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Réaction en chaîne par polymérase et hybridation par transfert de points pour la détection de leptospires dans des échantillons d’eau

Published: June 14, 2024 doi: 10.3791/65435
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

Summary

Dans cette étude, une application dot-blot a été conçue pour détecter Leptospira dans les trois clades principaux dans des échantillons d’eau. Cette méthode permet d’identifier des quantités minimales d’ADN spécifiquement ciblées par une sonde marquée à la digoxigénine, facilement détectées par un anticorps anti-digoxigénine. Cette approche est un outil précieux et satisfaisant à des fins de dépistage.

Abstract

Le dot-blot est une technique simple, rapide, sensible et polyvalente qui permet d’identifier des quantités minimales d’ADN spécifiquement ciblées par hybridation par sonde en présence d’ADN porteur. Il est basé sur le transfert d’une quantité connue d’ADN sur un support solide inerte, tel qu’une membrane en nylon, à l’aide de l’appareil dot-blot et sans séparation électrophorétique. Les membranes en nylon ont l’avantage d’avoir une capacité de liaison élevée des acides nucléiques (400 μg/cm2), une résistance élevée et une charge positive ou neutre. La sonde utilisée est un fragment d’ADNsb très spécifique de 18 à 20 bases de long marqué à la digoxigénine (DIG). La sonde se conjuguera avec l’ADN de Leptospira . Une fois que la sonde s’est hybridée avec l’ADN cible, elle est détectée par un anticorps anti-digoxigénine, ce qui permet sa détection facile grâce à ses émissions révélées dans un film radiographique. Les points avec une émission correspondront aux fragments d’ADN d’intérêt. Cette méthode utilise le marquage non isotopique de la sonde, qui peut avoir une demi-vie très longue. L’inconvénient de cet immuno-marqueur standard est une sensibilité plus faible que celle des sondes isotopiques. Néanmoins, elle est atténuée par le couplage de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et des tests dot-blot. Cette approche permet l’enrichissement de la séquence cible et sa détection. De plus, il peut être utilisé comme une application quantitative par rapport à une dilution en série d’un étalon bien connu. Une application dot-blot pour détecter Leptospira dans les trois clades principaux dans des échantillons d’eau est présentée ici. Cette méthodologie peut être appliquée à de grandes quantités d’eau une fois qu’elles ont été concentrées par centrifugation pour fournir des preuves de la présence d’ADN leptospiralé. Il s’agit d’un outil précieux et satisfaisant à des fins de dépistage général, et il peut être utilisé pour d’autres bactéries non cultivables qui peuvent être présentes dans l’eau, améliorant ainsi la compréhension de l’écosystème.

Introduction

La leptospirose chez l’homme provient principalement de sources environnementales 1,2. La présence de Leptospira dans les lacs, les rivières et les ruisseaux est un indicateur de la transmission de la leptospirose chez les animaux sauvages et les animaux domestiques et de production qui peuvent éventuellement entrer en contact avec ces plans d’eau 1,3,4. De plus, Leptospira a été identifié dans des sources non naturelles, notamment dans les eaux usées, l’eau stagnante et l’eau du robinet 5,6.

Leptospira est une bactérie distribuée dans le monde entier 7,8, et le rôle de l’environnement dans sa préservation et sa transmission a été bien reconnu. Leptospira peut survivre dans l’eau potable sous un pH variable et des minéraux9, et dans des plans d’eau naturels1. Il peut également survivre pendant de longues périodes dans l’eau distillée10, et sous un pH constant (7,8), il peut survivre jusqu’à 152 jours11. De plus, Leptospira peut interagir dans des consortiums bactériens pour survivre à des conditions difficiles12,13. Il peut faire partie de biofilms en eau douce avec Azospirillum et Sphingomonas et est même capable de croître et de supporter des températures supérieures à 49 °C14,15. Il peut également se multiplier dans un sol gorgé d’eau et rester viable jusqu’à 379 jours16, préservant sa capacité à provoquer la maladie jusqu’à un an17,18. Cependant, on sait peu de choses sur l’écologie des masses d’eau et sur la façon dont elle y est distribuée.

Depuis sa découverte, l’étude du genre Leptospira s’est basée sur des tests sérologiques. Ce n’est qu’au cours du siècle actuel que les techniques moléculaires sont devenues plus répandues dans l’étude de ce spirochète. Le dot-blot a été à peine utilisé pour son identification à l’aide (1) d’une sonde isotopique basée sur l’ARNr 16S et sur une répétition de séquence inter-simple (ISSR)19,20, (2) en tant qu’immunodosage basé sur le nanogold pour la leptospirose humaine appliquée à l’urine21, ou (3) en tant que test basé sur des anticorps pour des échantillons d’urine bovine22. La technique est tombée en désuétude car elle était à l’origine basée sur des sondes isotopiques. Cependant, il s’agit d’une technique bien connue qui, associée à la PCR, donne de meilleurs résultats et est considérée comme sûre en raison de l’utilisation de sondes non isotopiques. La PCR joue un rôle crucial dans l’enrichissement de l’ADN de Leptospira en amplifiant un fragment d’ADN spécifique qui peut être trouvé à l’état de traces dans un échantillon. Au cours de chaque cycle de PCR, la quantité du fragment d’ADN ciblé est doublée dans la réaction. À la fin de la réaction, l’amplicon a été multiplié par un facteur de plus d’un million23. Le produit amplifié par PCR, souvent non visible dans l’électrophorèse de l’agarose, devient visible par hybridation spécifique avec une sonde marquée DIG dans le dot-blot 24,25,26.

La technique dot-blot est simple, robuste et adaptée à de nombreux échantillons, ce qui la rend accessible aux laboratoires disposant de ressources limitées. Il a été utilisé dans une variété d’études sur les bactéries, y compris (1) les bactéries buccales27, (2) d’autres types d’échantillons tels que les aliments et les matières fécales28, et (3) l’identification de bactéries incultivables29, souvent en accord avec d’autres techniques moléculaires. Parmi les avantages offerts par la technique dot-blot figurent : (1) La membrane a une capacité de liaison élevée, capable de lier plus de 200 μg/cm2 d’acides nucléiques et jusqu’à 400 μg/cm2 ; (2) Les résultats Dot-blot peuvent être interprétés visuellement sans nécessiter d’équipement spécial, et (3) ils peuvent être stockés pendant des années à température ambiante (RT).

Le genre Leptospira a été classé en clades pathogènes, intermédiaires et saprophytes30,31. La distinction entre ces clades peut être obtenue sur la base de gènes spécifiques tels que lipL41, lipL32 et l’ARNr 16S. LipL32 est présent dans les clades pathogènes et présente une grande sensibilité dans divers outils sérologiques et moléculaires, alors qu’il est absent chez les espèces de saprophytes21. Le gène ménager lipL41 est connu pour son expression stable et utilisé dans les techniques moléculaires32, tandis que le gène de l’ARNr 16S est utilisé pour leur classification.

Cette méthodologie peut être appliquée à de grands volumes d’eau une fois qu’ils ont été concentrés par centrifugation. Il permet d’évaluer différents points et profondeurs au sein d’un plan d’eau afin de détecter la présence d’ADN leptospiralé et du clade auquel il appartient. Cet outil est précieux à des fins de dépistage écologique et général et peut également être utilisé pour détecter d’autres bactéries non cultivables qui peuvent être présentes dans l’eau.

De plus, les tests PCR et dot-blot sont techniquement et économiquement abordables pour un large éventail de laboratoires, même ceux qui ne disposent pas d’équipements sophistiqués ou coûteux. Cette étude vise à appliquer le dot-blot à base de digoxigénine pour l’identification des trois clades de Leptospira dans des échantillons d’eau prélevés dans des plans d’eau naturels.

Souches bactériennes
Douze sérovars de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi et Wolffi) ont été inclus dans cette étude. Ces sérotypes font partie de la collection du Département de microbiologie et d’immunologie de la Faculté de médecine vétérinaire et de zootechnie de l’Université nationale autonome du Mexique, et ils sont actuellement utilisés dans le test de microagglutination (MAT).

Tous les sérotypes de Leptospira ont été cultivés dans l’EMJH, et leur ADN a été extrait à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN commerciale (voir le tableau des matériaux). Un mélange d’ADN génomique des douze sérovars a été utilisé comme contrôle positif pour le clade pathogène de Leptospira . En tant que contrôle positif du clade intermédiaire de Leptospira , l’ADN génomique de la souche BUT6 du sérotype Hurstbridge de Leptospira fainei a été inclus, et en tant que contrôle positif du clade des saprophytes de Leptospira , l’ADN génomique de la sérotype de Leptospira biflexa de la souche Patoc I a également été inclus.

Les témoins négatifs étaient constitués d’un plasmide vide, d’ADN provenant de bactéries non apparentées (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii et Escherichia coli) et d’eau de qualité PCR, qui a servi de témoin non matriciel.

Échantillons d’eau
Douze échantillons choisis ont été prélevés à l’aide d’une méthode d’échantillonnage stratifié-aléatoire du Centre de recherche biologique et aquacole de Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54 » N 99° 6' 11 » O). Ces échantillons ont été obtenus à trois profondeurs : superficielle, 10 et 30 cm (figures 1A, B). Les procédures de collecte de l’eau n’ont eu aucun impact sur les espèces menacées ou protégées. Chaque échantillon a été prélevé dans un tube à microcentrifuger stérile de 15 ml. Pour recueillir l’échantillon, chaque tube a été doucement immergé dans l’eau, rempli à la profondeur sélectionnée, puis scellé. Les échantillons ont été maintenus à 22 °C et rapidement transportés au laboratoire pour être traités.

Chaque échantillon a été concentré par centrifugation dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL à 8000 x g pendant 20 min à température ambiante. Cette étape a été répétée jusqu’à ce que tous les échantillons soient concentrés dans un seul tube, qui a ensuite été utilisé pour l’extraction de l’ADN (figure 1C).

Figure 1
Figure 1 : Concentration des échantillons d’eau par centrifugation. (A) Bassins d’échantillonnage d’eau, et (B) Cours d’eau naturels. (C) Traitement d’échantillons d’eau par centrifugation en plusieurs étapes autant de fois que nécessaire (n). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Extraction de l’ADN
L’ADN total a été isolé à l’aide d’un kit d’ADN génomique commercial conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Les extractions d’ADN ont été éluées dans 20 μL de tampon d’élution, et la concentration d’ADN a été déterminée par un spectrophotomètre UV à 260-280 nm, et stockée à 4 °C jusqu’à l’utilisation.

Amplification par PCR
Les cibles de la PCR étaient les 16 gènes de l’ARNrS, lipL41 et lipL32, qui identifient l’ADN du genre Leptospira et permettent de distinguer les trois clades : pathogène, saprophyte et intermédiaire. Les conceptions des amorces et des sondes étaient basées sur les travaux antérieurs d’Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al., et Branger et al.33,34,35,36,37. La séquence de chaque sonde, amorce et fragment amplifié est décrite dans le Tableau 1, et leur alignement avec les séquences de référence est fourni dans le Fichier supplémentaire 1, le Fichier supplémentaire 2, le Fichier supplémentaire 3, le Fichier supplémentaire 4 et le Fichier supplémentaire 5. Les réactifs de PCR et les conditions de thermocyclage sont décrits dans la section protocole.

Les produits d’amplification ont été visualisés par séparation électrophorétique sur un gel d’agarose à 1 % dans un TAE (40 mM de base Tris, 20 mM d’acide acétique et 1 mM d’EDTA ; pH 8,3), à 60 V pendant 45 min avec détection au bromure d’éthidium, comme le montre la figure supplémentaire 1. L’ADN génomique obtenu à partir de chaque sérotype a été utilisé avec des concentrations allant de 6 x 106 à 1 x 104 copies équivalentes génomiques (GEq) dans chaque réaction PCR, sur la base de la taille du génome de L. interrogans (4 691, 184 pb)38 pour Leptospira pathogène, de la taille du génome de L. biflexa (3 956, 088 pb)39 pour Leptospira saprophyte, et la taille du génome de la souche BUT6 du sérovar de L. fainei Hurstbridge (4 267, 324 pb) avec le numéro d’accession AKWZ00000000,2.

La sensibilité des sondes a été évaluée à l’aide de l’ADN de chaque sérotype pathogène, de la souche sérovar Patoc I de L. biflexa et de la souche BUT6 de Hurstbridge sérovar de L. fainei . Pour évaluer la spécificité de la PCR et de l’essai d’hybridation par transfert de points, on a inclus de l’ADN de bactéries non apparentées.

Tableau 1 : Amorces et sondes PCR pour amplifier les produits d’identification des clades pathogènes, saprophytes et intermédiaires de Leptospira. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Essai d’hybridation dot-blot
La technique est appelée dot-blot car les trous dans lesquels l’échantillon d’ADN est placé ont une forme de point, et lorsqu’ils sont aspirés pour être fixés en place par aspiration sous vide, ils acquièrent cette forme. Cette technique a été mise au point par Kafatos et al.40. La technique permet la semi-quantification de Leptospira dans chaque échantillon positif à la PCR. Le protocole consiste en une dénaturation avec du NaOH 0,4 M à température ambiante, des échantillons avec de l’ADN de Leptospira de 30 ng à 0,05 ng, correspondant à 6 x 106 à 1 x 104 leptospires, sont tamponnés sur une membrane en nylon avec un appareil de transfert de points de 96 puits. Après l’immobilisation, l’ADN est lié à la membrane par l’exposition à une lumière UV de 120 mJ. Chaque sonde d’ADN est conjuguée avec la digoxigénine-11 dUTP par une étape de catalyse terminale de la transférase à l’extrémité 3' (la digoxigénine est un stéroïde végétal obtenu à partir de Digitalis purpurea, utilisé comme rapporteur41). Suite à l’hybridation rigoureuse de la sonde d’ADN marquée (50 pmol) à la température spécifique sur l’ADN cible, les hybrides d’ADN sont visualisés par la réaction de chimiluminescence avec l’anticorps anti-digoxigénine phosphatase alcaline conjugué de manière covalente avec son substrat CSPD. La luminescence est capturée par l’exposition à un film radiographique (figure 2).

Figure 2
Figure 2 : Étapes de la procédure pour le test PCR-dot-blot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

1. Préparation de l’échantillon

  1. Concentrer chaque échantillon d’eau dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Répétez cette étape, autant de fois que nécessaire, pour concentrer l’échantillon dans un volume de 250 μL.
  2. Utilisez le kit d’extraction d’ADN conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  3. Effectuez la PCR spécifique en fonction de la sonde dot-blot qui sera utilisée (Tableau 1).
    1. Effectuez les amplifications dans des tubes PCR d’un volume final de 25 μL contenant 1 tampon X, 2,5 unités de Taq polymérase, 1 μM de chaque amorce, 0,2 mM de chaque dNTP, 1,5 mM MgCl2 et 100 ng d’ADN cible de chaque échantillon d’eau ou ADN génomique de référence.
    2. Programmer la réaction de PCR dans un thermocycleur en fonction des conditions de thermocyclage (Tableau 2).
    3. Conservez les réactions à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
  4. Placez 10 μL de chaque produit PCR à éponger dans un puits séparé d’une plaque à 96 puits.
  5. Ajouter 40 μL d’ÉT dans chaque puits et mélanger par pipetage.
    REMARQUE : La plaque à 96 puits peut être scellée et stockée à 4 °C pendant la nuit. Suivez les instructions fournies dans le Fichier supplémentaire 6 pour préparer les tampons et les solutions pour le protocole. La figure 3 illustre les étapes de la préparation des échantillons.

Tableau 2 : Conditions de thermocyclage par PCR pour les gènes 16S, lipL41 et lipL32. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 3
Figure 3 : PCR et préparation de l’échantillon. En appliquant le protocole spécifique de PCR, le produit de PCR a été transféré sur une plaque de microtitration et 40 μL d’ET ont été ajoutés à chaque puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Assemblage de l’appareil dot-blot

REMARQUE : L’assemblage de l’appareil dot-blot est illustré à la figure 4. Pendant la procédure, portez des gants pour manipuler les solutions alcalines et protéger la membrane en nylon de la contamination.

Figure 4
Figure 4 : Assemblage de l’appareil Dot-blot. Le papier filtre et la membrane en nylon (préalablement humidifiée dans 10 X SSPE) doivent être disposés dans le bon ordre. L’ensemble doit être fermement fixé avec les vis avant d’appliquer le vide. Chaque puits doit être lavé avec de l’ÉT, et les produits PCR sont chargés dans leurs puits respectifs. Après avoir transféré le produit PCR à travers la membrane, chaque puits est lavé à nouveau avec du TE et laissé sécher. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Coupez la membrane en nylon (voir tableau des matériaux) et le papier filtre en feuilles de 12 x 8,5 cm.
  2. Marquez la membrane avec un marqueur permanent.
  3. Faites une encoche avec des ciseaux sur un bord pour indiquer la bonne orientation. Utilisez la marque pour vous souvenir de la commande de l’échantillon.
  4. Humidifier la membrane et le papier filtre avec 10 tampons salins-phosphate de sodium-EDTA (SSPE ; 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4 et 0,02 M EDTA, pH 7,4) (Dossier supplémentaire 6). Manipulez la membrane à l’aide d’une pince à épiler propre à bout émoussé.
  5. Assemblez la chambre dot-blot ; Tout d’abord, le papier filtre, puis la membrane sur le joint en plastique. Fixez le couvercle avec les vis de manière transversale.
  6. Raccordez la chambre à l’aspirateur, placez 100 μL d’ÉT dans chaque puits, maintenez l’aspirateur pendant 1 min, puis arrêtez-le.
  7. Mettre le vide à basse vitesse et charger 50 μL de chaque échantillon dans le puits correspondant sur la membrane de l’appareil dot-blot (en suivant la distribution membranaire prédéterminée).
    REMARQUE : Homogénéiser chaque échantillon dans la plaque d’hémagglutination à 96 puits avant de le placer dans la chambre dot-blot.
  8. Laissez l’aspirateur sécher la membrane. Si nécessaire, frappez doucement la chambre pour libérer les bulles dans l’échantillon.
  9. Lavez bien chacun en y plaçant 100 μL de TE avec un aspirateur continu et en le laissant sécher.
    REMARQUE : Une fois le transfert terminé, il est crucial d’arrêter d’abord la pompe et de la détacher. Le non-respect de cette consigne peut entraîner la pénétration d’un reflux dans l’appareil. L’ADN n’a pas besoin d’une étape de dénaturation si une membrane en nylon chargée positivement est utilisée, mais si l’on utilise un autre support inerte, une étape de pré-dénaturation et une dénaturation à base d’alcalis peuvent être nécessaires41.

3. Dénaturation et fixation de l’ADN

REMARQUE : La figure 5 illustre la procédure de fixation de la membrane d’ADN.

Figure 5
Figure 5 : Procédure de fixation de l’ADN et de la membrane. L’ADN est dénaturé dans une solution alcaline. Ensuite, il est neutralisé avec 10 X SSPE et la membrane est séchée. Ensuite, la membrane est transilluminée. La membrane est réhydratée avec 2 X SSPE et pré-hybridée pendant la nuit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Incuber la membrane avec 0,4 M de NaOH pendant 10 min à température ambiante.
  2. Équilibrez la membrane avec 10 X SSPE pendant 10 min à température ambiante.
  3. Sécher la membrane à 80 °C pendant 2 h.
  4. Transilluminatez avec une lumière UV de 120 mJ pendant 3 min. Assurez-vous que les échantillons sont orientés face vers le bas vers la source de lumière UV. Si vous utilisez un réticulant UV, vérifiez que les échantillons sont orientés vers le haut et répétez cette étape deux fois.
    REMARQUE : La membrane doit être complètement sèche avant la réticulation UV. L’ADN sera immobilisé par une liaison covalente à la membrane en nylon. Chaque réticulation prend environ 18'' à 1' avec une dose d’irradiation UV optimale, pour la plupart des expériences d’hybridation, d’environ 0,6-0,8 kJ/m2.
    L’exposition aux rayons UV est nocive pour les yeux et la peau. Portez un équipement de protection approprié et évitez de vous exposer à la peau nue.
  5. Laver la membrane avec 2 X SSPE pendant 10 min.
  6. Pliez soigneusement la membrane et insérez-la dans le tube d’hybridation (utilisez un tube de microcentrifugation de 15 ml).
  7. Ajouter 10 mL de la solution de préhybridation (Fichier supplémentaire 6) dans le tube et incuber à 42 °C pendant la nuit. Assurez-vous que le tube a été correctement scellé pour éviter toute fuite.

4. Hybridation

  1. Retirer 5 mL de la solution de pré-hybridation du tube d’hybridation. Pour utiliser les 5 ml une deuxième fois, conservez-les dans un autre tube et conservez-les à -4 °C.
  2. Ajouter 15 μL de la sonde étiquetée (tableau 1) dans le tube d’hybridation. Rincez l’embout dans la solution pour vous assurer que la sonde étiquetée a été bien instillée dans la dilution.
    REMARQUE : La liaison de la sonde d’ADN n’est pas aussi forte que celle de la liaison antigène-anticorps. Par conséquent, les changements dans la concentration de la sonde ou de l’ADN dans l’échantillon peuvent influencer l’intensité de la fluorescence émise. Les sondes d’ADN sont stœchiométriques, c’est-à-dire que le nombre de molécules de sonde liées à l’ADN est équivalent au nombre de molécules d’ADN présentes dans la solution. La figure 6 illustre l’hybridation de la sonde.
  3. Incuber à 42 °C pendant la nuit.
  4. Effectuer le marquage DIG de la sonde ADN. Suivez les instructions spécifiées dans le tableau 3 pour mélanger les réactifs, puis incubez le mélange à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, ajoutez 80 μL d’eau distillée et stockez la sonde à queue à 4 °C.

Figure 6
Figure 6 : Hybridation de la sonde. Le volume du tampon d’hybridation est ajusté et la sonde marquée à la digoxigénine est incorporée pour permettre l’hybridation de la sonde pendant la nuit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 3 : Réactifs pour le marquage des sondes à la digoxigénine (DIG). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

5. Chimiluminescence (marquage anti-DIG)

  1. Lavez la membrane deux fois avec 2 X SSPE/0,1 % SDS à température ambiante pendant 10 min.
  2. Incuber la membrane avec 5 X SSPE/0,1 % SDS à la température de recuit de la sonde pendant 15 min.
    REMARQUE : Dans cette étape, utilisez un récipient avec un couvercle pour maintenir la température aussi longtemps que possible. Assurez une température uniforme et constante sur toute la membrane. Le volume approximatif de chaque lavage est de 100 mL de la solution indiquée.
  3. Lavez la membrane une fois avec le tampon 1 (fichier supplémentaire 6) à température ambiante pendant 5 min.
  4. Laver la membrane une fois avec le tampon 2 (fichier supplémentaire 6) à température ambiante pendant 30 min.
  5. Lavez la membrane avec le tampon 2 et ajoutez l’anticorps anti-digoxigénine (15 μL) (voir le tableau des matériaux), puis incubez pendant 45 min (le temps d’incubation peut varier de 30 à 60 min). Cet anticorps secondaire marque la sonde pour la détection.
    REMARQUE : La membrane peut être stockée dans le tampon 2 avec l’anticorps anti-digoxigénine pendant une nuit à 4-8 °C. Le marquage anti-DIG du processus de chimiluminescence est illustré à la figure 7.

Figure 7
Figure 7 : Marquage anti-DIG du procédé de chimiluminescence. Les acides nucléiques non liés sont éliminés avec des solutions tampons. La sonde est alignée avec l’ADN cible et l’excédent est éliminé. La membrane est bloquée avec le tampon de blocage 1 X, et l’anticorps anti-DIG est ajouté (1:10000). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Chimiluminescence (application sur substrat)

  1. Lavez la membrane deux fois dans le tampon 1 à température ambiante pendant 15 min.
  2. Laver une fois dans le tampon 3 (voir fichier supplémentaire 6) à température ambiante pendant 5 min, en laissant la membrane drainer la majeure partie du tampon, le laissant presque sec.
  3. Ajouter le CSPD prêt à l’emploi (phosphate de phényle disodique 3-(4-méthoxyspiro {1,2-dioxétane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] décan}-4-yl), voir le tableau des matériaux), et laisser reposer pendant 5 min, (avec les doigts humides, homogénéiser le CSPD d’un côté à l’autre).
  4. Placez la membrane dans un sac en plastique transparent (12,5 x 9 cm) qui s’adapte aux dimensions de la membrane. Éliminez soigneusement les bulles d’air, répartissez uniformément le CSPD et thermoscellez le sac.
  5. Incuber la membrane dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes (cela peut aller jusqu’à 30 minutes) et assurez-vous que la membrane contenant les échantillons est placée vers le bas afin qu’elle soit bien immergée. Assurez-vous que la température reste constante et bien répartie sur la membrane.
  6. Séchez le sac en plastique et fixez-le avec du scotch sur un film radiographique déjà utilisé. Cela permettra une manipulation facile pendant la procédure d’exposition.
    REMARQUE : La figure 8 montre l’application du procédé de chimiluminescence sur substrat.

Figure 8
Figure 8 : Application du procédé de chimiluminescence sur substrat. L’anticorps libre est retiré et le substrat CSPD (1:250) est ajouté à la membrane. La réaction est activée par l’incubation à 37 °C et la membrane est disposée de manière à enregistrer la chimiluminescence dans un film radiographique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. Chimiluminescence (détection)

  1. Effectuez la procédure d’exposition. Dans la chambre noire, préparez les solutions de développement et de fixation (voir tableau des matériaux) dans les plateaux respectifs.
  2. Dans l’obscurité, placez soigneusement la membrane fixe face à un nouveau film radiographique et insérez-la dans une cassette radiographique (voir tableau des matériaux).
  3. Enregistrez le temps d’exposition. Le temps d’exposition peut varier de 1 min à 30 min ou plus. Commencez par 5 minutes et ajustez le temps en conséquence.
  4. Humidifier le film radiographique dans une solution de révélateur pendant 1 à 3 min et rincer doucement à l’eau du robinet (15-45 s).
  5. Humidifier le film radiographique dans une solution fixatrice pendant 1 à 3 min et rincer doucement à l’eau du robinet (45 s).
  6. Laissez le film radiographique sécher à l’air libre et documentez le test dans une boîte à lumière blanche visible.
    REMARQUE : Évitez de secouer la membrane pendant le temps d’exposition aux rayons X. Le processus de détection est illustré à la figure 9.
  7. Passez à l’interprétation du résultat. Dans le film radiographique exposé, les points avec émission peuvent être localisés visuellement et correspondent aux fragments d’ADN avec hybridation de la sonde. L’intensité du signal émis dépend de la luminescence et de la durée de l’exposition.
    REMARQUE : Les membranes peuvent être stockées séchées entre du papier filtre pendant plusieurs mois à température ambiante.

Figure 9
Figure 9 : Détection du processus de chimiluminescence. Dans des conditions sombres, la membrane est exposée à un film radiographique à l’intérieur d’une cassette à rayons X. Ensuite, on l’a laissé reposer pendant le temps d’exposition, puis le film radiographique a été développé et fixé. Enfin, il a été séché à l’air libre et interprété. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Procédure de déshybridation membranaire

  1. Lavez la membrane deux fois pendant 10 minutes avec de l’eau distillée.
  2. Laver la membrane pendant 20 min avec 0,4 M de NaOH à 53 °C (deux fois).
  3. Lavez deux fois la membrane pendant 10 min avec 2 X SSPE.
  4. Laissez la membrane sécher à température ambiante.
  5. Conservez la membrane et revenez à l’étape 3.5 du protocole.
    REMARQUE : La membrane peut être stockée dans le tampon de pré-hybridation pendant la nuit à 4-8 °C. Le lendemain, redémarrer avec une incubation à 42 °C pendant 1 h, permettant au tampon de pré-hybridation d’atteindre la température. Ensuite, passez à l’étape 3.5 du protocole.

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Representative Results

Pour évaluer l’efficacité de la technique, l’ADN génomique de cultures pures de chaque sérovar de Leptospira a été utilisé, ainsi que la sonde spécifique au clade. Des membranes ont été préparées avec 100 ng d’ADN génomique par réaction PCR pour chaque sérotype, suivis de huit ADN génomiques de bactéries non apparentées et de concentrations variables d’ADN génomique des sérovars ad hoc de Leptospira. Chaque test comprenait des contrôles positifs, négatifs et non matrimoniaux. Ces ADN génomiques non apparentés n’ont pas montré d’affinité pour les sondes dot-blot. La distribution membranaire et les membranes dot-blot sont illustrées à la figure supplémentaire 2, à la figure supplémentaire 3, à la figure supplémentaire 4, à la figure supplémentaire 5, à la figure supplémentaire 6 et à la figure supplémentaire 7. En ce qui concerne le clade des saprophytes, en utilisant le DB_Saproprobe avec le produit PCR de 1059 pb amplifié avec des amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD, et le produit PCR de 517 pb amplifié avec des amorces DB_16SSapREV et DB_16SSapFWD avec l’ADN génomique de Leptospira biflexa sérovar de la souche Patoc Patoc I, il a été possible de détecter entre 0,05 et 0,1 ng d’ADN saprophyte (figure supplémentaire 2 et figure supplémentaire 3). De même, pour la détection du clade intermédiaire, en utilisant le DB_Interprobe avec le produit PCR de 1059 pb amplifié avec des amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD, et le produit PCR de 299-301 pb amplifié avec les amorces DB_16SInterREV et DB_16SInterFWD avec l’ADN génomique de la souche sérovar Hurstbridge BUT6 de Leptospira fainei (figure supplémentaire 4 et figure supplémentaire 5), il a été possible de détecter environ 0,1 ng de l’ADN intermédiaire. De même, pour le clade pathogène utilisant la sonde DB_16SPathoprobe avec le produit PCR de 1059 pb amplifié par les amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD, ou la sonde DBlipL41 avec le produit PCR de 479 pb amplifié par les amorces DB_lipL41REV et DB_lipL41FWD avec mélange d’ADN génomique provenant de sérovars pathogènes de Leptospira, il a été possible de détecter des concentrations d’ADN allant de 0,3 à 0,6 ng d’ADN pathogène (figures supplémentaires 6 et 7).

Les tests conçus pour identifier les trois clades peuvent être utilisés individuellement pour chaque clade. Cependant, dans le cas d’échantillons précieux et rares, une seule membrane peut être préparée avec des amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD, qui amplifient un produit de 1058-1069 pb. Ce produit peut ensuite être hybridé avec le DB_Interprobe, le DB_Saproprobe et le DB_16SPathoprobe individuellement, avec l’étape de déshybridation (étape 8) avant chacun d’eux. Cette approche permet d’identifier tous les clades dans la même membrane.

Dans les échantillons d’eau de terrain, le protocole de sonde lipL32 a été appliqué. L’ADN de chaque échantillon d’eau a été utilisé à une concentration de 100 ng par réaction PCR. De plus, un protocole de contrôle d’extraction d’ADN a été inclus, qui consistait à ajouter 100 ng d’ADN génomique de Leptospira dans un échantillon d’eau distillée de 15 ml. Les témoins négatifs et positifs ont également été inclus (figure 10).

Tableau 4 : Description et profondeur des échantillons d’eau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 10
Figure 10 : Dosage par transfert de chaque échantillon d’eau. (A) Distribution membranaire et (B) Transfert par transfert de points de la DB_lipL32probe et du produit (262 pb) des amorces DB_lipL32REV et DB_lipL32FWD des échantillons d’eau de terrain. La surface de Pond 3 montre un résultat positif, et le contrôle du protocole d’extraction et les contrôles positifs ont un signal intense. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La description de l’échantillon d’eau est présentée dans le tableau 4, et la distribution et l’image de la membrane dot-blot sont illustrées à la figure 9. Le point A7 montre que l’ADN leptospiralé était présent à la surface de l’étang 3. Afin de déterminer la concentration d’ADN présente dans l’étang 3, on a effectué un test par transfert de points avec des concentrations connues d’ADN d’un mélange de sérovars de Leptospira et de la sonde lipL32 (figure 11). La membrane a été préparée avec de l’ADN génomique distribué de 100 ng à 1 x 10-13 ng dans chaque point. La concentration minimale qui peut être détectée avec certitude était d’environ 0,3 ng, ce qui correspond à 6 x 105 GEq dans les échantillons d’eau.

Figure 11
Figure 11 : Dosage par transfert de points avec des concentrations connues d’ADN d’un mélange de sérovars de Leptospira et de la sonde lipL32. (A) Distribution membranaire et (B) transfert de points de la DB_lipL32probe et du produit (262 pb) des amorces DB_lipL32REV et DB_lipL32FWD avec des dilutions (1:2) d’un mélange d’ADN génomique de sérovars pathogènes de Leptospira. Le signal de la sonde peut être facilement détecté jusqu’à 3,91 x 10-1 ng de mélange d’ADN Leptospira. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Produits d’amplification PCR visualisés par séparation électrophorétique. Voie 1. Marqueur de poids moléculaire 100 pb ADN Ladder. Voie 2. PCR basée sur le gène lipL32 avec un mélange d’ADN pathogène de Leptospira comme matrice ; Voie 3. PCR basée sur le gène lipL41 avec un mélange d’ADN pathogène de Leptospira comme matrice ; Voie 4. PCR basée sur le gène de l’ARNr 16S avec un mélange d’ADN pathogène de Leptospira comme matrice ; Voie 5. PCR basée sur le gène de l’ARNr 16S avec des amorces DB_16SSapREV et DB_16SSapFWD, et l’ADN sérovar de Leptospira biflexa de la souche Patoc I comme matrice ; Couloir 6. PCR basée sur le gène de l’ARNr 16S avec les amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD, et l’ADN de la souche Patoc I de la souche Patoc de Leptospira biflexa comme modèle ; Voie 7. PCR basée sur le gène de l’ARNr 16S avec des amorces DB_16SInterREV et DB_16SInterFWD, et Leptospira fainei, sérovar Hurstbridge sérigar BUT6 ADN comme matrice ; Voie 8. PCR basée sur le gène de l’ARNr 16S avec des amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD, et Leptospira fainei, sérovar Hurstbridge sérifor BUT6 ADN comme modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : (A) Distribution membranaire et (B) dot-blot du DB_Saproprobe et du produit (1059 pb) des amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD de l’ADN génomique de Leptospira biflexa sérovar Patoc, Patoc I. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : (A) Distribution membranaire et (B) dot-blot de la DB_Saproprobe avec le produit (517 pb) des amorces DB_16SSapREV et DB_16SSapFWD de l’ADN génomique de Leptospira biflexa sérovar Patoc, Patoc I. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : (A) Distribution membranaire et (B) transfert de points de la DB_Interprobe avec le produit (1059 pb) des amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD et l’ADN génomique de la souche sérovar Hurstbridge BUT6 de Leptospira fainei . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : (A) Distribution membranaire et B) Dot-blot de la DB_Interprobe et du produit (299-301 pb) des amorces DB_16SInterREV et DB_16SInterFWD avec l’ADN génomique de la souche BUT6 du sérovar de Leptospira fainei . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : (A) Distribution membranaire et (B) dot-blot de la DB_16SPathoprobe et le produit (1059 pb) des amorces DB_16SPathoREV et DB_16SPathoFWD avec un mélange d’ADN génomique de sérovars pathogènes de Leptospira . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 7 : (A) Distribution membranaire et (B) transfert de points de la DB_lipL41probe avec le produit (479 pb) des amorces DB_lipL41REV et DB_lipL41FWD avec un mélange d’ADN génomique de sérovars pathogènes de Leptospira . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Alignement des espèces de saprophytes Leptospira avec les amorces et la sonde sur la base de la séquence d’ARN ribosomique 16S . Les amorces sont mises en évidence en gras et en noir pour leur identification, leur direction étant indiquée par des flèches noires. La sonde est indiquée en gras et surlignée en gris, et sa position est marquée d’une ligne grise. Les séquences alignées sont surlignées en gris clair, tandis que les séquences non correspondantes sont en noir et blanc. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Alignement des espèces intermédiaires de Leptospira avec les amorces et la sonde sur la base de la séquence d’ARN ribosomique 16S . Les amorces sont mises en évidence en gras et en noir pour leur identification, leur direction étant indiquée par des flèches noires. La sonde est indiquée en gras et surlignée en gris, et sa position est marquée d’une ligne grise. Les séquences alignées sont en gris clair, tandis que les séquences non correspondantes sont affichées en noir et blanc. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Alignement des espèces pathogènes de Leptospira avec les amorces et la sonde basée sur la séquence du gène lipL32. Les amorces sont mises en évidence en gras et en noir pour leur identification, leur direction étant indiquée par des flèches noires. La sonde est indiquée en gras et surlignée en gris, et sa position est marquée d’une ligne grise. Les séquences alignées sont en gris clair, tandis que les séquences non correspondantes sont affichées en noir et blanc. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 4 : Alignement des espèces pathogènes de Leptospira avec les amorces et la sonde basée sur la séquence du gène lipL41. Pour leur identification, les amorces sont en gras et surlignées en noir, leur direction étant indiquée par des flèches noires. La sonde est indiquée en gras et surlignée en gris foncé, et sa position est indiquée par une ligne grise. Les séquences alignées sont en gris clair, tandis que les séquences non correspondantes sont en noir et blanc. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 5 : Alignement des espèces de Leptospira avec les amorces ciblant la séquence d’ARN ribosomique 16S et les sondes pour les espèces saprophytes, intermédiaires et pathogènes. Pour leur identification, les amorces sont indiquées en gras et surlignées en noir, leur direction étant indiquée par des flèches noires. Les sondes sont indiquées en gras et surlignées en gris, leurs positions étant représentées par des lignes grises. Les séquences alignées sont en gris clair et les séquences non correspondantes sont en blanc et en noir. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Tampons et solutions pour le dosage dot-blot. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Les étapes critiques de la technique dot-blot comprennent (1) l’immobilisation de l’ADN, (2) le blocage des sites de liaison libres sur la membrane avec de l’ADN non homologue, (3) la complémentarité entre la sonde et le fragment cible dans des conditions de recuit, (4) l’élimination de la sonde non hybridée et (5) la détection de la molécule rapporteure41.

La PCR-Dot-blot présente certaines limites, telles que la technique ne fournit pas d’informations sur la taille du fragmenthybridé 37, elle nécessite la déshybridation d’une seule membrane avant la réhybridation avec une deuxième ou une troisième sonde, et elle nécessite beaucoup de temps et d’efforts pour obtenir le résultat final.

Cette technique a montré une cohérence avec d’autres techniques moléculaires42,43 et ses applications. Reverse dot-blot, nanogold dot-blot21 et dot-ELISA42 ont été utilisés pour la détection de gènes spécifiques chez des organismes tels que Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 et Mycobacterium tuberculosis48,49 sur la base de l’ARNr 16S 29,43, et pour la détection de l’ADN ou de l’ARN de la plante virus41. La limite de détection (LD), définie comme la concentration la plus faible du micro-organisme pouvant être mesurée de manière cohérente et fiable par cette technique50, variait de 100 pg (5 x 104 bactéries) pour H. pylori47, à une seule cellule de B. burgdorferi dans les échantillons cliniques45, et à un fg, qui est inférieur à une cellule, de M. tuberculosis48,49.

Un aspect précieux de cette méthodologie combinée est sa capacité à étendre la limite de détection d’un ordre, en surmontant les résultats faussement négatifs dus à deux conditions d’échantillonnage qui peuvent conduire à des résultats incohérents : (1) échantillons avec un ADN insuffisant, ou (2) contamination de l’échantillon, permettant une détection à 100 % des échantillons positifs 25,45,47,48,49. Le PCR-Dot-blot a la capacité de détecter des quantités plus faibles de produits amplifiés que ceux qui peuvent être détectés dans l’électrophorèse sur gel d’agarose, et il évite la contamination à la suite de deuxièmes étapes d’amplification, comme dans la PCR imbriquée et semi-imbriquée. Ces avantages sont particulièrement importants lorsque l’on travaille avec des échantillons environnementaux contenant une faible charge bactérienne, qui peuvent contenir une gamme plus large d’inhibiteurs et de l’ADN provenant de sources non apparentées qui peuvent interférer avec les techniques moléculaires.

Des travaux antérieurs suggèrent que les leptospires peuvent être identifiés par des sondes d’ADN marquées à la photobiotine, atteignant une LD de 5 pg (5 x 10,3 leptospires)51. Les sondes marquées DIG détectent 0,1-1 pg (102 leptospires), tandis que 32sondes marquées P détectent 1-5 pg (750 à 1000 leptospires)51, et les sondes marquées à la biotine détectent 5 pg (2500 leptospires)52. De plus, 32sondes marquées au P pour le saprophyte Leptospira ont atteint une LD de 1,95 ng et pour le Leptospira pathogène, de 3,9 ng53. Dans cette étude, des niveaux de détection similaires ont été établis pour les trois clades. La LD pour les espèces pathogènes était d’environ 0,3 ng d’ADN génomique (6-8 x 104 GEq) (figure 11), et pour les espèces saprophytes et intermédiaires, elle était descendue à 0,1 ng (2 x 104 GEq). Notamment, des recherches antérieures ont été menées à l’aide de cultures pures de Leptospira 51 et de sérums de hamsters dorés infectés expérimentalement, dans le but de détecter les Leptospirapathogènes 54,55 et d’appliquer l’hybridation de l’ADN avec 32P marqué comme outil pour l’identification et la classification de Leptospira56. Ces sondes présentent une spécificité élevée et ne montrent pas d’hybridation croisée avec de l’ADN non homologue provenant d’autres micro-organismes 19,51,54,55,56,57, et peuvent distinguer même des espèces étroitement apparentées telles que Leptonema 57 . De même, dans ce travail, aucune hybridation avec de l’ADN non homologue n’a été observée. Bien que les sondes non isotopiques ne soient pas aussi sensibles que les sondes isotopiques58 ou d’autres techniques43, on peut s’attendre à ce que la combinaison PCR-Dot-blot permette une sensibilité jusqu’à dix fois supérieure à celle d’autres techniques basées sur la PCR, comme on l’a vu dans la détection de Leishmania et de l’herpèsvirus bovin 4 (BHV4)24,26.

D’autre part, le test dot-blot pour l’identification de Leptospira a été plus fréquemment utilisé avec des anticorps, et plus récemment avec des anticorps monoclonaux comme alternative pour diagnostiquer les humains et les animaux dans les échantillons d’urine 59,60,61,62. Dans ces études, l’échantillon est directement traité sur la membrane sans étapes préalables, et les anticorps ciblent des protéines de surface spécifiques de Leptospira associées à la pathogenèse. L’ELISA Mab-Dot-blot, par exemple, présente une sensibilité et une spécificité élevées, détectant aussi peu que 1 μg d’homogénate bactérien62. Les résultats obtenus de l’essai Mab-Dot-blot peuvent être comparables à ceux des tests PCR, qui ont généralement une LD d’environ 103 leptospires/ml d’urine ou 9,3 ng de Leptospira homogenate63. La quantité d’ADN génomique qui peut être amplifiée par PCR est de 100 cellules (500 fg d’ADN)61. Ces études antérieures ont utilisé des cultures pures ou des échantillons cliniques sans procédures d’enrichissement et étaient orientées vers un meilleur diagnostic. Étant donné que les rats infectés peuvent excréter jusqu’à 107 leptospires/mL d’urine64, et que les chiens peuvent excréter entre 102 et 106 leptospires/mL d’urine65, servant de sources de contamination des plans d’eau, les échantillons environnementaux nécessitent un enrichissement en leptospirales. L’amplification par PCR in vitro de l’ADN ciblé avant le transfert permet une amélioration de la sensibilité de la procédure jusqu’à dix fois52,55. Habituellement, le produit amplifié par une PCR finale ne serait pas visualisé dans une électrophorèse sur gel d’agarose ; néanmoins, cela devient évident grâce à l’hybridation spécifique de la sonde marquée DIG dans le dot-blot.

