Summary
在这项研究中，设计了一种斑点印迹应用来检测水样中三个主要分支的 钩端螺旋体 。该方法允许鉴定地高辛标记探针特异性靶向的最小 DNA 量，很容易被抗地高辛抗体检测到。这种方法是用于筛选目的的有价值和令人满意的工具。
Abstract
斑点印迹是一种简单、快速、灵敏且用途广泛的技术，能够在存在载体 DNA 的情况下鉴定探针杂交特异性靶向的最小量 DNA。它基于将已知量的 DNA 转移到惰性固体支持物（例如尼龙膜）上，利用斑点印迹装置，无需电泳分离。尼龙膜具有核酸结合载量高（400 μg/cm2）、强度高、带正电荷或带中性电荷等优点。使用的探针是高度特异性的 ssDNA 片段，由 18 至 20 个碱基组成，用地高辛 （DIG） 长标记。探针将与 钩端螺旋体 DNA 结合。一旦探针与目标 DNA 杂交，它就会被抗地高辛抗体检测到，从而可以通过 X 射线胶片中显示的发射物轻松检测。带有发射的点将对应于感兴趣的 DNA 片段。该方法采用探针的非同位素标记，其半衰期可能非常长。这种标准免疫标记物的缺点是灵敏度低于同位素探针。然而，通过偶联聚合酶链反应 （PCR） 和斑点印迹测定可以缓解这种情况。这种方法可以富集靶序列并进行检测。此外，与知名标准品的系列稀释液相比，它可以用作定量应用。本文介绍了一种斑点印迹法检测水样中三个主要分支钩 端螺旋体 的应用方法。一旦通过离心浓缩了大量的水，就可以将这种方法应用于大量的水，以提供钩端螺旋体DNA存在的证据。对于一般筛查目的，这是一种有价值且令人满意的工具，可用于水中可能存在的其他不可培养细菌，从而增强对生态系统的理解。
Introduction
人类钩端螺旋体病主要源于环境来源1,2。钩端螺旋体存在于湖泊、河流和溪流中，是钩端螺旋体病在野生动物以及最终可能接触这些水体的家畜和生产动物中传播的一个指标1,3,4。此外，钩端螺旋体已在非自然资源中被发现，包括污水、死水和自来水 5,6。
钩端螺旋体是一种全球分布的细菌7,8，环境在其保存和传播中的作用已得到充分认识。钩端螺旋体可以在可变 pH 值和矿物质9 下的饮用水中生存，并且可以在自然水体中生存1。它也可以在蒸馏水中长期存活10，在恒定的 pH 值 （7.8） 下，它可以存活长达 152 天11。此外，钩端螺旋体可能在细菌联合体中相互作用，以在恶劣的条件下生存12,13。它可能是淡水中生物膜的一部分，含有偶氮螺菌和鞘氨醇单胞菌，甚至能够生长和承受超过 49 °C的温度 14,15。它还可以在涝渍的土壤中繁殖，并保持活力长达 379 天16，保持其引起疾病的能力长达一年17,18。然而，人们对水体内的生态学及其在水体中的分布知之甚少。
自发现以来，钩端螺旋体属的研究基于血清学测试。直到本世纪，分子技术才在这种螺旋体的研究中变得更加普遍。点印迹法很少用于使用 （1） 基于 16S rRNA 和简单序列重复序列 （ISSR） 19,20 的同位素探针进行鉴定，（2） 作为应用于尿液的人钩端螺旋体病的基于纳米金的免疫测定21，或 （3） 作为基于抗体的牛尿液样本测定22.该技术被废弃了，因为它最初是基于同位素探针的。然而，它是一种众所周知的技术，与PCR相结合，可以产生更好的结果，并且由于使用了非同位素探针，它被认为是安全的。PCR在钩端螺旋体DNA的富集中起着至关重要的作用，它通过扩增可能在样品中微量发现的特定DNA片段。在每个PCR循环中，反应中靶向DNA片段的量增加一倍。在反应结束时，扩增子已乘以超过一百万倍23。通过PCR扩增的产物在琼脂糖电泳中通常不可见，通过在斑点印迹24,25,26中使用DIG标记的探针进行特异性杂交而变得可见。
斑点印迹技术简单、稳健，适用于大量样品，使资源有限的实验室能够使用。它已被用于各种细菌研究，包括 （1） 口腔细菌27，（2） 其他样品类型，如食物和粪便28，以及 （3） 不可培养细菌的鉴定29，通常与其他分子技术一致。斑点印迹技术的优点包括：（1）该膜具有高结合载量，能够结合超过200μg/cm 2 的核酸和高达400μg/cm2的核酸;（2） 斑点印迹结果无需特殊设备即可目视解读，（3） 它们可以在室温 （RT） 下方便地储存多年。
钩端螺旋体属已分为致病性、中间性和腐生分支30,31。这些分支之间的区别可以基于特定的基因来实现，例如 lipL41、lipL32 和 16S rRNA。LipL32 存在于致病分支中，在各种血清学和分子工具中表现出高敏感性，而在腐生菌属21 中不存在。管家基因 lipL41 以其稳定的表达而闻名，并在分子技术中使用32，而 16S rRNA 基因用于分类。
一旦通过离心浓缩了大量的水，这种方法就可以应用于水。它允许评估水体内的各个点和深度，以检测钩端螺旋体DNA的存在及其所属的分支。该工具对于生态学和一般筛查目的都很有价值，也可用于检测水中可能存在的其他不可培养细菌。
此外，PCR和斑点印迹检测对于各种实验室来说在技术和经济上都是负担得起的，即使是那些缺乏复杂或昂贵设备的实验室也是如此。本研究旨在应用基于地高辛的斑点印迹法鉴定从自然水体收集的水样中的三个 钩端螺旋体 分支。
菌株
本研究纳入 12 个 钩端螺旋体 血清型（Autumnalis、Bataviae、Bratislava、Canicola、Celledoni、Grippothyphosa、Hardjoprajitno、Icterohaemorrhagiae、Pomona、Pyrogenes、Tarassovi 和 Wolffi）。这些血清型是墨西哥国立自治大学兽医和动物技术学院微生物学和免疫学系收集的一部分，它们目前用于微凝集试验 （MAT）。
所有 钩端螺旋体 血清型均在 EMJH 中培养，并使用商业 DNA 提取试剂盒提取其 DNA（参见 材料表）。将 12 个血清型的基因组 DNA 混合物用作 钩端螺旋体 致病分支的阳性对照。作为 钩端螺旋体 中间分支的阳性对照，纳入了 Fainei钩端螺旋 体血清型Hurstbridge菌株BUT6的基因组DNA，作为钩 端螺旋 体腐生菌分支的阳性对照，还包括 双曲钩端螺旋体 血清型Patoc菌株Patoc I的基因组DNA。
阴性对照包括空质粒、来自非亲缘细菌（解脲支原体、金黄色葡萄球菌、流产布鲁氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、博伊氏志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌 和 大肠杆菌）的 DNA 和 PCR 级水，用作非模板对照。
水样
使用分层随机抽样方法从Cuemanco生物和水产养殖研究中心（CIBAC）（19° 16' 54“ N 99° 6' 11” W）收集了12个试验抓取样本。这些样品是在三个深度获得的：浅表、10 和 30 厘米（图 1A、B）。取水程序没有影响任何濒危或受保护的物种。每个样品都收集在无菌 15 mL 微量离心管中。为了收集样品，将每个试管轻轻浸入水中，在选定的深度填充，然后密封。将样品保持在22°C，并迅速运送到实验室进行处理。
通过在无菌 1.5 mL 微量离心管中在室温下以 8000 x g 离心 20 分钟浓缩每个样品。重复此步骤，直到所有样品浓缩到一个试管中，然后用于DNA提取（图1C）。
图1：通过离心浓缩水样。 （A） 水样池塘，以及 （B） 自然溪流。（C） 基于离心法的水样处理，根据需要重复多次（n）。 请点击这里查看此图的较大版本.
DNA提取
根据制造商的说明，使用商业基因组 DNA 试剂盒分离总 DNA（参见 材料表）。将DNA提取物在20μL洗脱缓冲液中洗脱，通过UV分光光度计在260-280nm处测定DNA浓度，并在4°C下储存直至使用。
PCR扩增
PCR 靶标是 16个 S rRNA、lipL41 和 lipL32 基因，它们识别钩端螺旋体属的 DNA，并允许区分三个分支：致病性、腐生性和中间体。引物和探针的设计均基于 Ahmed 等人、Azali 等人、Bourhy 等人、Weiss 等人和 Branger 等人之前的工作33,34,35,36,37。每种探针、引物和扩增片段的序列见表1，其与参考序列的比对见补充文件1、补充文件2、补充文件3、补充文件4和补充文件5。PCR试剂和热循环条件在协议部分进行了描述。
通过在TAE（40mM Tris碱，20mM乙酸和1mM EDTA;pH 8.3）中，在60 V下电泳分离45 min，使用乙锭溴化物检测45分钟来观察扩增产物，如补充图1所示。根据致病性钩端螺旋体的基因组大小（4， 691， 184 bp）38，腐生钩端螺旋体的基因组大小（3， 956， 088 bp）39，从每个血清型获得的基因组DNA的浓度范围为6 x 106至1 x 104个基因组当量拷贝（GEq）， Fainei serovar Hurstbridge菌株BUT6的基因组大小（4,267,324 bp），种质数为AKWZ00000000.2。
在每个实验中，使用来自每个致病性血清型的 DNA 评估探针的灵敏度，即 L. biflexa 血清型 Patoc 菌株 Patoc I 和 L. fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6。为了评估PCR和斑点印迹杂交测定的特异性，包括来自非亲缘细菌的DNA。
表1：PCR引物和探针，用于扩增产物，用于鉴定钩端螺旋体的致病性、腐生菌和中间分支。请按此下载此表格。
斑点印迹杂交试验
该技术被称为点印迹，因为放置 DNA 样品的孔具有点状，当它们被吸入通过真空吸力固定到位时，它们会获得这种形状。该技术由 Kafatos 等人开发[40]。该技术允许对每个PCR阳性样品中的 钩端螺旋体 进行半定量。该方案包括在室温下用NaOH 0.4M变性，将具有30ng至0.05ng的 钩端螺旋 体DNA样品，对应于6×106 至1×104 钩端螺旋体，用96孔斑点印迹装置吸迹到尼龙膜上。固定后，DNA 通过暴露于 120 mJ 紫外线与膜结合。每个 DNA 探针通过 3' 端的末端转移酶催化步骤与地高辛-11 dUTP 偶联（地高辛是从 洋地黄获得的植物类固醇，用作报告基因41）。在将标记的 DNA 探针 （50 pmol） 在特定温度下严格杂交到靶 DNA 上后，通过化学发光反应与抗地高辛碱性磷酸酶抗体与其底物 CSPD 共价偶联来观察 DNA 杂交体。通过暴露于X射线胶片来捕获发光（图2）。
图 2：PCR-dot-blot 检测的程序步骤。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Protocol
1. 样品制备
- 通过在4°C下以8,000× g 离心10分钟，将每个水样品浓缩在1.5mL微量离心管中。 根据需要多次重复此步骤，将样品浓缩到 250 μL 的体积中。
- 根据制造商的说明使用 DNA 提取试剂盒（参见 材料表）。
- 根据将使用的斑点印迹探针进行特异性PCR（表1）。
- 在PCR管中进行扩增，最终体积为25μL，含有1X缓冲液，2.5单位Taq聚合酶，1μM每种引物，0.2mM每种dNTP，1.5mM MgCl2和100ng靶DNA，来自每个水样品或参考基因组DNA。
- 根据热循环条件在热循环仪中对PCR反应进行编程（表2）。
- 将反应物储存在4°C直至使用。
- 将 10 μL 要印迹的每种 PCR 产物置于 96 孔板的单独孔中。
- 向每个孔中加入 40 μL TE，并通过移液混合。
注意：96孔板可以密封并在4°C下储存过夜。按照 补充文件 6 中提供的说明为协议准备缓冲液和溶液。 图 3 描述了样品制备的步骤。
表2：16个S、lipL41和lipL32基因的PCR热循环条件。请按此下载此表格。
图3：PCR和样品制备。 应用特定的PCR方案，将PCR产物转移到微量滴定板中，并向每个孔中加入40μL TE。 请点击这里查看此图的较大版本.
2. 组装斑点印迹仪
注：斑点印迹仪的组装如图 4所示。在此过程中，戴上手套处理碱溶液并保护尼龙膜免受污染。
图 4：斑点印迹装置组装。 滤纸和尼龙膜（先前在 10 X SSPE 中润湿）必须按正确的顺序排列。在施加真空之前，必须用螺钉紧紧固定组件。每个孔都需要用TE洗涤，并将PCR产物加载到各自的孔中。将PCR产物转移至膜后，再次用TE洗涤每个孔并使其干燥。 请点击这里查看此图的较大版本.
- 将尼龙膜（见 材料表）和滤纸切成 12 x 8.5 厘米大小的片材。
- 用永久性记号笔标记膜。
- 用剪刀在一边做一个凹口，以指示正确的方向。使用标记记住样品顺序。
- 用10X盐水 - 磷酸钠 - EDTA缓冲液（SSPE;3M NaCl，0.2M NaH2PO4和0.02M EDTA，pH 7.4）润湿膜和滤纸（补充文件6）。用干净的钝头镊子处理膜。
- 组装斑点印迹室;首先是滤纸，然后是膜上的塑料密封。用螺丝以交叉方式固定盖子。
- 将腔室连接到真空室，在每个孔中放置 100 μL TE，保持真空 1 分钟，然后停止。
- 低速开启真空，将 50 μL 每个样品加载到斑点印迹装置膜上的相应孔中（按照预先确定的膜分布）。
注：在将其放入斑点印迹室之前，先将血凝 96 孔板中的每个样品均质化。 - 让真空吸尘器干燥膜。如有必要，轻轻撞击腔室以释放样品中的气泡。
- 通过将 100 μL TE 放入连续真空中并使其干燥来洗涤每个孔。
注意： 完成转移后，首先关闭泵并将其拆下至关重要。否则可能会导致回流进入设备。如果使用带正电荷的尼龙膜，则 DNA 不需要变性步骤，但如果使用其他惰性支持物，则可能需要预变性步骤和碱基变性41。
3. DNA变性和固定
注： 图 5 说明了 DNA 膜固定程序。
图 5：DNA 膜固定程序。 DNA 在碱性溶液中变性。接下来，用10 X SSPE中和，并将膜干燥。接下来，膜被透射。膜用 2 X SSPE 再水化并预杂交过夜。 请点击这里查看此图的较大版本.
- 在室温下用 0.4 M NaOH 孵育膜 10 分钟。
- 在室温下用10X SSPE平衡膜10分钟。
- 将膜在80°C下干燥2小时。
- 用 120 mJ 紫外线透射 3 分钟。确保样品正面朝下朝向紫外线光源。如果使用紫外线交联剂，请确认样品朝上，并重复此步骤两次。
注意：在紫外线交联之前，膜必须完全干燥。DNA 将通过共价键固定在尼龙膜上。对于大多数杂交实验，每次交联大约需要 18'' 到 1'，最佳紫外线照射剂量约为 0.6-0.8 kJ/m2。
暴露在紫外线照射下对眼睛和皮肤有害。穿戴适当的防护装备，避免暴露在裸露的皮肤上。 - 用 2 X SSPE 洗涤膜 10 分钟。
- 小心地折叠膜并将其插入杂交管中（使用 15 mL 微量离心管）。
- 向试管中加入10mL预杂交溶液（补充文件6），并在42°C下孵育过夜。确保管子已正确密封，以防止任何泄漏。
4. 杂交
- 从杂交管中取出 5 mL 预杂交溶液。要再次使用5mL，请将其保存在另一个管中并储存在-4°C。
- 将 15 μL 标记的探针（表 1）加入杂交管中。将吸头冲洗到溶液中，以确保标记的探针已彻底滴入稀释液中。
注意：DNA探针的结合不如抗原-抗体结合强。因此，探针或样品中DNA浓度的变化会影响发射荧光的强度。DNA 探针是化学计量的，这意味着与 DNA 结合的探针分子数量等于溶液中存在的 DNA 分子数量。 图6 描绘了探针杂交。 - 在42°C孵育过夜。
- 执行 DNA 探针 DIG 标记。按照 表3 中指定的说明混合试剂，然后将混合物在37°C下孵育1小时。接下来，加入80μL蒸馏水，并将尾探针储存在4°C。
图 6：探针杂交。 调节杂交缓冲液的体积，并掺入地高辛标记的探针，以使探针杂交过夜。 请点击这里查看此图的较大版本.
表 3：用地高辛 （DIG） 标记探针的试剂。请按此下载此表格。
5. 化学发光（anti-DIG tagging）
- 在室温下用 2 X SSPE/0.1% SDS 洗涤膜两次 10 分钟。
- 在探针的退火温度下用 5 X SSPE/0.1% SDS 孵育膜 15 分钟。
注意： 在此步骤中，请使用带盖的容器尽可能长时间地保持温度。确保整个膜的温度均匀恒定。每次洗涤的大约体积为所示溶液的 100 mL。 - 在室温下用缓冲液 1（补充文件 6）洗涤膜一次 5 分钟。
- 在室温下用缓冲液 2（补充文件 6）洗涤膜一次 30 分钟。
- 用缓冲液 2 洗涤膜并加入抗地高辛抗体 （15 μL）（参见 材料表），然后孵育 45 分钟（孵育时间可能在 30-60 分钟之间变化）。这种二抗对探针进行标记以进行检测。
注意：膜可以与抗地高辛抗体一起在4-8°C下储存在缓冲液2中过夜。 化学发光过程的反DIG标记如图 7所示。
图 7：化学发光过程的 Anti-DIG 标记。 用缓冲溶液去除未结合的核酸。将探针与靶 DNA 对齐，并去除多余的 DNA。用封闭的 1 X 缓冲液封闭膜，加入抗 DIG 抗体 （1：10000）。 请点击这里查看此图的较大版本.
6. 化学发光（底物应用）
- 在室温下在缓冲液 1 中洗涤膜两次 15 分钟。
- 在室温下在缓冲液 3（参见 补充文件6）中洗涤一次 5 分钟，让膜排出大部分缓冲液，使其几乎干燥。
- 加入即用型CSPD（3-（4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-氯）三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基）苯基磷酸酯，见 材料表），并静置5分钟，（用阻尼的手指将CSPD从一侧均质到另一侧）。
- 将膜放入适合膜尺寸的透明塑料袋 （12.5 x 9 cm） 中。小心地去除气泡，均匀分布 CSPD，然后热封袋子。
- 将膜在37°C的水浴中孵育15分钟（最长可达30分钟），并确保将带有样品的膜向下放置，以便其充分浸没。确保温度保持恒定并在膜上均匀分布。
- 将塑料袋晾干，并用透明胶带将其固定在已经使用的射线照相胶片上。这将允许在曝光过程中轻松处理。
注： 图8 显示了化学发光过程的底物应用。
图8：化学发光工艺的底物应用。 去除游离抗体，将底物 CSPD （1：250） 加入膜中。通过在37°C下孵育使反应活化，并将膜布置以记录X射线膜中的化学发光。 请点击这里查看此图的较大版本.
7.化学发光（检测）
- 执行曝光程序。在暗室中，在相应的托盘中准备显影剂和定影剂溶液（参见 材料表）。
- 在黑暗中，小心地将固定膜朝向新的射线照相胶片，然后将其插入射线照相盒中（参见 材料表）。
- 记录曝光时间。暴露时间可能从 1 分钟到 30 分钟或更长时间不等。从 5 分钟开始，并相应地调整时间。
- 在显影剂溶液中润湿X射线胶片1-3分钟，并用自来水轻轻冲洗（15-45秒）。
- 将X射线胶片在定影剂溶液中浸湿1-3分钟，然后用自来水轻轻冲洗（45秒）。
- 让 X 射线胶片风干，并在可见的白色灯箱中记录测定结果。
注意： 避免在 X 射线曝光期间摇晃膜。检测过程如图 9 所示。 - 继续进行结果解释。在暴露的X射线胶片中，可以目视定位带有发射的点，并通过探针的杂交与DNA片段相对应。发射信号的强度取决于发光和曝光的持续时间。
注意：膜可以在室温下在滤纸之间干燥储存数月。
图9：化学发光过程的检测。 在黑暗条件下，膜暴露在 X 射线盒内的 X 射线胶片中。接下来，在展览期间让它静置，然后显影并固定X射线胶片。最后，它被风干并进行了解释。 请点击这里查看此图的较大版本.
8. 膜去杂交程序
- 用蒸馏水洗涤膜两次，每次10分钟。
- 在53°C下用0.4M NaOH洗涤膜20分钟（两次）。
- 用 2 X SSPE 洗涤膜两次 10 分钟。
- 让膜在室温下干燥。
- 保留膜并返回到方案的步骤3.5。
注：膜可以在4-8°C下储存在预杂交缓冲液中过夜。 第二天，在42°C下孵育1小时，使预杂交缓冲液达到温度。然后，继续执行协议的第 3.5 步。
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Representative Results
为了评估该技术的有效性，使用了来自每种 钩端螺旋体 血清型的纯培养物的基因组 DNA 以及分支特异性探针。每个血清型的每次 PCR 反应用 100 ng 基因组 DNA 制备膜，然后用非相关细菌的 8 个基因组 DNA 和 临时钩端螺旋体 血清型的可变浓度基因组 DNA 制备膜。每种测定包括阳性、阴性和非模板对照。这些不相关的基因组DNA对斑点印迹探针没有显示出亲和力。膜分布和斑点印迹膜如 补充图2、补充图3、补充图4、补充图5、补充图6、补充图7所示。关于腐生菌分支，使用引物DB_16SPathoREV 和 DB_16S PathoFWD扩增的 1059 bp PCR 产物的 DB_Saproprobe，以及用引物DB_16 SSapREV 和 DB_16SSapFWD 扩增的 517 bp 的 PCR 产物与 钩端螺旋体 血清型 Patoc 菌株 Patoc I 的基因组 DNA， 可以检测到0.05-0.1ng的腐生菌DNA（补充图2 和 补充图3）。同样，对于中间分支的检测，使用用引物DB_16SPathoREV和DB_16S PathoFWD扩增的1059 bp的PCR产物的DB_Interprobe，以及用引物DB_16SInterREV和DB_16SInterFWD扩增的299-301 bp的PCR产物与 Leptospira fainei serovar Hurstbridge菌株BUT6的基因组DNA（补充图4 和 补充图5），可以检测到大约 0.1 ng 的中间 DNA。同样，对于使用DB_16SPathoprobe的病原分支，其PCR产物为1059 bp，由引物DB_16SPathoREV和DB_16S PathoFWD扩增，或DBlipL41探针的PCR产物为479 bp，由引物DB_lipL41REV扩增，DB_lipL41FWD具有来自致病性 钩端螺旋体 血清型的基因组DNA混合物， 可以检测0.3-0.6ng致病性DNA的DNA浓度（补充图6 和 补充图7）。
设计用于鉴定三个分支的检测方法可以单独用于每个分支。然而，在有价值和稀缺样品的情况下，可以使用引物DB_16 SPathoREV 和 DB_16S PathoFWD制备单个膜，它们扩增 1058-1069 bp 的产物。然后，该产品可以分别与 DB_Interprobe、DB_Saproprobe 和 DB_16SPathoprobe 杂交，在它们中的每一个之前进行去杂交步骤（第 8 步）。这种方法可以识别同一膜中的所有分支。
在现场水样中，应用lipL32探针方案。每个水样的 DNA 每次 PCR 反应的浓度为 100 ng。此外，还包括 DNA 提取方案对照，其中包括将 100 ng 钩端螺旋体 基因组 DNA 加标到 15 mL 蒸馏水样品中。阴性和阳性对照也包括在内（图10）。
表4：水样描述和深度。请按此下载此表格。
图 10：每种水样的斑点印迹测定。 （A） DB_lipL32probe的膜分布和 （B） 斑点印迹以及引物的产物 （262 bp） DB_lipL32REV和田间水样的DB_lipL32FWD。池塘 3 的表面显示阳性结果，提取协议对照和阳性对照都有强烈的信号。 请点击这里查看此图的较大版本.
水样描述如 表4所示，斑点印迹膜分布和图像如图 9所示。点 A7 表示 Leptospiral DNA 存在于池塘 3 的表面。为了确定池塘 3 中存在的 DNA 浓度，对 已知的钩端螺旋体 血清型混合物和 lipL32 探针的 DNA 浓度进行了点印迹测定（图 11）。膜是用基因组DNA制备的，每个点中分布在100 ng至1 x 10-13 ng之间。毫无疑问，可以检测到的最低浓度约为0.3 ng，相当于水样中的6 x 105 GEq。
图 11：使用 已知 Leptospira 血清型混合物和 lipL32 探针的已知 DNA 浓度进行斑点印迹测定。 （A） 膜分布和 （B） 引物的膜分布和 （B DB_lipL32probe） 引物的产物 （262 bp） DB_lipL32REV和DB_lipL32FWD与致病性 钩端螺旋体 血清型的基因组 DNA 混合物稀释 （1：2）。探针的信号可以很容易地检测到低至 3.91 x 10-1 ng 的 钩端螺旋体 DNA 混合物。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图1：通过电泳分离可视化的PCR扩增产物。 车道 1.分子量标记物 100 bp DNA 分子量标准。车道 2.基于lipL32基因的PCR，以致病性 钩端螺旋体 DNA混合物为模板;车道 3.以致病性 钩端螺旋体 DNA混合物为模板，基于lipL41基因的PCR;4巷。基于16S rRNA基因的PCR，以致病性 钩端螺旋体 DNA混合物为模板;车道 5.以16S rRNA基因为基础，引物DB_16SSapREV和DB_16SSapFWD，以 双折钩螺旋体 血清型Patoc菌株Patoc I DNA为模板进行PCR;6巷。基于16S rRNA基因的PCR，引物DB_16SPathoREV和DB_16SPathoFWD，以 双曲钩端螺旋体 血清型Patoc菌株Patoc I DNA为模板;7巷。基于16S rRNA基因的PCR，引物DB_16SInterREV和DB_16SInterFWD，以 Fainei钩端螺旋体、 Hurstbridge菌株BUT6菌株为模板;8巷。基于16S rRNA基因的PCR，引物DB_16SPathoREV和DB_16S PathoFWD，以 Fainei钩端螺旋体、 Hurstbridge血清型BUT6菌株为模板。 请点击这里下载此文件。
补充图2：（A）膜分布和（B）DB_Saproprobe的斑点印迹以及引物的产物（1059 bp）DB_16SPathoREV和Leptospira biflexa serovar Patoc，Patoc I的基因组DNA的DB_16SPathoFWD。 请点击这里下载此文件。
补充图3：（A）膜分布和（B）DB_Saproprobe的斑点印迹，引物的产物DB_16SSapREV和DB_16SSapFWD的钩端螺旋体血清型Patoc，Patoc I的基因组DNA。请点击这里下载此文件。
补充图4：（A）膜分布和（B）DB_Interprobe与引物产物（1059 bp）DB_16SPathoREV和DB_16SPathoFWD以及 Leptospira fainei serovar Hurstbridge菌株BUT6的基因组DNA。 请点击这里下载此文件。
补充图5：（A）膜分布和B）DB_Interprobe的膜分布和引物产物（299-301 bp）DB_16SInterREV和DB_16SInterFWD与 Leptospira fainei serovar Hurstbridge菌株BUT6的基因组DNA的斑点印迹。请点击这里下载此文件。
补充图 6：（A） DB_16SPathoprobe 的膜分布和 （B） 斑点印迹以及引物产物 （1059 bp） DB_16S PathoREV和 DB_16SPathoFWD 与致病性 钩端螺旋体 血清型的基因组 DNA 混合物。 请点击这里下载此文件。
补充图7：（A）膜分布和（B）DB_lipL41probe与引物产物（479 bp）DB_lipL41REV和DB_lipL41FWD致病性钩端螺旋体血清型的基因组DNA混合物的斑点印迹。请点击这里下载此文件。
补充文件 1：腐生菌 钩端螺旋体 物种与基于 16S 核糖体 RNA 序列的引物和探针的比对。 引物以粗体和黑色突出显示以进行识别，其方向用黑色箭头表示。探头以粗体表示，以灰色突出显示，其位置用灰线标记。对齐的序列以浅灰色高亮显示，而不对应的序列以黑白高亮显示。请点击这里下载此文件。
补充文件 2：中间 钩端螺旋体 物种与基于 16S 核糖体 RNA 序列的引物和探针的比对。 引物以粗体和黑色突出显示以进行识别，其方向用黑色箭头表示。探头以粗体表示，以灰色突出显示，其位置用灰线标记。对齐的序列以浅灰色显示，而不对应的序列以黑色和白色显示。请点击这里下载此文件。
补充文件 3：致病性 钩端螺旋体 物种与基于 lipL32 基因序列的引物和探针的比对。 引物以粗体和黑色突出显示以进行识别，其方向用黑色箭头表示。探头以粗体表示，以灰色突出显示，其位置用灰线标记。对齐的序列以浅灰色显示，而不对应的序列以黑色和白色显示。请点击这里下载此文件。
补充文件 4：致病性 钩端螺旋体 物种与基于 lipL41 基因序列的引物和探针的比对。 为了便于识别，引物以粗体显示，并以黑色突出显示，其方向用黑色箭头表示。探头以粗体表示，以深灰色突出显示，其位置用灰线标记。对齐的序列为浅灰色，而不对应的序列为黑色和白色。请点击这里下载此文件。
补充文件 5： 钩端螺旋体 物种与靶向 16S 核糖体 RNA 序列的引物和腐生植物、中间体和致病物种探针的比对。 为了进行鉴定，引物以粗体表示，并用黑色突出显示，其方向用黑色箭头标记。探头以粗体表示，以灰色突出显示，其位置用灰线表示。对齐的序列为浅灰色，不对应的序列为白色和黑色。请点击这里下载此文件。
补充文件 6：用于斑点印迹测定的缓冲液和溶液。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
斑点印迹技术的关键步骤包括：（1）DNA固定化，（2）用非同源DNA阻断膜上的游离结合位点，（3）退火条件下探针和靶片段之间的互补性，（4）去除未杂交的探针，以及（5）检测报告分子41。
PCR-Dot-blot具有一定的局限性，例如该技术不提供有关杂交片段37大小的信息，它需要在与第二个或第三个探针重新杂交之前对单个膜进行去杂交，并且需要相当长的时间和精力才能得出最终结果。
该技术已显示出与其他分子技术的一致性 42,43 及其应用。反向斑点印迹、纳米金斑点印迹21 和 dot-ELISA42 已用于检测密螺旋体 44、伯氏疏螺旋体 45、大肠杆菌 46、幽门螺杆菌47 和结核分枝杆菌 48,49 等生物体中基于 16S rRNA29,43 的特定基因，以及检测植物的 DNA 或 RNA 病毒41.检测限 （LOD） 定义为该技术可以一致可靠地测量的微生物的最低浓度50，范围从幽门螺杆菌47 的 100 pg（5 x 104 个细菌）到临床样本中的伯氏疏螺旋体单细胞45，以及小于一个细胞的 fg， 结核分枝杆菌 48,49。
这种组合方法的一个有价值的方面是它能够将检测限延长一个数量级，克服了由于两种样品条件导致的假阴性结果，这些假阴性结果可能导致结果不一致：（1）DNA不足的样品，或（2）样品污染，允许100%检测阳性样品25,45,47,48,49.与琼脂糖凝胶电泳中可检测到的扩增产物相比，PCR-Dot-blot能够检测出较少数量的扩增产物，并且可避免由于第二次扩增步骤而造成的污染，如巢式和半巢式PCR。在处理含有低细菌电荷的环境样品时，这些优势尤为重要，这些样品可能包含范围更广的抑制剂和来自不相关来源的 DNA，这可能会干扰分子技术。
先前的研究表明，钩端螺旋体可以通过用光生物素标记的 DNA 探针来识别，其 LOD 为 5 pg（5 x 103 个钩端螺旋体）51。DIG 标记的探针可检测 0.1-1 pg（102 个钩端螺旋体），而 32个 P 标记的探针可检测 1-5 pg（750 至 1000 个钩端螺旋体）51，生物素标记的探针可检测 5 pg（2500 个钩端螺旋体）52。此外，腐生钩端螺旋体的 32个 P 标记探针达到 1.95 ng 的 LOD，致病性钩端螺旋体的 LOD 为 3.9 ng53。在这项研究中，为3个分支建立了相似的LOD。致病菌种的LOD约为0.3 ng基因组DNA（6-8 x 104 GEq）（图11），腐生菌和中间种的LOD降至0.1 ng（2 x 104 GEq）。值得注意的是，以前的研究是使用来自实验感染的金仓鼠的纯钩端螺旋体培养物51 和血清进行的，旨在检测致病性钩端螺旋体54,55，并应用带有 32P 标记的 DNA 杂交作为钩端螺旋体鉴定和分类的工具 56.这些探针表现出高特异性，并且不显示与其他微生物的非同源 DNA 19,51,54,55,56,57 的交叉杂交，甚至可以区分密切相关的物种，例如瘦脑瘤57.同样，在这项工作中，没有观察到与非同源DNA的杂交。尽管非同位素探针不如同位素探针58 或其他技术43 敏感，但可以预期，与其他基于 PCR 的技术相比，PCR-斑点印迹组合的灵敏度可提高多达 10 倍，如利什曼原虫和牛疱疹病毒 4 （BHV4）24,26 所示。
另一方面，用于钩端螺旋体鉴定的斑点印迹测定更频繁地用于抗体，最近用于单克隆抗体作为诊断尿液样本中人类和动物的替代方法 59,60,61,62。在这些研究中，样品直接处理到膜上，无需事先步骤，抗体靶向与发病机制相关的特定钩端螺旋体表面蛋白。例如，Mab-Dot-blot ELISA 具有高灵敏度和特异性，可检测低至 1 μg 的细菌匀浆62。从 Mab-Dot-blot 测定中获得的结果与 PCR 测定相当，PCR 测定的 LOD 通常约为 103 个钩端螺旋体/ml 尿液或 9.3 ng 钩端螺旋体匀浆63。PCR可扩增的基因组DNA量为100个细胞（500 fg DNA）61。这些先前的研究使用纯培养物或临床样本，没有进行富集程序，旨在更好地诊断。鉴于受感染的大鼠可以排泄多达 107 个钩端螺旋体/mL 尿液64，而狗可以排泄 102 至 106 个钩端螺旋体/mL 尿液65，作为水体的污染源，环境样本需要钩端螺旋体富集。在印迹之前对靶向 DNA 进行体外 PCR 扩增可将程序灵敏度提高多达10 倍 52,55。通常，通过终点PCR扩增的产物在琼脂糖凝胶电泳中不会被观察到;尽管如此，通过点印迹中DIG标记探针的特异性杂交，它变得很明显。
虽然许多关于 钩端螺旋体 和钩端螺旋体病的研究都集中在疾病诊断上，但人们对它们在水体中的生态学及其在水体中的分布知之甚少。PCR-Dot-blot技术增加了研究 钩端螺旋体 和钩端螺旋体病的工具箱，具有筛选大量样本并加快结果和解释的优势。PCR-Dot-blot是一种相对低成本、简单且无放射性的技术，可以在单个膜上容纳多个探针。此外，它消除了对复杂设备和复杂工作流程的需求，这在资源有限的环境中可能具有挑战性。
这项研究的影响在于其未来应用于研究不同深度的大水体，以及其他生态位和样本类型，包括土壤、死水、粪便、血液和组织。
总之，这项工作展示了PCR-Dot-blot技术的应用，该技术基于DNA探针的地高辛标记，用于鉴定 钩端螺旋体属内的三个分支。该方法通过将鉴定过程简化为单个扩增步骤，并允许使用单个膜进行三次同时杂交或三次连续杂交。使用该技术达到的检测限与使用放射性探针53实现的检测限相似，使其成为识别天然来源水样中 钩端螺旋体 的宝贵工具。因此，该技术在评估细菌DNA含量最少的样品时，可提高灵敏度并提供准确和一致的结果。它是研究 钩端螺旋体 在水体中动态的替代方法，可能有助于评估和监测更广泛的环境样本，有助于实施防止这种微生物传播的预防措施。
