Summary
이 프로토콜의 목적은 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 질량 분광법 이미징을 사용하여 초파리 뇌와 같은 작은 조직에서 지질 및 대사 산물 분석을위한 적절한 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.
Abstract
지질 프로파일 링 또는 지질학은 세포 또는 조직의 전체 지질 함량을 연구하는 데 사용되는 잘 정립 된 기술입니다. 지질학에서 얻은 정보는 발달, 질병 및 세포 대사와 관련된 경로를 연구하는 데 유용합니다. 많은 도구와 계측기가 지질학 프로젝트, 특히 질량 분광법과 액체 크로마토그래피 기술의 다양한 조합을 도왔습니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 이미징(MALDI MSI)은 최근 기존의 접근 방식을 보완하는 강력한 이미징 기술로 부상했습니다. 이 새로운 기술은 조직 구획 내의 지질의 공간적 분포에 대한 독특한 정보를 제공하며, 이전에는 과도한 변형을 사용하지 않고는 달성 할 수 없었습니다. MALDI MSI 접근법의 샘플 준비는 매우 중요하며, 따라서 이 논문의 초점입니다. 이 논문은 MALDI MSI를 통한 지질 분석 또는 대사 산물 및 소분자 분석을위한 작은 조직의 제조를위한 상세한 프로토콜을 제공하기 위해 최적의 절단 온도 화합물 (OCT)에 내장 된 많은 수의 초파리 뇌의 신속한 지질 분석을 제시합니다.
Introduction
지질은 광범위한 생물학적 과정에 관여하며 구조적 다양성에 따라 크게 다섯 가지 범주로 분류 될 수 있습니다 : 지방산, 트리아실 글리세롤 (TAG), 인지질, 스테롤 지질 및 스핑고지질1. 지질의 기본 기능은 생물학적 과정 (즉, TAG)을위한 에너지 원을 제공하고 세포막 (즉, 인지질과 콜레스테롤)을 형성하는 것입니다. 그러나 지질의 추가 역할은 발달 및 질병에서 주목 받아 왔으며 생물 의학 분야에서 광범위하게 연구되어 왔습니다. 예를 들어, 다른 길이의 지방산이 독특한 치료 역할을 할 수 있다는 보고서가 있습니다. 짧은 지방산 사슬은 자가면역 질환에 대한 방어 기작에 관여할 수 있고, 중간 길이의 지방산 사슬은 발작을 완화시킬 수 있는 대사산물을 생성하며, 긴 지방산 사슬은 대사 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 대사산물을 생성한다2. 신경계에서 글리아 유래 콜레스테롤과 인지질은 시냅토제네시스 생성에 필수적인 것으로 나타났습니다 3,4. 다른 유형의 지질은 약물 전달 시스템에 사용되는 스핑고지질과 면역계5,6을 지원하는 데 사용되는 사카롤리피드를 포함하여 의료 응용에서 약속을 나타냈다. 생물 의학 분야에서 지질의 수많은 역할과 잠재적 인 치료 응용 프로그램은 지질학 - 세포 지질의 경로와 상호 작용에 대한 연구 -를 중요하고 점점 더 중요한 분야로 만들었습니다.
지질학은 분석 화학을 사용하여 지질을 대규모로 연구합니다. 지질학에서 활용되는 주요 실험 방법은 다양한 크로마토그래피 및 이온 이동성 기술 7,8과 결합 된 질량 분광법 (MS)을 기반으로합니다. 이 영역에서 MS의 사용은 (1) 낮고 일시적인 수준에서도 발생하는 지질 및 지질 대사 산물을 검출하고, (2) 단일 실험에서 수백 개의 상이한 지질 화합물을 검출하고, (3) 이전에 알려지지 않은 지질을 확인하고, (4) 지질 이성질체를 구별하는 높은 특이성 및 민감도, 획득 속도 및 독특한 능력으로 인해 유리하다. 탈착 전기 분무 이온화 (DESI), MALDI 및 이차 이온 질량 분광법 (SIMS)을 포함한 MS의 개발 중 MALDI MSI는 조직 구획 내 지질의 공간 분포에 대한 고유 한 정보를 제공함으로써 기존의 MS 기반 접근법을 보완하는 강력한 이미징 기술로 부상했습니다 9,10.
