Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Polymeraskedjereaktion och dot-blot-hybridisering för Leptospira-detektion i vattenprover

Published: June 14, 2024 doi: 10.3791/65435
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

Summary

I denna studie utformades en dot-blot-applikation för att detektera Leptospira från de tre huvudkladerna i vattenprover. Denna metod gör det möjligt att identifiera minimala DNA-mängder som specifikt angrips av en digoxigeninmärkt sond, som lätt detekteras av en anti-digoxigenin-antikropp. Detta tillvägagångssätt är ett värdefullt och tillfredsställande verktyg för screeningändamål.

Abstract

Dot-blot är en enkel, snabb, känslig och mångsidig teknik som gör det möjligt att identifiera minimala mängder DNA som specifikt är måltavla för sondhybridisering i närvaro av bärar-DNA. Den är baserad på överföring av en känd mängd DNA till ett inert fast stöd, såsom ett nylonmembran, med hjälp av dot-blot-apparaten och utan elektroforetisk separation. Nylonmembran har fördelen av hög nukleinsyrabindningskapacitet (400 μg/cm2), hög hållfasthet och är positivt eller neutralt laddade. Sonden som används är ett mycket specifikt ssDNA-fragment av 18 till 20 baser som är märkta med digoxigenin (DIG). Sonden kommer att konjugera med Leptospiras DNA. När sonden har hybridiserats med mål-DNA:t detekteras den av en anti-digoxigeninantikropp, vilket gör det lätt att upptäcka den genom dess utsläpp som avslöjas i en röntgenfilm. Prickarna med en emission kommer att motsvara de DNA-fragment som är av intresse. Denna metod använder icke-isotopisk märkning av sonden, som kan ha en mycket lång halveringstid. Nackdelen med denna standardimmunetikett är en lägre känslighet än isotopsonder. Icke desto mindre mildras det genom att koppla polymeraskedjereaktion (PCR) och dot-blot-analyser. Den här metoden gör det möjligt att berika målsekvensen och identifiera den. Dessutom kan det användas som en kvantitativ applikation jämfört med en seriell utspädning av en välkänd standard. En dot-blot-applikation för att detektera Leptospira från de tre huvudkladerna i vattenprover presenteras här. Denna metod kan tillämpas på stora mängder vatten när de har koncentrerats genom centrifugering för att ge bevis på närvaron av Leptospiral-DNA. Detta är ett värdefullt och tillfredsställande verktyg för allmänna screeningändamål och kan användas för andra icke-odlingsbara bakterier som kan finnas i vatten, vilket förbättrar förståelsen av ekosystemet.

Introduction

Leptospiros hos människor har huvudsakligen sitt ursprung i miljökällor 1,2. Förekomsten av Leptospira i sjöar, floder och vattendrag är en indikator på överföring av leptospiros bland vilda djur och tamdjur och produktionsdjur som så småningom kan komma i kontakt med dessa vattenförekomster 1,3,4. Dessutom har Leptospira identifierats i icke-naturliga källor, inklusive avloppsvatten, stillastående vatten och kranvatten 5,6.

Leptospira är en bakterie som distribueras över hela världen 7,8, och miljöns roll i dess bevarande och överföring har varit välkänd. Leptospira kan överleva i dricksvatten under varierande pH och mineraler9, och i naturliga vattenförekomster1. Den kan också överleva under långa perioder i destillerat vatten10, och under konstant pH (7,8) kan den överleva upp till 152 dagar11. Dessutom kan Leptospira interagera i bakteriella konsortier för att överleva svåra förhållanden12,13. Det kan ingå i biofilm i sötvatten med Azospirillum och Sphingomonas och kan till och med växa och uthärda temperaturer över 49 °C14,15. Den kan också föröka sig i vattenmättad jord och förbli livskraftig i upp till 379 dagar16, vilket bevarar dess förmåga att orsaka sjukdomen så länge som ett år17,18. Man vet dock inte mycket om ekologin i vattendrag och hur den är fördelad inom dem.

Sedan upptäckten har studiet av släktet Leptospira baserats på serologiska tester. Det var inte förrän under det innevarande århundradet som molekylära tekniker blev mer utbredda i studiet av denna spiroket. Dot-bloten har knappast använts för att identifiera den med hjälp av (1) en isotopsond baserad på 16S rRNA och på en inter-simple sequence repeat (ISSR)19,20, (2) som en nanoguldbaserad immunanalys för human leptospiros applicerad på urin21, eller (3) som en antikroppsbaserad analys för urinprover från nötkreatur22. Tekniken föll ur bruk eftersom den ursprungligen var baserad på isotopsonder. Det är dock en välkänd teknik som, tillsammans med PCR, ger förbättrade resultat, och den anses vara säker på grund av användningen av icke-isotopiska sonder. PCR spelar en avgörande roll i anrikningen av Leptospira DNA genom att amplifiera ett specifikt DNA-fragment som kan hittas i spårmängder i ett prov. Under varje PCR-cykel fördubblas mängden av det riktade DNA-fragmentet i reaktionen. I slutet av reaktionen har amplikonet multiplicerats med en faktor på mer än en miljon23. Produkten amplifierad med PCR, som ofta inte syns i agaroselektrofores, blir synlig genom specifik hybridisering med en DIG-märkt sond i dot-blot 24,25,26.