如果该技术遇到困难，请考虑以下故障排除要点：（1） 如果点的形状不规则，请检查真空系统是否横向牢固关闭，然后重复转移。（2） 如果杂交管在过夜过程中破裂，导致膜失去杂交缓冲液，请参阅“去杂交程序”部分并重新启动该过程。（3）如果没有可见的点，请不要丢弃膜;继续执行“去杂交程序”部分以重复杂交步骤。（3）如果在显影的X射线胶片上发现不均匀的白色区域，请确保在袋子密封过程中没有气泡被捕获。（5） 如果在显影的 X 射线胶片上观察到不均匀的黑色区域，请确认 CSPD 已使用阻尼手指彻底分布。（6）如果X射线胶片显示点的阴影，请确保在曝光期间胶片不移动。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢墨西哥国立自治大学兽医和动物技术学院微生物学和免疫学系的钩端螺旋体收藏。我们感谢对参考钩端螺旋体菌株的慷慨捐赠;Lebtospira fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6 和 Leptospira biflexa 血清型 Patoc 菌株 Patoc I 给 Alejandro de la Peña Moctezuma 博士。我们感谢CIBAC协调员José Antonio Ocampo Cervantes博士和工作人员的后勤支持。EDT属于Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa本科生的终端项目计划。我们承认用于创建图 1 和图 3 至 9 的 Biorender.com 软件。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Purelink DNA extraction kit | Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) | Promega | M3001 | |
| Whatman filter paper, grade 1, | Merk | WHA1001325 | |
| Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m | Roche | 11417240001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody | Roche | 11093274910 | |
| Medium Base EMJH | Difco | S1368JAA | |
| Leptospira Enrichment EMJH | Difco | BD 279510 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate | Merk | 11755633001 | |
| Deoxyribonucleic acid from herring sperm | Sigma Aldrich | D3159 | |
| Developer Carestream | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| Digoxigenin-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fixer Carestream | Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
| Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | It is an anionic surfactant |
| Polivinylpyrrolidone (PVP-40) | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Terminal transferase, recombinant | Roche | 3289869103 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | It can be Home-made following Supplementary File 6 |
| Primers | Sigma-Aldrich | On demand | Follow table 1 |
| Probes | Sigma-Aldrich | On demand | Follow table 1 |
| Equipment | |||
| Nanodrop™ One Spectrophotometer | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl | Gilson | SKU:F167360 | |
| Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) | Axygen | MCT-150-SP | |
| Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) | Axygen | 3208 | |
| Disposable Pipette tips 1-10 µl | Axygen | T-300 | |
| Disposable Pipette tips 1-200 µl | Axygen | TR-222-Y | |
| Dot-Blot apparatus Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| Portable Hergom Suction | Hergom | 7E-A | |
| Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| UV Crosslinker | Hoefer | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler | Hybaid | HBPX110 | |
| Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 | Fuji |
References
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