지질학의 전형적인 워크플로우는 샘플 준비, 질량 분광법 기술을 이용한 데이터 수집, 및 데이터 분석(11)으로 구성된다. 샘플에서 지질 및 대사 산물에 대한 연구는 유기체의 대사 과정의 생리 학적 및 병리학 적 조건을 이해하는 기술의 출현으로 이어졌습니다. 생물학적 상호 작용을 이해하는 것이 중요하지만, 지질과 대사 산물의 민감성은 염료 나 다른 변형없이 이미지화하고 식별하기가 어렵습니다. 대사 산물 수준 또는 분포의 변화는 표현형 변화로 이어질 수 있습니다. 대사체 프로파일링에 사용되는 도구 중 하나는 수백 개의 분자를 동시에 검출할 수 있는 라벨이 없는 현장 이미징 기술인 MALDI MSI입니다. MALDI 이미징은 샘플에서 대사 산물과 지질을 시각화하는 동시에 무결성과 공간 분포를 보존합니다. 지질 프로파일 링을위한 이전 기술은 지질을 개별적으로 매핑하기 위해 방사성 화학 물질을 사용하는 것을 포함했지만 MALDI 이미징은이를 무시하고 다양한 지질을 동시에 탐지 할 수 있습니다.
지질 대사 및 항상성은 신경계의 유지 및 발달과 같은 세포 생리학에서 중요한 기능을 수행합니다. 신경계 지질 대사의 한 가지 필수적인 측면은 뉴런과 신경교 세포 사이의 지질 떨림이며, 이는 초저밀도 지단백질 (VLDL), 저밀도 지단백질 (LDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)12을 포함한 분자 운반체 지단백질에 의해 매개됩니다. 지단백질은 ApoB 및 ApoD와 같은 아포리포단백질(Apo)을 함유하고 있으며, 이는 지질화물의 구조적 블록과 지단백질 수용체의 리간드로 기능한다. 지질의 뉴런-글리아 크로스토크는 글리아-유래 ApoD, ApoE, 및 ApoJ, 및 그들의 뉴런 LDL 수용체(LDLRs)13,14와 같은 다수의 플레이어를 포함한다. 초파리에서, ApoB 패밀리의 구성원인 아포리포린은 주요 용혈림프 지질 담체(15)이다. 아포리포린은 포유동물 LDLR15,16의 상동체인 두 개의 밀접하게 관련된 리포포린 수용체(LpRs), LpR1 및 LpR2를 갖는다. 이전 연구에서, 성상세포 분비 리포칼린 글리알 라자릴로 (GLaz), 인간 ApoD의 초파리 상동체, 및 그의 뉴런 수용체 LpR1이 뉴런-글리아 지질 떨림을 협력적으로 매개하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 수상 돌기 형태형성17을 조절한다. 따라서 LpR1의 손실은 초파리 뇌의 전반적인 지질 함량의 감소를 일으킬 것이라고 추측되었습니다. MALDI MSI는 본 연구에서 입증된 바와 같이 LpR1-/- 돌연변이체 및 야생형 초파리 뇌의 작은 조직에서 지질 내용물을 프로파일링하는 데 적합한 도구가 될 것이다.
MALDI MSI의 인기가 높아지고 있음에도 불구하고, 장비의 높은 비용과 실험적 복잡성은 종종 개별 실험실에서의 구현을 방해합니다. 따라서 대부분의 MALDI MSI 연구는 공유 핵심 시설을 사용하여 수행됩니다. MALDI MSI의 다른 적용과 마찬가지로, 지질학을 위한 신중한 샘플 준비 과정은 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 그러나, 샘플 슬라이드 준비는 일반적으로 개별 연구 실험실에서 수행되기 때문에, MALDI MSI 획득에 변동의 가능성이 있다. 이를 방지하기 위해, 본 논문은 실시예11,17로서 양성 이온 모드에서 성인 초파리 뇌의 큰 그룹의 지질 분석을 사용하여 MALDI MSI 측정 이전에 작은 생물학적 샘플의 샘플 제조를 위한 상세한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 한다. 그러나, 일부 인지질 부류 및 대부분의 작은 대사산물은 이전에 기술된 음이온 모드에서 MALDI 영상화에 의해 유리하게 검출되고, 이는 앞서11에서 기술되었다. 따라서이 두 가지 예제 연구를 통해 우리는 독립형 대형 조직 대 임베디드 작은 조직, 해동 장착 대 웜 슬라이드 장착, 포지티브 이온 모드 대 음이온 모드 등 다양한 조합의 상세한 샘플 준비 프로토콜을 제공하기를 희망합니다.
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Protocol
1. 비행 머리 임베딩
참고 : 전체 절차는 ~ 45-60 분이 걸립니다.
- 평평한 표면을 가진 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT 화합물) 단계를 준비하십시오.
- 플라스틱 cryomold (15mm x 15mm x 5mm)에 OCT를 cryomold 깊이의 절반에 추가하고 거품 형성을 피하십시오. 곰팡이를 평평한 표면에 몇 분 동안 방치 한 다음 드라이 아이스로 옮깁니다.
- 드라이 아이스에 cryomold를 평평하게 유지하고 OCT가 평평하고 평평한 표면을 형성하도록하십시오. OCT가 몰드에서 완전히 응고될 때까지 기다리십시오. 냉동된 OCT 단계를 즉시 사용하거나 -80°C에서 보관하십시오.
- CO2 (즉,CO2 패드)를 사용하여 성인 파리를 마취하십시오.
- 실험실 물티슈 조각이 들어있는 페트리 접시를 준비하십시오. 정전기를 줄이기 위해 물티슈의 일부를 축축하게 하기 위해 물을 사용하십시오. 닦아내는 절반을 젖은 상태로 유지하고 절반은 건조하게 유지하십시오.
- 해부 범위 1에서 포셉을 사용하여 플라이 헤드를 자릅니다. 매번 4-5 개의 머리를 모아서 실험실 닦아내기의 건조한 부위에 넣으십시오.
참고 : 4-5 개의 헤드 컬렉션은 ~ 2 분이 걸립니다.
- OCT 단계를 드라이 아이스에서 해부 범위로 옮깁니다.
- 드라이 아이스에서 현미경 2로 OCT 단계를 가져 와서 즉시 머리를 OCT 단계로 옮기고 신속하게 배열하여 OCT 용융을 피하기 위해 ~ 30 초가 걸립니다. 각 비행 두뇌 주위에 ~ 1mm의 빈 공간을 남겨 두어 OCT의 적절한 지지와 블록 가장자리에서 4-5mm의 빈 공간을 확보하여 섹션을 처리 할 수있는 충분한 공간을 제공하십시오. 코가 너무 길면 팁을 제거하십시오. 너무 길지 않으면 그대로 유지하십시오. OCT 스테이지를 드라이 아이스 위에 다시 올려 놓고 ~ 3 분 동안 계속 유지하여 OCT 단계가 얼어 붙고 단단하게 유지되도록하십시오.
- OCT 단계가 드라이 아이스로 돌아와 응고를 기다리면 또 다른 머리를 모으십시오. 1.2단계와 1.3단계를 반복하여 추가 샘플을 스테이지의 나머지 공간으로 전송합니다.
참고 : 여덟 개의 머리는 일반적으로 각 유전자형에 대해 준비되며,이 실험실에서 한 OCT 단계에서 네 개의 유전자형이 사용됩니다. - 두 개의 해부 현미경을 나란히 사용하여 초점을 변경하지 않고 OCT 단계에서 헤드를 이송 및 배열하는 데 걸리는 시간을 늘리고 OCT 단계가 녹을 위험을 낮 춥니 다.
- 모든 플라이 헤드가 정렬 된 후 OCT 스테이지를 드라이 아이스에 5-10 분 동안 앉히십시오.
- OCT 스테이지를 드라이 아이스에서 떼어 내고 평평한 표면 (벤치)에 놓은 다음 신속하게 많은 양의 OCT 화합물을 첨가하여 모든 샘플을 덮고 ~ 3 초가 걸리는 전체 냉동 금형을 채 웁니다.
- 즉시 cryomold를 드라이 아이스로 다시 옮기고 내장 된 조직을 포함하는 전체 OCT 블록을 동결시킵니다. OCT 스테이지를 드라이 아이스에 5-10 분 더 앉히십시오. 냉동 금형의 여백에 샘플을 라벨링하십시오.
- 냉동된 샘플을 절편화 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관한다.
2. 조직 절제술
참고: 산화인듐 주석(ITO) 슬라이드를 다룰 때는 조직 오염을 방지하기 위해 항상 장갑을 착용하십시오. 슬라이드에 직접 숨을 쉬지 않도록 마스크를 착용하는 것도 좋습니다.
- 저항으로 설정된 전압계를 사용하여 ITO 슬라이드의 전도도를 테스트하여 ITO 코팅 측을 확인합니다. 저항 측정이 있는 측면을 조직을 부착할 측면으로 표시한다. 라벨을 붙이고 슬라이드 오염을 피하기 위해 항상 슬라이드 바닥에 실험실 닦아내기를 설정하십시오.
- 조직이 30-45 분 동안 냉동 챔버에서 평형을 이루도록 허용하십시오.
- OCT가 녹지 않도록하려면 포셉 및 얇은 팁이있는 아티스트 브러시와 같은 필요한 모든 도구를 미리 냉동 챔버에 배치하여 미리 냉각하십시오.
- cryostat를, 바람직하게는 70% 에탄올로 청소한다. 롤 플레이트와 스테이지를 닦고 사용한 블레이드를 제거하십시오. 여분의 깨끗한 물티슈를 사용하여 에탄올이 증발하고 단면화가 시작되기 전에 모든 표면이 건조되었는지 확인하십시오.
- 조직의 유형에 따라 냉동 챔버 및 시편 헤드의 온도를 조정하십시오 (예 : 간장의 경우 -14 °C, 근육의 경우 -20 °C, 피부 10의 경우 -25 °C, 이 프로토콜에서 플라이 헤드의 경우 -18 °C).
- OCT를 사용하여 시편 홀더에 조직을 장착합니다. OCT 블록의 베이스를 덮을 수 있을 만큼 충분한 OCT를 사용하고 블록을 가능한 한 평평하게 장착하십시오.
- 깨끗한 칼날을 무대에 놓고 잠급니다. 원하는 절삭 각도를 얻기 위해 필요에 따라 시편의 헤드를 스테이지 쪽으로 배치합니다.
- 표본 블록을 모든 유전자형/치료 그룹이 블레이드에 수직으로 배치되는 방향으로 배치합니다.
참고: 이렇게 하면 일관된 절삭면이 보장되고 다른 그룹의 교차 오염을 방지할 수 있습니다. 다른 조직 블록을 절단하는 경우 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 새 블레이드로 전환하십시오.
- 표본 블록을 모든 유전자형/치료 그룹이 블레이드에 수직으로 배치되는 방향으로 배치합니다.
- 관심 영역 (예 : 뇌의 원하는 영역)이 발견 될 때까지 두꺼운 섹션 (50-100 μm)에서 절단을 시작하십시오.
- 무대를 깨끗하게 유지하기 위해 사전 냉각 된 아티스트 브러시로 여분의 조각을 끊임없이 닦으십시오.
- 원하는 영역에 도달하면 섹션의 두께를 10-12 μm로 변경하십시오.
- 필요에 따라 챔버 온도를 약간 조정하십시오. 예를 들어, 섹션이 벗겨지거나 쉽게 부서지는 경향이있는 경우 더 높은 온도를 설정하십시오.
참고: OCT 블록의 권장 온도는 -18°C입니다.
- 필요에 따라 챔버 온도를 약간 조정하십시오. 예를 들어, 섹션이 벗겨지거나 쉽게 부서지는 경향이있는 경우 더 높은 온도를 설정하십시오.
- 원하는 부분을 조심스럽게 수집하여 ITO 슬라이드에 부착하십시오. 냉동 챔버에서이 작업을 수행하십시오.
- 실내 온도 ITO 슬라이드를 가져 와서 섹션 위에 놓고 섹션이 냉동 단계에 흔적을 남기지 않고 슬라이드에 부착 할 수 있도록 섹션을 부드럽고 빠르게 접근하십시오.
참고: OCT가 녹아 슬라이드에 달라붙습니다.
- 실내 온도 ITO 슬라이드를 가져 와서 섹션 위에 놓고 섹션이 냉동 단계에 흔적을 남기지 않고 슬라이드에 부착 할 수 있도록 섹션을 부드럽고 빠르게 접근하십시오.
- 슬라이드를 랙에 따로 놓거나 여러 섹션의 컬렉션 사이의 냉동 장치 외부를 닦아내십시오.
- 동일한 코호트의 서로 다른 샘플에 대한 비교가 필요한 경우 여러 샘플의 섹션을 단일 슬라이드에 배치하여 동시 분석 및 변동을 최소화하십시오. 필요한 경우 MALDI 대상 홀더가 한 번에 두 개의 슬라이드를 수용할 수 있으므로 두 개의 슬라이드로 분리합니다.
- 진공 상자에 있는 슬라이드를 건조제가 바닥층으로 있는 데시케이터로 운반합니다. 슬라이드를 진공 상태에서 30-60 분 동안 건조시킵니다.
참고: 또는 실험실에 진공 건조기가 장착되어 있지 않은 경우, 슬라이드는 지질 또는 대사산물의 악화를 피하기 위해 -80°C에서 24시간 이내에 보관하거나 드라이아이스로 배송될 때까지 공정 전반에 걸쳐 -20°C로 유지해야 합니다. - 매트릭스 증착으로 진행하십시오. 메탄올/물(70/30, v/v)에 2,5-디하이드록시벤조산(DHB)을 매트릭스로 사용하십시오.
- 슬라이드가 즉시 실행되지 않으면 슬라이드를 -80 ° C (비행 뇌 절편의 경우 최대 1 개월, 설치류 뇌 절편의 경우 최대 6 개월)에 보관하거나 샘플을 적절한 드라이 아이스가있는 MALDI 핵심 시설로 즉시 배송하십시오. 최적의 보관 및 배송을 위해 슬라이드를 슬라이드 운반기에 넣고 왁스 필름으로 개구부를 단단히 밀봉하십시오. 지퍼 백으로 밀봉하고 건조제가 들어있는 다른 지퍼 백에 넣고 외부에 라벨을 붙입니다.
참고: 슬라이드 스캐닝, 매트릭스 증착 및 MALDI 이미징 절차11의 후속 단계에 대해서는 이전 작업을 참조하십시오. - 자동 HTX M5 매트릭스 분무기와 메탄올 / 물 (70/30, v / v)에서 DHB의 40 mg / mL 용액을 사용하여 매트릭스 증착을 수행하십시오. 매트릭스를 0.12 mL/min의 맞춤형 유속과 85°C의 노즐 온도로 10회 패스 스프레이합니다. 10 psi의N2 가스 압력을 사용하십시오.
참고: 분무기의 N2 가스 압력이 5psi 미만으로 낮아지면 분무기의 안전 메커니즘이 1,300mm/min 스프레이 속도, 2mm 트랙 간격, 3L/min 유량 및 40mm 노즐 높이로 분무기의 손상을 방지하기 위해 히터를 즉시 차단합니다. - 포지티브 이온 모드에서 MALDI 비행 시간(TOF) MS 장비( 재료 표 참조)를 사용하여 m/z 50-1,000의 질량 범위 내에서 질량 스펙트럼을 획득하십시오.
- 계측기를 교정하기 위해 아세토니트릴의 적색 인 에멀젼 0.5μL를 ITO 슬라이드에 스팟하고 그 스펙트럼을 사용하여 직교 보정 곡선2를 적용하여 50-1,000 m/z 질량 범위에서 계측기를 교정합니다.
- 레이저 스폿 직경을 40μm 래스터 폭의 변조된 빔 프로파일이므로 Medium으로 설정하고 어레이 위치당 1,000Hz의 레이저 반복률로 500개의 샷을 합산하여 이미징 데이터를 수집합니다.
- 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 스펙트럼 데이터를 기록하고 처리합니다. RMS(평균 제곱근) 정규화를 사용하여 이미징 데이터 분석을 수행하여 빈 너비 ±0.10 Da. 소프트웨어를 사용하여 동일한 실험에서 OCT와 뇌 조직 모두의 스펙트럼을 정렬하여 OCT의 중첩 피크와 이온 억제 간섭을 평가합니다(보충 그림 S1). 실험 후, 조직 샘플을 함유하는 MALDI 슬라이드를 앞서 기술된 바와 같이 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 의해 처리한다(도 11).
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Representative Results
인간 ApoD의 초파리 상동체인 성상세포 분비 리포칼린 글리알 라자릴로(GLaz)의 뉴런 수용체 LpR1의 손실은 초파리 뇌에서 전체 지질 함량의 감소를 야기할 수 있을 것으로 가정되었다. 이를 시험하기 위해, MALDI MSI는 LpR1-/- 돌연변이체 및 야생형 초파리 뇌에서 지질을 프로파일링하는데 사용되었으며, 이는 아래에 상세히 기술되어 있다.
실험은 그림 1에 표시된 워크플로우에 따라 수행되었습니다. 성인 파리 뇌는 상기 기재된 바와 같이 수확되었다. 그들은 OCT에 매립되었고, 드라이 아이스는 OCT 블록을 동결시키는 데 사용되었습니다. OCT 조직 블록을 12 μm 두께에서 및 시편 헤드 및 챔버 둘 다에 대해 -18°C에서 동결절제하였다. ITO 슬라이드에 냉동 절편이 장착된 ITO 슬라이드를 실온에서 30분 동안 진공에서 건조시켰다. 다음으로, 매트릭스 증착은 자동 HTX M5 매트릭스 분무기 및 메탄올/물 중의 DHB의 40 mg/mL 용액(70/30, v/v)을 사용하여 수행하였다.
포지티브 이온 모드의 MALDI 비행 시간(TOF) MS Autoflex 기기는 50-1,000m/z의 질량 범위 내에서 질량 스펙트럼을 획득했습니다. 동일한 실험으로부터의 OCT 및 뇌 조직 둘 다의 스펙트럼을 SCiLS에서 정렬시켜 OCT의 중첩 피크 및 이온 억제 간섭을 평가하였다(보충 도 S1).
그림 2의 결과는 선택된 m/z 스펙트럼의 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어로부터의 출력 이미지를 보여주며, 여기서 선택된 값은 LpR1 녹아웃과 야생형 초파리 사이의 지질 분포에서 유의한 차이를 보였다. 스캔은 LpR1-/- 돌연변이체에서 지질 함량의 일반적인 감소를 밝혀냈다. 각 스펙트럼은 수동으로 분석되었으며, 분석물 식별은 METLIN 데이터베이스와 이전에 발표된 연구 3,4를 상호 참조함으로써 달성되었습니다. 트리아실글리세롤 (TAG) 및 포스파티딜글리세롤 (PG)은 LpR1-/- 돌연변이체에 비해 대조군 뇌에서 고도로 발현되었다 (TAG에서 최대 10배 변화를 나타냄). 추가적으로, 디글리세롤 (DAG), 포스파티딜콜린 (PC) 및 포스파티딜-에탄올아민 (PE)은 또한 LpR1-/- 돌연변이 유전자형에서 최소한으로 발현되었다.
그림 1: MALDI-TOF 질량 분석기 이미징의 워크플로우. (A) 초파리 뇌는 드라이 아이스 위에 놓인 OCT에 정렬되어 있습니다. (B-D) 조직 블록은 -15°C에서 12 μm 두께의 절편으로 동결절제된다. 섹션은 미리 냉각된 브러시를 사용하여 평탄화되고 실온에서 유지된 유리 슬라이드의 ITO 코팅된 측면 상에 해동-용융된다. (E) 슬라이드는 신탁 마커로 표시되고, 매트릭스로 코팅되고, MALDI 계기에 배치된다. (F) 초파리 뇌의 MALDI 이미지는 DHB를 매트릭스로 사용하여 40 μm 해상도에서 얻어진다. 눈의 영역(빨강, m/z 370.2), 머리 조직(녹색, m/z 184.1) 및 뇌(파란색, m/z 788.6)가 오버레이된 다중 채널 이미지에 표시됩니다. (g) H&E 염색은 MALDI MSI 후 동일한 조직 절편에서 수행된다. (H) 샘플 준비, 저장 및 운송의 작업 흐름. 스케일 바 = 500 μm (F,G). 약어: MALDI-TOF = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간; OCT = 최적의 절삭 온도 화합물; ITO = 인듐 주석 산화물; DHB = 2,5,-디히드록시벤조산; H&E = 헤마톡실린 및 에오신; MSI = 질량 분광법 영상화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: MALDI MS 분석으로부터의 대표적인 이미지는 LpR1-/- 돌연변이 뇌에서 지질 함량의 일반적인 감소를 드러낸다. 대표적인 H&E 염색된 성인 파리 뇌 절편이 표시됩니다(왼쪽). 지질 종, 각각의 m / z 값 및 히트 맵의 스케일은 표시된 바와 같습니다. 하단에서, 적어도 네 개의 생물학적 반복실험으로부터의 대조군과 비교하여 LpR1-/- 돌연변이체에서의 감소의 평균 폴드가 화살표 옆에 숫자로 도시된다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림은 Yin et al.17에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1 : OCT 및 초파리 뇌 조직의 질량 스펙트럼. 도 1로부터의 초파리 뇌 OCT 블록의 동결절편은 MALDI 영상화 전에 DHB 매트릭스로 고르게 덮였다. 대조군 및 돌연변이 파리로부터 선택된 빈 OCT 영역과 뇌 조직 영역의 질량 스펙트럼은 각각 m/z 1-1,000 및 m/z 520-900 (지질-풍부)의 범위로 표시되었다. OCT의 간섭은 이온 억제 현상 및 중첩 신호 문제와 관련이 있습니다. 약어: OCT = 최적 절삭 온도 화합물; DHB = 2,5-디하이드록시벤조산; MALDI = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
돌연변이 및 야생형 초파리 뇌에서 지질 조성의 변화에 관한 연구에서 입증된 바와 같이, MALDI MSI는 작은 곤충의 기관 내의 분자 분포 패턴의 현장 분석을 위한 귀중한 라벨이 없는 이미징 기술이 될 수 있다. 실제로, 지질은 초파리 머리의 뇌 조직과 지방체 모두에 분포하기 때문에, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법 (LC-MS)에 기초한 기존의 지질학 접근법은 전체 머리 추출이 사용될 때 두 영역에서 결합 된 신호 만 검출 할 수 있습니다. 광범위하게, 초파리와 같은 작은 곤충의 기관 내의 하위 영역에 대한 차별적 지질학 분석은 LC-MS 접근법18에서 매우 힘들고 도전적인 작업입니다. 그것은 그 지역의 해부가 필요할 것이고, 이는 큰 도전을 부과합니다. 대조적으로, MALDI MSI는 작은 초파리 뇌 내에서도 다른 해부학 적 구조를 구별하기에 적절한 해상도를 제공합니다. 종래의 LC-MS에 비해 최소량의 조직 요구량의 이점은 또한 임상 생검과 같은 귀중한 샘플에 적용될 수 있다. 또한, MALDI MSI를 위해 제조된 샘플 슬라이드는 TOF-SIMS 및 면역조직화학과 같은 상보적 기술에 의해 검사될 수 있으며, 이는 학제 간 접근법(19,20)으로부터 수득된 데이터의 통합을 가능하게 할 것이다.