Bien que de nombreuses recherches sur les Leptospira et la leptospirose se soient concentrées sur le diagnostic des maladies, on sait peu de choses sur leur écologie dans les plans d’eau et leur distribution au sein de ceux-ci. La technique PCR-Dot-blot s’ajoute à la boîte à outils pour l’étude de Leptospira et de la leptospirose, offrant l’avantage de cribler un grand nombre d’échantillons et d’accélérer les résultats et l’interprétation. La PCR-Dot-blot est une technique relativement peu coûteuse, simple et non radioactive qui peut accueillir plusieurs sondes sur une seule membrane. En outre, il élimine le besoin d’équipements sophistiqués et de flux de travail complexes, ce qui peut être difficile dans des environnements aux ressources limitées.

L’impact de cette étude réside dans son application future à l’étude de grandes étendues d’eau à différentes profondeurs, ainsi que d’autres niches écologiques et types d’échantillons, notamment le sol, l’eau stagnante, les matières fécales, le sang et les tissus.

En conclusion, ce travail démontre l’application de la technique PCR-Dot-blot, basée sur le marquage à la digoxigénine des sondes d’ADN pour l’identification des trois clades au sein du genre Leptospira. Cette méthode simplifie le processus d’identification en le réduisant à une seule étape d’amplification et permet soit trois hybridations simultanées, soit trois hybridations consécutives à l’aide d’une seule membrane. Les limites de détection atteintes avec cette technique sont similaires à celles obtenues avec les sondes radioactives53, ce qui en fait un outil précieux pour identifier Leptospira dans des échantillons d’eau provenant de sources naturelles. Par conséquent, cette technique offre une sensibilité accrue et fournit des résultats précis et cohérents lors de l’évaluation d’échantillons contenant des quantités minimales d’ADN bactérien. Il s’agit d’une approche alternative pour l’étude de la dynamique de Leptospira dans les plans d’eau et peut aider à l’évaluation et à la surveillance d’échantillons environnementaux plus larges, aidant ainsi à la mise en œuvre de mesures préventives contre la transmission de ce micro-organisme.

En cas de difficultés avec la technique, tenez compte des points de dépannage suivants : (1) Si les points ont des formes irrégulières, vérifiez que le système d’aspiration est bien fermé transversalement, puis répétez le transfert. (2) Si le tube d’hybridation se brise pendant la procédure de nuit, entraînant la perte du tampon d’hybridation à la membrane, reportez-vous à la section « Procédure de déshybridation » et redémarrez le processus. (3) Si aucun point n’est visible, ne jetez pas la membrane ; Passez à la section « Procédure de déshybridation » pour répéter les étapes d’hybridation. (3) Si des zones blanches inégales sont remarquées sur le film radiographique développé, assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée pendant le processus de fermeture du sac. (5) Si des zones noires inégales sont observées sur le film radiographique développé, confirmer que le CSPD a été bien réparti à l’aide des doigts humides. (6) Si le film radiographique montre des ombres des points, assurez-vous que le film n’est pas déplacé pendant le temps d’exposition.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous sommes redevables à la collection Leptospira du Département de Microbiologie et d’Immunologie, Faculté de Médecine Vétérinaire et de Zootechnie, Université Nationale Autonome du Mexique. Nous sommes reconnaissants pour le généreux don des souches de référence Leptospira  ; Leptospira fainei sérovar Hurstbridge souche BUT6 et Leptospira biflexa sérovar Patoc souche Patoc I au Dr Alejandro de la Peña Moctezuma. Nous remercions le Dr José Antonio Ocampo Cervantes, le coordinateur du CIBAC, et le personnel pour leur soutien logistique. EDT s’inscrivait dans le cadre du programme Terminal Project pour les étudiants de premier cycle de l’Université autonome métropolitaine-Campus Cuajimalpa. Nous remercions le logiciel Biorender.com pour la création des figures 1 et 3 à 9.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit Invitrogen K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) Promega M3001
Whatman filter paper, grade 1, Merk WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m Roche 11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody Roche 11093274910
Medium Base EMJH Difco S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH Difco BD 279510
Blocking Reagent Roche 11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate Merk 11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm Sigma Aldrich D3159
Developer Carestream Carestream Health Inc GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP Roche 11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) Promega H5032
Ficoll 400 Sigma Aldrich F8016
Fixer Carestream Carestream Health Inc GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa Sigma Aldrich L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa Sigma Aldrich L-9150 It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40) Sigma Aldrich PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) Sigma Aldrich 9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich 7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich 7558-79-4
Terminal transferase, recombinant Roche 3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl) Sigma-Aldrich 1185-53-1
SSPE 20X Sigma-Aldrich S2015-1L It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Probes Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer Thermo-Scientific ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm Sigma-Aldrich 1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl Gilson SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen 3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl Axygen T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl Axygen TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot BIORAD 1706545
Portable Hergom Suction Hergom 7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) Hoefer PH90-115V
UV Crosslinker Hoefer UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler Hybaid HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 Fuji

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 208 Leptospira Dot-blot PCR Digoxigénine
Réaction en chaîne par polymérase et hybridation par transfert de points pour la détection de <i>leptospires dans des</i> échantillons d’eau
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Delgadillo-Tellez, E., Zavaleta-Villa, B., Atilano-López, D., Hernández-Castro, R., Olivo-Díaz, A., Carrillo-Casas, E. M. Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples. J. Vis. Exp. (208), e65435, doi:10.3791/65435 (2024).

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