resultat41. Förutom läkemedelssvar möjliggör denna odlingsplattform bedömningar av tumörcellsinvasion med hjälp av välplattkompatibla bilder med högt innehåll. Flexibiliteten hos denna plattform att införliva många olika peptider, ensamma eller i kombination, medan ortogonalt varierande styvheter kan hjälpa till att identifiera matrisfunktioner som driver GBM-tumöraggression.

Utöver GBM kan dessa metoder anpassas för att undersöka effekterna av matrisparametrar på andra celltyper i samband med andra sjukdomar, vävnadsutveckling och normal vävnadsfunktion. I framtiden kommer det att vara enkelt att öka genomströmningen av dessa metoder ytterligare, eftersom de har utformats specifikt för att utföras i samband med multibrunnsplattor för att underlätta antagandet i befintliga arbetsflöden för läkemedelsupptäckt genom att använda kommersiellt tillgängliga automatiserade vätskehanterare och bilder med högt innehåll. Enkel integration med befintlig infrastruktur och ökad automatisering, vilket minskar de tekniska färdigheter som krävs för att producera och underhålla cellbelastade 3D-hydrogelkulturer, kommer att avsevärt sänka hindren för att anta denna metod. Medan arbetet här specifikt presenterar kulturer inom HA-baserade hydrogeler, förväntas det att denna metod enkelt kan översättas till andra vanliga fotokorslänkbara material för 3D-cellodling, såsom metakrylaterat gelatin, och att metoderna som rapporteras här kommer att ge en användbar riktlinje för ytterligare applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill särskilt uppmärksamma Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore och Itay Solomon för deras bidrag till tidigare iterationer av fotogelationsschemat. Cellinjerna GS122 och GS304 tillhandahölls generöst av David Nathanson. Alla figurer skapades med BioRender.com. UCLA-kärnfaciliteter, Molecular Screening Shared Resources och Nano and Pico Characterization Laboratory var avgörande för arbetet. Chen Chia-Chun stöddes av UCLA Eli och Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan stöddes av ett tumörcellbiologiskt träningsprogram NIH Grant (T32 CA 009056).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.1 kOhm resistors, 6 W Digikey 35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube Genesse Scientific 21-108
15 mL conical tube Fisher Scientific 14-959-70C
365 nm LED Digikey ltpl-c034uvh365
384 well plate Bio Greiner One 781090
40 µm cell strainer MTC bio C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) Laysan Bio 4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs Digikey 2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W Digikey erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) Jenkem Technology A7025-1
Accutase Innovative Cell Technologies AT104500  cell dissociation  reagent
AFM Probes Novascan 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE Arduino 1.8.19
Arduino Nano Makerfire Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/mL
CCK8 Abcam ab228554
Centrifuge Thermoscientific sorvall legend xtr
CP100ST Gilson F148415 Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance Sartorius MSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50) Life Technologies 11330057 1x
DMSO Fisher Scientific BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-) Genesse Scientific 25-508
EGF Peprotech AF100-15 50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous Fisher Scientific A405P Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials Fisher Scientific 03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12B
G21 Supplement Gemini Bio 400-160 50x
Hanks Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175095
HCl, ACS, 12M Sigma Aldrich S25838A Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H3149-100Ku 25 µg/mL
HEPES Sigma Aldrich H7006-100G
Hot Air Gun Wagner HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide Genscript Custom Order GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% Sigma Aldrich 900889-1G
Magnetic stir plate Thermo Scientific SP194715
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor Gilson FD10004 Positive displacement pipette
Micropipette Tips Various Manufacturs Various sizes
mLine micropipette Sartorious
N-acetyl Cysteine Sigma Aldrich A7250-10G
Nanowizard 4 Bruker AFM microscope
NaOH Fisher Scientific ss255-1 Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin Invivogen ant-nr-1 500x
Osteopontin Peptide Genscript Custom Order GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid Drummond 4000102
Plain Microscope Slides Globe Scientific 1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep Grace Bio Labs 664201-A Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing Processing 3.5.4
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
Repeater Pipette Tips Sartorious 30089430 1 mL sizes
RGD Peptide Genscript GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes Genesse Scientific 12-102,12-104 5,10 mL Pipettes
Solder Paste Digikey 315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps VWR Scientific 82027-408
Synergy H1 Plate Reader Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask Genesee Scientific 25-209
Temozolomide Sigma Aldrich T2577 Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide Genscript GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified Lifecore Biomedical HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro VWR 58948-375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  3. Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
  4. Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology's trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
  5. Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
  6. Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
  7. Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
  8. Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
  9. Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
  10. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  11. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  12. Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
  13. Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
  14. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  15. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  16. Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
  17. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
  18. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  19. Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
  20. Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
  21. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
  22. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
  23. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  24. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
  25. Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
  26. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  27. Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
  28. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
  29. Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
  30. Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
  31. Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
  32. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  33. Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
  34. Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
  35. Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
  36. Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
  37. Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
  38. Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
  39. da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
  40. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  41. Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).

Tags

Bioteknik utgåva 184
Hydrogel arrays möjliggör ökad genomströmning för screeningeffekter av matriskomponenter och terapier i 3D-tumörmodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, J., Sohrabi, A., Epperson,… More

Liang, J., Sohrabi, A., Epperson, M., Rad, L. M., Tamura, K., Sathialingam, M., Skandakumar, T., Lue, P., Huang, J., Popoli, J., Yackly, A., Bick, M., Wang, Z. Z., Chen, C. C., Varuzhanyan, G., Damoiseaux, R., Seidlits, S. K. Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models. J. Vis. Exp. (184), e63791, doi:10.3791/63791 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter