Summary
この研究では、水サンプル中の3つの主要なクレードから レプトスピラ を検出するために、ドットブロットアプリケーションを設計しました。この方法により、ジゴキシゲニン標識プローブによって特異的に標的とされる最小限のDNA量を同定でき、抗ジゴキシゲニン抗体によって容易に検出されます。このアプローチは、スクリーニングの目的にとって貴重で満足のいくツールです。
Abstract
ドットブロットは、キャリアDNAの存在下でプローブハイブリダイゼーションによって特異的に標的とされる最小限の量のDNAの同定を可能にする、シンプル、高速、高感度、および汎用性の高い技術です。これは、ナイロン膜などの不活性固体支持体に既知の量のDNAを、ドットブロット装置を利用して電気泳動分離なしで転写することに基づいています。ナイロン膜は、高い核酸結合能(400μg / cm2)、高強度、および正または中性に帯電しているという利点があります。使用されるプローブは、ジゴキシゲニン(DIG)で標識された18〜20塩基の非常に特異的なssDNAフラグメントです。プローブは レプトスピラ DNAと結合します。プローブが標的DNAとハイブリダイズすると、抗ジゴキシゲニン抗体によって検出され、X線フィルムで明らかになった発光によって簡単に検出できます。発光のあるドットは、目的のDNA断片に対応します。この方法では、プローブの非同位体標識を採用しており、半減期が非常に長い場合があります。この標準的な免疫標識の欠点は、同位体プローブよりも感度が低いことです。それにもかかわらず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とドットブロットアッセイを組み合わせることで軽減されます。このアプローチにより、ターゲット配列の濃縮とその検出が可能になります。さらに、よく知られている標準の段階希釈と比較した場合の定量的アプリケーションとして使用できます。ここでは、水サンプル中の3つの主要なクレードから レプトスピラ を検出するためのドットブロットアプリケーションを紹介します。この方法論は、遠心分離によって濃縮された大量の水に適用して、レプトスパイラルDNAの存在の証拠を提供することができます。これは、一般的なスクリーニング目的にとって貴重で満足のいくツールであり、水中に存在する可能性のある他の培養不可能な細菌に使用できるため、生態系の理解が向上します。
Introduction
ヒトのレプトスピラ症は、主に環境源に由来します1,2。湖、川、小川でのレプトスピラの存在は、野生生物、および最終的にこれらの水域と接触する可能性のある家畜および生産動物の間でのレプトスピラ症の伝播の指標です1,3,4。さらに、レプトスピラは、下水、停滞水、水道水などの非天然水源で確認されています5,6。
レプトスピラは世界中に分布する細菌であり7,8、その保存と伝播における環境の役割はよく認識されています。レプトスピラは、さまざまなpHとミネラル9の飲料水、および天然の水域1で生存できます。また、蒸留水10中で長期間生存することができ、一定のpH(7.8)下では、最大152日間生存する可能性があります11。さらに、レプトスピラは、過酷な条件を生き残るために細菌コンソーシアムで相互作用する可能性があります12,13。アゾスピリルムやスフィンゴモナスを含む淡水中のバイオフィルムの一部である可能性があり、49°Cを超える温度に成長し、耐えることさえできます14,15。また、浸水した土壌で増殖し、最大379日間生存し続けることができ16、17,18年もの間病気を引き起こす能力を維持します。しかし、水域内の生態学と、それが水域内でどのように分布しているかについてはほとんど知られていません。
その発見以来、レプトスピラ属の研究は血清学的検査に基づいていました。分子技術がこのスピロヘータの研究でより普及したのは今世紀になってからでした。ドットブロットは、(1)16S rRNAおよび単純配列反復(ISSR)に基づく同位体プローブ19,20、(2)尿に適用されるヒトレプトスピラ症に対するナノゴールドベースの免疫測定法21、または(3)ウシ尿サンプル22に対する抗体ベースのアッセイとして、その同定にはほとんど使用されていません.この技術は、もともと同位体プローブに基づいていたため、使用されなくなりました。しかし、PCRと組み合わせることで、より高度な結果が得られることはよく知られた技術であり、非同位体プローブを使用しているため安全であると考えられています。PCRは、サンプル中に微量に見られる可能性のある特定のDNA断片を増幅することにより、レプトスピラDNAの濃縮に重要な役割を果たします。各PCRサイクル中に、標的DNA断片の量が反応で2倍になります。反応の終わりに、アンプリコンは100万倍以上になりました23。PCRによって増幅された生成物は、アガロース電気泳動では見えないことが多いが、ドットブロット24,25,26のDIG標識プローブとの特異的ハイブリダイゼーションによって見えるようになる。
ドットブロット法は、シンプルで堅牢で、多数のサンプルに適しているため、リソースが限られているラボでも利用することができます。これは、(1)口腔細菌27、(2)食物や糞便などの他のサンプルタイプ28、および(3)培養不可能な細菌の同定29を含むさまざまな細菌研究で採用されており、多くの場合、他の分子技術と一致しています。ドットブロット技術によって提供される利点の中には、(1)メンブレンは高い結合能力を持ち、200μg/ cm2 以上の核酸および最大400μg / cm2に結合することができる。(2)ドットブロットの結果は、特別な機器を必要とせずに視覚的に解釈でき、(3)室温(RT)で何年も保存することができます。
レプトスピラ属は、病原性、中間性、および腐生性のクレードに分類されています30,31。これらのクレード間の区別は、lipL41、lipL32、および16S rRNAなどの特定の遺伝子に基づいて達成できます。LipL32は病原性クレードに存在し、さまざまな血清学的および分子的ツールで高い感受性を示しますが、腐生植物種には存在しません21。ハウスキーピング遺伝子lipL41は、その安定した発現で知られており、分子技術32に使用され、16S rRNA遺伝子はそれらの分類に利用されています。
この方法は、遠心分離によって濃縮された大量の水に適用できます。これにより、水域内のさまざまなポイントと深さを評価して、レプトスパイラルDNAの存在とそれが属するクレードを検出できます。このツールは、生態学的および一般的なスクリーニング目的の両方に有用であり、水中に存在する可能性のある他の培養不可能な細菌を検出するためにも使用できます。
さらに、PCRおよびドットブロットアッセイは、高度な機器や高価な機器を持たないラボであっても、幅広いラボにとって技術的および経済的に手頃な価格です。この研究は、ジゴキシゲニンベースのドットブロットを、天然の水域から収集された水サンプル中の3つの レプトスピラ クレードの同定に適用することを目的としています。
細菌株
12の レプトスピラ 血清型動物(Autumnalis、Bataviae、Bratislava、Canicola、Celledoni、Grippothyphosa、Hardjoprajitno、Icterohaemorrhagiae、Pomona、Pyrogenes、Tarassovi、およびWolffi)がこの研究に含まれました。これらの血清型は、メキシコ国立自治大学獣医学部微生物学・免疫学科のコレクションの一部であり、現在、微小凝集試験(MAT)に使用されています。
すべての レプトスピラ 血清型動物はEMJHで培養され、それらのDNAは市販のDNA抽出キットを使用して抽出されました( 材料の表を参照)。12種類の血清型のゲノムDNA混合物を 、レプトスピラ 病原性クレードのポジティブコントロールとして使用した。 レプトスピラ 中間体クレードのポジティブコントロールとして、 Leptospira fainei serovar Hurstbridge株BUT6由来のゲノムDNAが含まれ、 レプトスピラ 腐生菌クレードのポジティブコントロールとして、 Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc株Patoc IのゲノムDNAも含まれていた。
ネガティブコントロールは、空のプラスミド、非血縁細菌(Ureaplasma urealyticum、黄色ブドウ球菌、Brucella abortus、Salmonella typhimurium、赤痢菌、肺炎桿菌、Acinetobacter baumannii、 および 大腸菌 )のDNA、および非テンプレートコントロールとして機能するPCRグレードの水で構成されていました。
水のサンプル
12の試験グラブサンプルは、Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center(CIBAC)から層別でたらめなサンプリング法を使用して収集されました(19°16'54" N 99°6'11" W)。これらのサンプルは、表層、10、30 cmの3つの深さで採取されました(図1A、B)。水の収集手順は、絶滅危惧種や保護種に影響を与えませんでした。各サンプルは、滅菌済みの15 mL微量遠心チューブに収集しました。サンプルを採取するために、各チューブを水に静かに沈め、選択した深さで充填してから密封しました。サンプルは22°Cに維持され、処理のためにすぐに実験室に運ばれました。
各サンプルは、滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブに8000 x g で20分間遠心分離して濃縮しました。このステップは、すべてのサンプルが1本のチューブに濃縮されるまで繰り返され、DNA抽出に使用されました(図1C)。
図1:遠心分離による水サンプルの濃度(A)採水池、(B)自然の流れ。(C)遠心分離ベースの水サンプル処理を必要な回数だけ繰り返します(n)。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
DNA抽出
全DNAは、製造元の指示に従って市販のゲノムDNAキットを使用して単離しました( 材料の表を参照)。DNA抽出物を20μLの溶出緩衝液中で溶出し、DNA濃度をUV分光光度計で260〜280nmで測定し、使用するまで4°Cで保存した。
PCR増幅
PCRターゲットは、16個のS rRNA、lipL41、およびlipL32遺伝子であり、レプトスピラ属のDNAを同定し、病原性、腐生性、および中間体の3つのクレードを区別することができます。プライマーとプローブの設計は、Ahmedら、Azaliら、Bourhyら、Weissら、およびBrangerらによる以前の研究に基づいていました33,34,35,36,37。各プローブ、プライマー、および増幅フラグメントの配列は、表1に記載され、参照配列とのアラインメントは、補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル4、および補足ファイル5に記載されている。PCR試薬とサーモサイクル条件は、プロトコルのセクションに記載されています。
増幅産物は、TAE(40 mM Tris 塩基、20 mM 酢酸、1 mM EDTA、pH 8.3)中の 1% アガロースゲル上で電気泳動分離し、エチジウムブロマイド検出を行い、エチジウムブロマイド検出を行い、補足図 1 に示すように可視化しました。各血清型から得られたゲノムDNAは、病原性レプトスピラのL.インターロガン(4, 691, 184 bp)38、腐生性レプトスピラのL. biflexa(3, 956, 088 bp)39のゲノムサイズに基づいて、各PCR反応において6 x 106から1 x 104ゲノム当量コピー(GEq)の範囲の濃度で使用されました。 L. fainei serovar Hurstbridge株BUT6(4、267、324 bp)のゲノムサイズ(アクセッション番号AKWZ00000000.2)。
プローブの感度は、各実験で各病原性血清型、 L. biflexa serovar Patoc Patoc I株、および L. fainei serovar Hurstbridge株BUT6のDNAで評価されました。PCRおよびドットブロットハイブリダイゼーションアッセイの特異性を評価するために、非血縁細菌由来のDNAを含めました。
表1:レプトスピラの病原性、腐生菌、および中間クレードを同定するための産物を増幅するためのPCRプライマーおよびプローブ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ
DNAサンプルを入れる穴がドット状になっており、真空吸引で所定の位置に固定するように吸引すると、この形状になることからドットブロットと呼ばれる手法です。この手法は、Kafatos et al.40によって開発されました。この技術により、各PCR陽性サンプル中のレプトスピラを半定量化できます。プロトコルは、室温でNaOH 0.4Mによる変性で構成され、6 x 106〜104レプトスパイアに対応する30ng〜0.05ngのレプトスピラDNAを含むサンプルを、96ウェルドットブロット装置でナイロンメンブレンにブロットします。固定化後、DNAは120mJのUV光にさらされることによって膜に結合します。各DNAプローブは、3'末端の末端トランスフェラーゼ触媒ステップによってジゴキシゲニン-11dUTPと結合される(ジゴキシゲニンは、レポーターとして使用されるジギタリス・プルプレアから得られる植物ステロイドである41)。標識されたDNAプローブ(50 pmol)を特定の温度で標的DNAに厳密にハイブリダイズした後、DNAハイブリッドは、その基質CSPDと共有結合した抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ抗体との化学発光反応によって可視化されます。発光は、X線フィルムへの曝露によって捕捉されます(図2)。
図2:PCRドットブロットアッセイの手順のステップ。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1.サンプル調製
- 各水サンプルを1.5 mLの微量遠心チューブに濃縮し、8,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 このステップを必要な回数繰り返して、サンプルを250 μLの容量に濃縮します。
- 製造元の指示に従ってDNA抽出キットを使用してください( 材料の表を参照)。
- 使用するドットブロットプローブに従って特異的PCRを実施します(表1)。
- 各水サンプルまたはリファレンスゲノムDNAから、1 X バッファー、2.5 ユニットの Taq ポリメラーゼ、各プライマー 1 μM、各 dNTP 0.2 mM、1.5 mM MgCl2、および各水サンプルまたはリファレンスゲノム DNA のターゲット DNA 100 ng を含む最終容量 25 μL の PCR チューブで増幅を行います。
- サーモサイクル条件に従ってサーモサイクラーでPCR反応をプログラムします(表2)。
- 使用するまで反応液を4°Cで保存してください。
- ブロットする各PCR産物10 μLを、96ウェルプレートの別々のウェルに入れます。
- 各ウェルに40 μLのTEを加え、ピペッティングで混合します。
注:96ウェルプレートは密封し、4°Cで一晩保存できます。 補足ファイル6 に記載されている指示に従って、プロトコルのバッファーと溶液を準備します。 図3 は、サンプル調製のステップを示しています。
表2:16S、lipL41、およびlipL32遺伝子のPCRサーモサイクリング条件。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図3:PCRとサンプル調製。 特異的PCRプロトコルを適用して、PCR産物をマイクロタイタープレートに移し、40μLのTEを各ウェルに添加した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
2. ドットブロット装置の組み立て
注:ドットブロット装置の組み立てを 図4に示します。処置中は、アルカリ溶液を取り扱うために手袋を着用し、ナイロン膜を汚染から保護します。
図4:ドットブロット装置の組み立て。 濾紙とナイロン膜(10 X SSPEで湿らせた状態)は、正しい順序で配置する必要があります。掃除機をかける前に、アセンブリをネジでしっかりと固定する必要があります。各ウェルはTEで洗浄する必要があり、PCR産物はそれぞれのウェルにロードされます。PCR産物をメンブレンを通して移した後、各ウェルをTEで再度洗浄し、乾燥させます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
- ナイロン膜( 材料の表を参照)と濾紙を12 x 8.5 cmのサイズにカットします。
- 膜に油性マーカーで印を付けます。
- 正しい方向を示すために、片方の端にハサミで切り込みを入れます。マークを使用して、サンプルの順序を覚えます。
- メンブレンと濾紙を10 X生理食塩水-リン酸ナトリウム-EDTA緩衝液(SSPE;3 M NaCl、0.2 M NaH2PO4、および0.02 M EDTA、pH 7.4)で湿らせます(補足ファイル6)。メンブレンは、清潔で先端が鈍いピンセットで取り扱ってください。
- ドットブロットチャンバーを組み立てます。まず、濾紙、次にプラスチックシールの上の膜。カバーをネジで横方向に固定します。
- チャンバーを真空に接続し、各ウェルに100μLのTEを入れ、真空を1分間保持してから停止します。
- 真空を低速でオンにし、各サンプルの50μLをドットブロット装置のメンブレン上の対応するウェルにロードします(事前に決定されたメンブレン分布に従います)。
注:各サンプルを赤血球凝集96ウェルプレートでホモジナイズしてから、ドットブロットチャンバーに入れます。 - 真空で膜を乾燥させます。必要に応じて、チャンバーを軽く叩いてサンプル内の気泡を放出します。
- 100 μLのTEを連続真空で入れて乾かして、各ウェルを洗浄します。
注意: 転送が完了したら、最初にポンプのスイッチを切り、取り外すことが重要です。そうしないと、逆流が装置に入る可能性があります。DNAは、正に帯電したナイロン膜が用いられるならば、変性工程を必要としないが、他の不活性支持体を用いるならば、予変性工程およびアルカリベースの変性が必要とされ得る41。
3. DNAの変性・固定
注: 図5 は、DNA膜固定手順を示しています。
図5:DNA膜固定手順。 DNAはアルカリ溶液中で変性します。次に、10 X SSPEで中和し、メンブレンを乾燥させます。次に、膜を透過照射します。メンブレンは2 X SSPEで再水和され、一晩プレハイブリダイズされます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
- メンブレンを0.4 M NaOHで室温で10分間インキュベートします。
- メンブレンを10 X SSPEで室温で10分間平衡化します。
- メンブレンを80°Cで2時間乾燥させます。
- 120 mJのUVライトで3分間トランスイルミネーションします。サンプルがUV光源に向いていることを確認してください。UV架橋剤を使用する場合は、サンプルが上を向いていることを確認し、この手順を2回繰り返します。
注:UV架橋の前に、メンブレンを完全に乾燥させる必要があります。DNAは、ナイロン膜への共有結合によって固定化されます。各架橋には約18インチから1フィートかかり、ほとんどのハイブリダイゼーション実験では、最適なUV照射量は約0.6〜0.8kJ / m2です。
紫外線を浴びると、目や皮膚に有害です。適切な保護具を着用し、素肌に触れないようにしてください。 - メンブレンを2 X SSPEで10分間洗浄します。
- メンブレンを注意深く折り畳み、ハイブリダイゼーションチューブに挿入します(15mLの微量遠心チューブを使用します)。
- プレハイブリダイゼーション溶液(Supplementary File 6)10 mLをチューブに加え、42°Cで一晩インキュベートします。漏れを防ぐために、チューブが適切に密閉されていることを確認してください。
4.ハイブリダイゼーション
- ハイブリダイゼーションチューブからプレハイブリダイゼーション溶液5mLを取り出します。5mLを2回目に使用する場合は、別のチューブに入れて-4°Cで保存してください。
- 標識プローブ(表1)15 μLをハイブリダイゼーションチューブに加えます。チップを溶液にすすぎ、標識プローブが希釈液に完全に注入されたことを確認します。
注:DNAプローブの結合は、抗原抗体結合ほど強くありません。したがって、サンプル中のプローブまたはDNAの濃度の変化は、放出される蛍光の強度に影響を与える可能性があります。DNAプローブは化学量論的であり、DNAに結合するプローブ分子の数は、溶液中に存在するDNA分子の数と同等です。 図6 は、プローブのハイブリダイゼーションを示しています。 - 42°Cで一晩インキュベートします。
- DNAプローブDIG標識を行います。 表3 の指示に従って試薬を混合し、混合物を37°Cで1時間インキュベートします。次に、80 μLの蒸留水を加え、テールプローブを4°Cで保存します。
図6:プローブハイブリダイゼーション。 ハイブリダイゼーションバッファーの容量を調整し、ジゴキシゲニン標識プローブを組み込んで、プローブのハイブリダイゼーションを一晩で行えます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
表3:ジゴキシゲニン(DIG)で標識したプローブ用試薬。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
5. 化学発光(抗DIGタギング)
- メンブレンを2 X SSPE/0.1% SDSで室温で10分間2回洗浄します。
- 5 X SSPE/0.1% SDSを使用して、プローブのアニーリング温度で15分間メンブレンをインキュベートします。
注意: このステップでは、蓋付きの容器を使用して、温度をできるだけ長く維持します。膜全体の均一で一定の温度を確保します。各洗浄のおおよその容量は、示された溶液の100mLです。 - メンブレンをバッファー1(補足ファイル6)で室温で5分間1回洗浄します。
- メンブレンをバッファー2(補足ファイル6)で室温で30分間1回洗浄します。
- メンブレンを緩衝液2で洗浄し、抗ジゴキシゲニン抗体(15 μL)を添加し( 材料表を参照)、45分間インキュベートします(インキュベーション時間は30〜60分と変化します)。この二次抗体は、検出のためにプローブにタグを付けます。
注:メンブレンは、抗ジゴキシゲニン抗体とともに緩衝液2に4〜8°Cで一晩保存できます。 化学発光プロセスの抗DIGタグ付けを 図7に示します。
図7:化学発光プロセスの抗DIGタグ付け。 結合していない核酸は緩衝液で除去されます。プローブをターゲットDNAにアライメントし、余分なものを取り除きます。メンブレンをブロッキング1Xバッファーでブロックし、抗DIG抗体を添加します(1:10000)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
6. 化学発光(基板応用)
- メンブレンを緩衝液1で室温で15分間2回洗浄します。
- 緩衝液3( 補足ファイル6を参照)で室温で5分間1回洗浄し、メンブレンは緩衝液の大部分を排出し、ほとんど乾燥させます。
- すぐに使用できるCSPD(3-(4-メトキシスピロ{1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}-4-イル)フェニルリン酸二ナトリウム、 材料の表を参照)を加え、5分間放置します(湿らせた指でCSPDを片側から反対側に均質化します)。
- メンブレンの寸法に合う透明なビニール袋(12.5 x 9 cm)にメンブレンを入れます。気泡を慎重に取り除き、CSPDを均等に分散させ、バッグをヒートシールします。
- メンブレンを37°Cの水浴中で15分間インキュベートし(最大30分間)、サンプルを含むメンブレンが下向きに配置され、十分に沈められるようにします。温度が一定に保たれ、膜全体に十分に分布していることを確認してください。
- ビニール袋を乾かし、すでに使用済みのX線フィルムにスコッチテープで固定します。これにより、露光手順中の取り扱いが容易になります。
注: 図8 は、化学発光プロセスの基板アプリケーションを示しています。
図8:化学発光プロセスの基板応用。 遊離抗体を除去し、基質CSPD(1:250)をメンブレンに添加します。反応は37°Cでのインキュベーションによって活性化され、膜はX線フィルムに化学発光を記録するように配置されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
7. 化学発光(検出)
- ばく露手順を実行します。暗室で、それぞれのトレイに現像液と定着液( 材料の表を参照)を準備します。
- 暗闇の中で、固定膜を新しいX線撮影フィルムに面して慎重に置き、X線撮影カセットに挿入します( 材料の表を参照)。
- 露光時刻を登録します。曝露時間は1分から30分以上までさまざまです。5分から始めて、それに応じて時間を調整します。
- 現像液でX線フィルムを1〜3分間湿らせ、水道水(15〜45秒)でやさしくすすいでください。
- X線フィルムを定着液で1〜3分間湿らせ、水道水(45秒)でやさしくすすいでください。
- X線フィルムを風乾させ、アッセイを目に見える白色のライトボックスに記録します。
注:X線露光時間中はメンブレンを振らないでください。検出プロセスを 図9に示します。 - 結果の解釈に進みます。露光されたX線フィルムでは、発光するドットを視覚的に配置し、プローブのハイブリダイゼーションを伴うDNA断片に対応することができます。放出される信号の強度は、発光と露光時間によって異なります。
注:メンブレンは、室温で数ヶ月間濾紙の間に乾燥させて保存することができます。
図9:化学発光プロセスの検出。 暗い条件下では、メンブレンはX線カセット内のX線フィルムに曝露されます。次に、博覧会の時間に放置し、X線フィルムを現像して固定しました。最後に、風乾して解釈しました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
8. 膜脱ハイブリダイゼーション手順
- メンブレンを蒸留水で10分間2回洗浄します。
- メンブレンを0.4 M NaOHで53°Cで20分間洗浄します(2回)。
- メンブレンを2倍に2回、SSPE2本で10分間洗浄します。
- メンブレンを室温で乾燥させます。
- メンブレンを保持し、プロトコルのステップ3.5に戻ります。
注:メンブレンは、プレハイブリダイゼーションバッファーに4〜8°Cで一晩保存することができます。 翌日、42°Cで1時間インキュベーションして再開し、プレハイブリダイゼーションバッファーを温度に到達させます。次に、プロトコルのステップ3.5に進みます。
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Representative Results
この技術の有効性を評価するために、各レプトスピラ血清型の純粋培養物からのゲノムDNAを、クレード特異的プローブとともに使用しました。膜は、各血清型のPCR反応ごとに100ngのゲノムDNAで調製され、続いて非関連細菌の8つのゲノムDNAとアドホックなレプトスピラ血清のゲノムDNAの可変濃度が続きました。各アッセイには、ポジティブ、ネガティブ、および非テンプレートコントロールが含まれていました。これらの非関連ゲノムDNAは、ドットブロットプローブに対して親和性を示さなかった。膜分布およびドットブロット膜は、補足図2、補足図3、補足図4、補足図5、補足図6、補足図7に示されている。腐生菌クレードについては、プライマー DB_16SPathoREVおよびDB_16SPathoFWDで増幅した1059 bpのPCR産物を用いたDB_Saproprobe、およびLeptospira biflexa serovar Patoc I株のゲノムDNAを用いてプライマー DB_16SSapREVおよびDB_16SSapFWDで増幅した517 bpのPCR産物を用いて、 0.05〜0.1 ngの腐生植物DNAを検出することが可能でした(補足図2および補足図3)。同様に、中間クレードの検出には、プライマー DB_16SPathoREVおよびDB_16SPathoFWDで増幅した1059 bpのPCR産物を含むDB_Interprobe、およびプライマーで増幅した299〜301 bpのPCR産物をDB_16SInterREVおよびDB_16SInterFWDで増幅し、Leptospira fainei serovar Hurstbridge株のゲノムDNAを使用します6(補足図4および補足図5)では、約0.1ngの中間DNAを検出することができました。同様に、SPathoREVおよびDB_16SPathoFWDのプライDB_16マーで増幅された1059 bpのPCR産物を用いたDB_16SPathoprobe、または病原性レプトスピラ血清からのゲノムDNA混合物を用いたプライマー DB_lipL41REVおよびDB_lipL41FWDによって増幅された479 bpのPCR産物を用いたDBlipL41プローブについて、 0.3〜0.6 ngの病原性DNAのDNA濃度を検出することが可能でした(補足図6および補足図7)。
3つのクレードを同定するために設計されたアッセイは、各クレードに対して個別に使用することができます。しかし、貴重で希少なサンプルの場合、1058-1069 bpの産物を増幅するSPathoREVおよびDB_16SPathoFWD DB_16プライマーで単一の膜を調製することができます。その後、本製品は、DB_Interprobe、DB_Saproprobe、およびDB_16S Pathoprobeと個別にハイブリダイズし、それぞれの前に脱ハイブリダイゼーションステップ(ステップ8)を行います。このアプローチにより、同じ膜内のすべてのクレードを識別できます。
野外水サンプルでは、lipL32プローブプロトコルを適用しました。各水サンプルのDNAは、PCR反応ごとに100 ngの濃度で使用しました。さらに、100 ngの レプトスピラ ゲノムDNAを15 mLの蒸留水サンプルにスパイクすることからなるDNA抽出プロトコルコントロールが含まれていました。陰性対照と陽性対照も含まれました(図10)。
表4:水サンプルの説明と深さ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図10:各水サンプルのドットブロットアッセイ(A)膜分布および(B)DB_lipL32probeのドットブロット、およびプライマーの産物(262 bp)DB_lipL32REVおよび野外水サンプルのDB_lipL32FWD。池3の表面は陽性の結果を示し、抽出プロトコルコントロールとポジティブコントロールの両方に強い信号があります。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
水サンプルの説明を 表4に、ドットブロット膜の分布と画像を 図9に示します。ドットA7は、レプトスパイラルDNAが池3の表面に存在していたことを示しています。池3に存在していたDNA濃度を決定するために、 レプトスピラ 血清型とlipL32プローブの混合物の既知のDNA濃度を使用してドットブロットアッセイを実施しました(図11)。膜は、各ドットに100ngから1×10〜13ng に分布したゲノムDNAを用いて調製した。間違いなく検出できる最小濃度は約0.3 ngで、水サンプル中の6 x 105 GEqに相当します。
図11:レプトスピラ血清型とlipL32プローブの混合物の既知のDNA濃度を用いたドットブロットアッセイ(A)病原性レプトスピラ血清のゲノムDNA混合物の希釈(1:2)でDB_lipL32REVおよびDB_lipL32FWDプライマーのDB_lipL32probeおよび生成物(262 bp)の膜分布および(B)膜分布およびドットブロット。プローブのシグナルは、3.91 x 10-1 ngのレプトスピラDNAミックスまで簡単に検出できます。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
補足図1:電気泳動分離によって視覚化されたPCR増幅産物。レーン1。分子量マーカー100 bp DNAラダー。レーン2。病原性レプトスピラDNAミックスをテンプレートとするlipL32遺伝子に基づくPCR。レーン3。病原性レプトスピラDNAミックスをテンプレートとして使用したlipL41遺伝子に基づくPCR。レーン4。病原性レプトスピラDNAミックスをテンプレートとする16S rRNA遺伝子に基づくPCR。レーン5。プライマー DB_16SSapREVおよびDB_16SSapFWDを使用した16S rRNA遺伝子に基づくPCR、およびテンプレートとしてのLeptospira biflexa serovar Patoc株Patoc I DNA。レーン6。プライマー DB_16SPathoREV と DB_16SPathoFWD を含む 16S rRNA 遺伝子、およびテンプレートとしての Leptospira biflexa serovar Patoc 株 Patoc I DNA に基づく PCR;レーン7。プライマー DB_16SInterREVおよびDB_16SInterFWD、および血清型ハーストブリッジ株BUT6 DNAをテンプレートとする16S rRNA遺伝子に基づくPCR。レーン8。SパトレブおよびDB_16SパトFWD DB_16プライマー、およびレプトスピラ・ファイネイ、血清型ハーストブリッジ株BUT6 DNAをテンプレートとする16S rRNA遺伝子に基づくPCR。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:(A)Leptospira biflexa serovar Patoc、Patoc IのゲノムDNAのプライマー DB_16SPathoREVおよびDB_16SPathoFWDのDB_Saproprobeおよび産物(1059 bp)の膜分布および(B)ドットブロット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:(A)Leptospira biflexa serovar Patoc、Patoc IのゲノムDNAのプライマー DB_16SSapREVおよびDB_16SSapFWDの産物(517 bp)によるDB_Saproprobeの膜分布および(B)ドットブロット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:(A)SパトレリブおよびDB_16SパトFWD DB_16プライマーの産物(1059 bp)およびレプトスピラ・フェイネイ血清型ハーストブリッジ株BUT6のゲノムDNAによるDB_Interprobeの膜分布およびドットブロット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:(A)膜分布とB)Leptospira fainei serovar Hurstbridge株BUT6のゲノムDNAを持つプライマー DB_16SInterREVおよびDB_16SInterFWDのDB_Interprobeおよび産物(299-301 bp)のドットブロット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:(A)DB_16S Pathoprobeの膜分布と(B)病原性レプトスピラ血清のゲノムDNA混合物を含むプライマー DB_16 S PathoREVおよびDB_16SPathoFWDの産物(1059 bp)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図7:(A)病原性 レプトスピラ 血清のゲノムDNA混合物を含むプライマー DB_lipL41REVおよびDB_lipL41FWDの産物(479 bp)によるDB_lipL41probeの膜分布および(B)ドットブロット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:腐生植物レプトスピラ種と16SリボソームRNA配列に基づくプライマーおよびプローブとのアライメント。プライマーは識別のために太字と黒で強調表示され、方向は黒い矢印で示されます。プローブは太字で示され、灰色で強調表示され、その位置は灰色の線でマークされています。整列されたシーケンスは薄い灰色で強調表示され、対応していないシーケンスは白黒で表示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:16SリボソームRNA配列に基づくプライマーおよびプローブとの中間レプトスピラ種のアラインメント。プライマーは識別のために太字と黒で強調表示され、方向は黒い矢印で示されます。プローブは太字で示され、灰色で強調表示され、その位置は灰色の線でマークされています。整列されたシーケンスは薄い灰色で表示され、対応していないシーケンスは白黒で表示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3:lipL32遺伝子配列に基づくプライマーおよびプローブと病原性 レプトスピラ 種のアラインメント。 プライマーは識別のために太字と黒で強調表示され、方向は黒い矢印で示されます。プローブは太字で示され、灰色で強調表示され、その位置は灰色の線でマークされています。整列されたシーケンスは薄い灰色で表示され、対応していないシーケンスは白黒で表示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4:lipL41遺伝子配列に基づく病原性 レプトスピラ 種とプライマーおよびプローブとのアライメント。 識別のために、プライマーは太字で黒で強調表示され、方向は黒の矢印で示されます。プローブは太字で示され、濃い灰色で強調表示され、その位置は灰色の線でマークされています。整列されたシーケンスは薄い灰色で表示され、対応していないシーケンスは白黒で表示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル5: レプトスピラ 種と、16S リボソームRNA配列を標的とするプライマーおよび腐生植物、中間種、および病原性種のプローブとのアラインメント。 識別のために、プライマーは太字で示され、黒で強調表示され、方向は黒の矢印で示されます。プローブは太字で示され、灰色で強調表示され、その位置は灰色の線で表されます。整列されたシーケンスは薄い灰色で、対応していないシーケンスは白と黒です。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル6:ドットブロットアッセイ用のバッファーと溶液。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ドットブロット技術の重要なステップには、(1)DNA固定化、(2)非相同DNAによる膜上の自由結合部位のブロッキング、(3)アニーリング条件下でのプローブと標的フラグメントとの間の相補性、(4)非ハイブリダイズプローブの除去、および(5)レポーター分子の検出が含まれます41。
PCR−ドット−ブロットは、ある種の限界を有し、例えば、この技術は、ハイブリダイズされた断片37のサイズに関する情報を提供しない、それは、第2または第3のプローブとの再ハイブリダイゼーションの前に単一膜の脱ハイブリダイゼーションを必要とし、そして、最終結果にかなりの時間と労力を必要とする。
この技術は、他の分子技術42,43およびその応用との一貫性を示しています。逆ドットブロット、ナノゴールドドットブロット21、およびドットELISA42は、16S rRNA29,43に基づくトレポネーマ44、ボレリアブルグドルフェリ45、大腸菌46、ヘリコバクターピロリ47、結核菌48,49などの生物の特定の遺伝子の検出、および植物のDNAまたはRNAの検出に採用されていますウイルス41.検出限界(LOD)は、この技術50によって一貫して確実に測定することができる微生物の最低濃度として定義され、ピロリ菌47の100pg(5×104細菌)から、臨床試料45中のB.ブルグドルフェリの単一細胞、および細胞未満であるfgまでの範囲であった。 結核菌の48,49。
この複合分析法の貴重な側面の1つは、検出限界を1次延長し、一貫性のない結果につながる可能性のある2つのサンプル条件による偽陰性の結果を克服する能力です:(1)DNAが不十分なサンプル、または(2)サンプル汚染により、陽性サンプルを100%検出できます25、45、47、48、49.PCR-Dot-blotは、アガロースゲル電気泳動で検出できるものよりも少量の増幅生成物を検出する能力を持ち、ネステッドおよびセミネステッドPCRのような2回目の増幅ステップの結果としての汚染を回避します。これらの利点は、分子技術に干渉する可能性のある無関係な供給源からのより広い範囲の阻害剤やDNAを含む可能性のある、低細菌電荷を含む環境サンプルを扱う場合に特に重要です。
以前の研究は、レプトスパイアが、5 pg(5 x 103レプトスパイア)のLODに達するフォトビオチンで標識されたDNAプローブによって同定される可能性があることを示唆している51。DIG標識プローブは0.1-1 pg(102 leptospire)を検出し、32P標識プローブは1-5 pg(750〜1000 leptospire)51を検出し、ビオチン標識プローブは5 pg(2500 leptospire)52を検出します。さらに、腐生植物レプトスピラの32個のP標識プローブは1.95 ng、病原性レプトスピラのLODは3.9 ng53に達しました。本研究では、3つのクレードについて同様のLODが確立された。病原性種のLODは約0.3 ngのゲノムDNA(6-8 x 104 GEq)(図11)であり、腐生植物および中間種については0.1 ng(2 x 104 GEq)に減少しました。特に、以前の研究は、病原性レプトスピラ54,55を検出し、レプトスピラ56の同定および分類のためのツールとして32P標識されたDNAハイブリダイゼーションを適用することを目的として、実験的に感染したゴールデンハムスターからの純粋なレプトスピラ培養物51および血清を用いて行われた.これらのプローブは高い特異性を示し、他の微生物19,51,54,55,56,57由来の非相同DNAとの交差ハイブリダイゼーションを示さず、レプトネマ57などの近縁種間でも区別することができる.同様に、この研究では、非相同DNAとのハイブリダイゼーションは観察されませんでした。非同位体プローブは、同位体プローブ58または他の技術43ほど感度が高くないが、リーシュマニアおよびウシヘルペスウイルス4(BHV4)の検出に見られるように、PCR-ドット-ブロットの組み合わせは、他のPCRベースの技術と比較して感度を最大10倍向上させることが期待できる24,26。
一方、レプトスピラ同定のためのドットブロットアッセイは、抗体でより頻繁に採用されており、最近では、尿サンプル中のヒトおよび動物を診断するための代替手段としてモノクローナル抗体を用いて採用されている59,60,61,62。これらの研究では、サンプルは事前のステップなしで膜上で直接処理され、抗体は病因に関連する特定のレプトスピラ表面タンパク質を標的とします。例えば、Mab-Dot-blot ELISAは高い感度と特異性を示し、わずか1 μgの細菌ホモジネート62を検出します。Mab-Dot-blotアッセイから得られた結果は、通常、尿のLODが約103 leptospires/mlまたは9.3 ngのLeptospira homogenate63を有するPCRアッセイに匹敵します。PCRによって増幅できるゲノムDNAの量は、100細胞(500fgのDNA)61である。これらの以前の研究では、濃縮手順のない純粋な培養物または臨床サンプルを使用し、より良い診断を目的としていました。感染したラットが107レプトスパイア/ mLの尿64を排泄することができ、犬が102〜106レプトスパイア/ mLの尿65を排泄し、水域の汚染源として機能することを考えると、環境サンプルはレプトスパイラル濃縮を必要とします。ブロッティング前に標的DNAをin vitro PCR増幅すると、最大10倍の手順感度が52,55倍向上します。通常、エンドポイントPCRによって増幅された生成物は、アガロースゲル電気泳動では視覚化されません。それにもかかわらず、ドットブロット中のDIG標識プローブの特異的ハイブリダイゼーションによって明らかになります。
レプトスピラとレプトスピラ症に関する多くの研究は病気の診断に焦点を当てていますが、水域での生態と水域内の分布についてはほとんど知られていません。PCR-ドットブロット法は、レプトスピラとレプトスピラ症を研究するためのツールボックスに追加され、多数のサンプルをスクリーニングし、結果と解釈を迅速化できるという利点があります。PCR-ドットブロットは、比較的低コストで簡便な非放射性技術で、1つのメンブレンに複数のプローブを収容することができます。さらに、リソースが限られている環境で困難な高度な機器や複雑なワークフローが不要になります。
この研究の影響は、土壌、停滞水、糞便、血液、組織など、他の生態学的ニッチやサンプルタイプだけでなく、さまざまな深さの大規模な水域を研究するための将来の応用にあります。
結論として、この研究は、 レプトスピラ属内の3つのクレードを同定するためのDNAプローブのジゴキシゲニン標識に基づくPCR-ドットブロット技術の応用を実証しています。この方法は、同定プロセスを単一の増幅ステップに減らすことによって合理化し、単一の膜を使用して3つの同時ハイブリダイゼーションまたは3つの連続ハイブリダイゼーションのいずれかを可能にします。この技術で達成される検出限界は、放射性プローブ53で達成されるものと同様であり、天然源からの水サンプル中の レプトスピラ を識別するための貴重なツールとなっています。その結果、この手法は感度が向上し、最小限の細菌DNAでサンプルを評価する際に正確で一貫した結果が得られます。これは、水域における レプトスピラ の動態を研究するための代替アプローチとして機能し、より広範な環境サンプルの評価と監視に役立ち、この微生物の伝染に対する予防策の実施に役立つ可能性があります。
この手法で問題が発生した場合は、次のトラブルシューティングのハイライトを考慮してください:(1)ドットの形状が不規則な場合は、真空システムが横方向にしっかりと閉じていることを確認してから、転送を繰り返します。(2)一晩の手順中にハイブリダイゼーションチューブが破損し、メンブレンがハイブリダイゼーションバッファーを失う場合は、「脱ハイブリダイゼーション手順」セクションを参照して、プロセスを再開します。(3)ドットが見えない場合は、膜を捨てないでください。「脱ハイブリダイゼーション手順」セクションに進み、ハイブリダイゼーション手順を繰り返します。(3) 現像したX線フィルムに白いムラが見られる場合は、袋密封時に気泡が溜まらないようにしてください。(5) 現像したX線フィルムに黒ムラが見られる場合は、湿らせた指でCSPDが十分に分布していることを確認してください。(6) X線フィルムにドットの影が見える場合は、露光時間中にフィルムが動かないようにしてください。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言する。
Acknowledgments
メキシコ国立自治大学獣医学部微生物学・免疫学科のレプトスピラコレクションに恩義を感じています。参照レプトスピラ株の寛大な寄付に感謝します。Leptospira fainei serovar Hurstbridge株BUT6およびLeptospira biflexa serovar Patoc株Patoc IからAlejandro de la Peña Moctezuma博士へ。CIBACコーディネーターのホセ・アントニオ・オカンポ・セルバンテス博士と、後方支援をしてくれた職員に感謝します。EDTは、メトロポリタン自治大学キャンパスクアジマルパの学部生向けのターミナルプロジェクトプログラムの下にありました。図1、図3から図9の作成にソフトウェア Biorender.com を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Purelink DNA extraction kit | Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) | Promega | M3001 | |
| Whatman filter paper, grade 1, | Merk | WHA1001325 | |
| Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m | Roche | 11417240001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody | Roche | 11093274910 | |
| Medium Base EMJH | Difco | S1368JAA | |
| Leptospira Enrichment EMJH | Difco | BD 279510 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate | Merk | 11755633001 | |
| Deoxyribonucleic acid from herring sperm | Sigma Aldrich | D3159 | |
| Developer Carestream | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| Digoxigenin-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fixer Carestream | Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
| Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | It is an anionic surfactant |
| Polivinylpyrrolidone (PVP-40) | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Terminal transferase, recombinant | Roche | 3289869103 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | It can be Home-made following Supplementary File 6 |
| Primers | Sigma-Aldrich | On demand | Follow table 1 |
| Probes | Sigma-Aldrich | On demand | Follow table 1 |
| Equipment | |||
| Nanodrop™ One Spectrophotometer | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl | Gilson | SKU:F167360 | |
| Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) | Axygen | MCT-150-SP | |
| Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) | Axygen | 3208 | |
| Disposable Pipette tips 1-10 µl | Axygen | T-300 | |
| Disposable Pipette tips 1-200 µl | Axygen | TR-222-Y | |
| Dot-Blot apparatus Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| Portable Hergom Suction | Hergom | 7E-A | |
| Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| UV Crosslinker | Hoefer | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler | Hybaid | HBPX110 | |
| Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 | Fuji |
References
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055 (2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N.
- Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
- Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
- Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
- Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
- Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898 (2015).
- Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843 (2015).
- Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
- Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
- Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
- Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
- Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
- Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
- Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051 (2015).
- Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721 (2022).
- Gillespie, R. W., Ryno, J.
- Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
- Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
- Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
- Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
- Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
- Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
- Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
- Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
- Pilatti, M. M., Ferreira, S. deA., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
- Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
- Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
- Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
- Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M.
- Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816 (2018).
- Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
- Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241 (2016).
- Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28 (2006).
- Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
- Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996 (2016).
- Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
- Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
- Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607 (2008).
- Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
- Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , Springer Protocols Handbooks. Humana, NewYork, NY. 303-321 (2020).
- Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317 (2021).
- Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
- Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
- Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
- Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
- Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
- Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
- Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356 (2007).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
- Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
- Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
- Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
- Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
- Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
- Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
- Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
- Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
- Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
- Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
- Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
- Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250 (2017).
- Levett, P. N.
- Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
- Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).