MALDI MSI에서 가장 중요한 단계 중 하나는 샘플 준비입니다 - 다른 실험실21에서 수행 된 대사 체학 연구 결과의 차이의 대부분을 설명하는 실험의 일부입니다. 여기서 주요 목표는 초파리 곤충만큼 작은 유기체의 지질 및 대사 산물에 대한 MALDI MSI 분석을위한 포괄적이면서도 실용적인 샘플 준비 프로토콜을 제공하여 연구자가 기본 생물학에서 번역 과학에 이르기까지 MALDI MSI를 구현하는 데 도움을주기 위해 제공하는 것입니다.
앞서 논의한바와 같이 분자 프로파일의 변화(풍부 및 공간 분포 둘 다)를 최소화하기 위한 예방 조치 외에도, 작은 조직을 취급할 때 몇 가지 다른 관행을 적용할 필요가 있다. 첫째, OCT에서 생물학적 조직 수확과 동결 사이의 시간은 사후 허혈(21)의 가능성을 감소시키기 위해 최소화되어야 한다. 둘째, 조직을 블록에 배치하기 전에 OCT의 평평한 단계가 준비되도록해야하며, 이는 단면화 중에 다른 조직에 걸쳐 비교 가능한 평면의 절편을 갖는 데 중요합니다. 셋째, 소규모 생물학적 조직이나 귀중한 샘플을 절단하려면 실험 전에 적절한 연습이 필요합니다. OCT는 짝수 섹션을 절단하는 데 도움이되지만 조직 컬링 또는 벗겨짐과 관련하여 합병증이 발생할 수 있습니다. 컬링과 싸우려면 롤 플레이트를 제거하기 전에 섹션이 몇 초 동안 무대에 놓이도록해야합니다. 두 개의 브러시를 사용하면 하나는 섹션의 상단을 여전히 유지하는 데 사용할 수 있으며 다른 브러시는 섹션을 푸는 데 사용할 수 있습니다. 주로 블록 섹션의 가장자리로 작업하여 조직과의 접촉을 최소화하기 위해주의를 기울여야합니다. 넷째, 해동 장착 방법은 더 적은 수의 비행 두뇌 (< 10 개의 뇌)에 사용될 수 있지만, 많은 수의 비행 두뇌 (>30 개의 뇌)를 포함하는 섹션을 놀라운 수의 뇌를 잃지 않고 차가운 ITO 슬라이드로 옮기는 것은 불가능할 것이며, 일단 들어 올리면 블록 섹션에서 쉽게 빠져 나올 것입니다. 따라서 많은 수의 플라이 브레인을 신속하게 분석하려면 웜 슬라이드 마운팅을 사용해야합니다. 특히 OCT 섹션과 슬라이드 사이의 온도 차이로 인해 섹션이 달라 붙고 슬라이드에 매우 빨리 부착됩니다. 따라서 따뜻한 슬라이드를 섹션과 냉동 단계에 대해 눌러서는 안됩니다. 대신, 냉동 스테이지를 건드리지 않고 섹션이 ITO 슬라이드에 부착 될 수 있도록 부드럽고 신속하게 섹션에 접근해야합니다. 우리는 해동 장착 방법과 비교하여 냉동 단계에 남겨진 섹션의 눈에 띄는 흔적을 관찰하지 못했습니다. 다섯째, MALDI 매트릭스의 균일하고 미세한 증착은 획득 중에 강력하고 정확한 공간 정보를 달성하는 데 중요합니다. 빈 슬라이드를 사용하여 샘플이 포함된 슬라이드로 진행하기 전에 매트릭스 증착이 적절한 커버리지인지 테스트하는 것이 좋습니다.
MALDI MSI는 점점 더 많은 인기와 발전으로 인해 더 광범위한 사용자 기반에 도달하고 아미노산, 대사 산물, 지질, 펩티드 및 단백질 및 생물학적 조직10에서 직접 추출 된 기타 소분자와 같은 분석 물질의 분자 질량 측정을위한 표준 도구가 될 것으로 예상됩니다. 그러나 자체 한계와 도전 과제가 있습니다. MALDI MSI를 위해 깨지기 쉽고 작은 규모의 샘플을 준비 할 때 절편에 OCT와 같은 임베딩제가 필요합니다. 그러나, OCT는 중합체(폴리비닐 알코올), 폴리에틸렌 글리세롤 및 벤잘코늄 클로라이드)의 조합을 함유하며, 이는 분석물 신호(22)를 방해할 수 있는 중합체 배경 신호를 생성한다. 젤라틴 및 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)와 같은 대체 매립 화합물은 이온 억제 효과가 적은 것으로 보고되었다. 젤라틴은 100-600 m / z 20,23,24의 저질량 범위에서 더 많이 흩어져있는 덜 강렬한 신호를 보여줍니다. CMC는 또한 초파리의 MALDI MSI에서 GABA와 같은 대사 산물을 시각화하는 데 사용되었지만 최적의 접착을 위해 임베딩하기 전에 머리를 70 % 에탄올에 담그어야합니다(25).
OCT의 신호 억제 경향에도 불구하고,이 프로토콜은 뇌 형태를 보존하면서 많은 수의 샘플에 대한 신뢰할 수있는 단면화를 제공하는 OCT의 우수한 능력으로 인해 그 사용이 진행됩니다. 연구자들은 젤라틴과 CMC 섹션이 20 μm와 같은 높은 두께에서 잘 나뉘는 반면, OCT 만이 연속 12 μm 섹션을 안정적으로 생성 할 수 있음을 발견했습니다26. CMC 및 젤라틴은 OCT가 제공하는 조직의 구조적 완전성과 타이트한 보유가 결여되어 있으며, 이는 하나의 블록(26)에 수용될 플라이 브레인과 같은 작은 조직의 수의 한계를 설정한다. OCT 임베디드 플라이 섹션으로부터의 MS 신호는 젤라틴 및 CMC26에 내장 된 신호와 유사하다고보고되었습니다. 우리의 공개되지 않은 데이터는 또한 웜 마운트, OCT 임베디드 플라이 브레인 섹션이 해동 장착 젤라틴 내장 조직에 필적하는 강력한 지질 신호를 생성한다는 것을 나타냅니다. 전반적으로, 조직 형태학의 무결성을 보존하고 다른 임베딩 화합물에 비해 정확한 샘플 절편을 가능하게하는 OCT의 우수한 능력으로 인해 초파리 뇌 배열과 같은 높은 취약성의 샘플과의 사용은 여전히 선택 사항입니다. 이 시나리오에서는 동일한 실험의 샘플을 비교하는 상대적 정량화 만 수행해야하지만 절대 정량화는 수행되어서는 안됩니다. 지질 분석에서 초파리 모델에 대한 우리의 보고된 연구와 관련하여, OCT의 이점이 그 한계보다 중요하다는 결론을 내렸다. 또한, 표적 분석물의 MS 신호가 OCT 신호에 의해 마스킹되는지 여부를 테스트하기 위해 시험 실험이 수행되어야합니다.
또한, 이온 억제의 효과를 최소화하기 위해 몇 가지 관행을 조정해야합니다. 첫째, 서로 다른 그룹의 샘플을 동시에 처리하여 동일한 정도의 이온 억제를 보장해야합니다. 둘째, MALDI 스캐닝을 위한 관심 영역의 선택에 있어서, OCT 영역을 피하고 조직 영역만을 개략적으로 설명해야 한다. 마지막으로, 빈 OCT의 영역은 데이터 분석 중에 OCT로부터 신호를 제외하기 위해 네거티브 컨트롤로 스캔되도록 선택되어야 한다.
지질학 분야는 2000년대 초에 등장했으며 MALDI MSI27을 포함한 질량 분광법의 발전으로 인해 최근 몇 년 동안 급속히 발전해 왔습니다. 이러한 발전하는 기술은 생물 및 생물 의학 응용 분야로 분야를 추진하는 데 도움이되었습니다. 예를 들어, 지질학은 뇌 지질 밀매의 수준의 변화와 조성물이 질병의 바이오마커로서 사용될 수 있기 때문에 신경학적 연구에 사용될 수 있다. 또한, 지질학은 새로운 신호 전달 분자의 확인, 약물 효능 테스트의 개발, 병리 생리학 적 조건의 기초가되는 메커니즘의 발견 및더 많은 28을 이끌어 냈습니다. 지난 몇 년 동안 이 분야에서 이룬 놀라운 성과에도 불구하고 여전히 성장을 요구하는 분야가 있습니다. 예를 들어, 지질이 현재의 기술을 사용하여 정확하게 정량화되는 능력은 여전히 논쟁 중에 있다29. 또한, 세포 지질의 완전한 매핑은 많은 진전을 이루고 있다. 이 분야의 다른 분야들 중에서도 향후 몇 년 동안 상당한 성장을 경험할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy 및 Mayan Hein은 Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP)의 지원을 받습니다. Jun Yin은 National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다. 이 프로젝트에 대한 지원은 PSC-CUNY Award를 통해 Ye He와 Rinat Abzalimov에게 제공되었으며, The Professional Staff Congress와 The City University of New York이 공동으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
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