Dot-blot-tekniken är enkel, robust och lämplig för många prover, vilket gör den tillgänglig för laboratorier med begränsade resurser. Det har använts i en mängd olika bakteriestudier, inklusive (1) orala bakterier27, (2) andra provtyper som mat och avföring28, och (3) identifiering av icke-odlingsbara bakterier29, ofta i överensstämmelse med andra molekylära tekniker. Bland fördelarna med dot-blot-tekniken är: (1) Membranet har en hög bindningskapacitet, som kan binda över 200 μg/cm2 nukleinsyror och upp till 400 μg/cm2; (2) Dot-blot-resultat kan tolkas visuellt utan att det krävs specialutrustning, och (3) de kan bekvämt förvaras i åratal i rumstemperatur (RT).

Släktet Leptospira har klassificerats i patogena, intermediära och saprofytiska klader30,31. Skillnaden mellan dessa klader kan uppnås baserat på specifika gener som lipL41, lipL32 och 16S rRNA. LipL32 finns i de patogena kladerna och uppvisar hög känslighet i olika serologiska och molekylära verktyg, medan det saknas hos saprofytarter21. Hushållningsgenen lipL41 är känd för sitt stabila uttryck och används i molekylära tekniker32, medan 16S rRNA-genen används för deras klassificering.

Denna metod kan tillämpas på stora volymer vatten när de har koncentrerats genom centrifugering. Det gör det möjligt att bedöma olika punkter och djup i en vattenförekomst för att upptäcka förekomsten av leptospiral-DNA och den klad som den tillhör. Detta verktyg är värdefullt för både ekologiska och allmänna screeningändamål och kan också användas för att upptäcka andra icke-odlingsbara bakterier som kan finnas i vatten.

Dessutom är PCR- och dot-blot-analyser tekniskt och ekonomiskt överkomliga för ett brett spektrum av laboratorier, även de som saknar sofistikerad eller dyr utrustning. Denna studie syftar till att tillämpa den digoxigeninbaserade dot-bloten för att identifiera de tre Leptospira-kladerna i vattenprover insamlade från naturliga vattenförekomster.

Bakteriella stammar
Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassoven och Wolffi) inkluderades i denna studie. Dessa serovarer är en del av samlingen vid institutionen för mikrobiologi och immunologi, fakulteten för veterinärmedicin och zooteknik, National Autonomous University of Mexico, och de används för närvarande i mikroagglutinationstestet (MAT).

Alla Leptospira serovarer odlades i EMJH och deras DNA extraherades med hjälp av ett kommersiellt DNA-extraktionskit (se Materialtabell). En genomisk DNA-blandning av de tolv serovarerna användes som en positiv kontroll för den patogena kladen Leptospira . Som en positiv kontroll av Leptospira intermediär klad inkluderades genomiskt DNA från Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6, och som en positiv kontroll för Leptospira saprofytkladen inkluderades även genomiskt DNA från Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I.

Negativa kontroller bestod av en tom plasmid, DNA från icke-besläktade bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii och Escherichia coli) och PCR-klassat vatten, som fungerade som icke-mallkontroll.

Vattenprover
Tolv provprover samlades in med hjälp av en stratifierad-slumpmässig provtagningsmetod från Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Dessa prover togs på tre djup: ytliga, 10 och 30 cm (Figur 1A, B). Rutinerna för att samla in vatten påverkade inte några utrotningshotade eller skyddade arter. Varje prov samlades in i ett sterilt 15 ml mikrocentrifugrör. För att samla in provet sänktes varje rör försiktigt ner i vattnet, fylldes på det valda djupet och förseglades sedan. Proverna hölls vid 22 °C och transporterades omedelbart till laboratoriet för bearbetning.

Varje prov koncentrerades genom centrifugering i sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 8000 x g i 20 minuter vid rumstemperatur. Detta steg upprepades tills alla prover koncentrerades till ett rör, som sedan användes för DNA-extraktion (Figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Koncentration av vattenprover genom centrifugering. A) Vattenprovtagningsdammar och B) Naturliga vattendrag. C) Centrifugeringsbaserad bearbetning av vattenprover i upprepade steg så många gånger som behövs (n). Klicka här för att se en större version av denna figur.

DNA-extraktion
Totalt DNA isolerades med hjälp av ett kommersiellt genomiskt DNA-kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). DNA-extraktioner eluerades i 20 μL elueringsbuffert och DNA-koncentrationen bestämdes av en UV-spektrofotometer vid 260-280 nm och förvarades vid 4 °C tills användning.

PCR-amplifiering
PCR-målen var de 16S rRNA-, lipL41- och lipL32-generna, som identifierar DNA från släktet Leptospira och gör det möjligt att skilja mellan de tre kladerna: patogen, saprofytisk och intermediär. Både primers och sonddesign baserades på tidigare arbeten av Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. och Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen för varje sond, primer och amplifierat fragment beskrivs i tabell 1, och deras anpassning till referenssekvenser finns i Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4 och Supplementary File 5. PCR-reagenserna och termocykliska förhållanden beskrivs i protokollavsnittet.

Amplifieringsprodukter visualiserades genom elektroforetisk separation på en 1 % agarosgel i TAE (40 mM Tris-bas, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA; pH 8,3), vid 60 V i 45 minuter med etidium-bromiddetektion, som visas i kompletterande figur 1. Genomiskt DNA erhållet från varje serovar användes med koncentrationer från 6 x 106 till 1 x 104 genomekvivalenta kopior (GEq) i varje PCR-reaktion, baserat på genomstorleken för L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 för patogen Leptospira, genomstorleken för L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 för saprofytisk Leptospira, och genomstorleken för L. fainei serovar Hurstbridge stam BUT6 (4, 267, 324 bp) med accessionsnummer AKWZ00000000.2.

Sondernas känslighet bedömdes med DNA från varje patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I och L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 i varje experiment. För att bedöma specificiteten hos PCR- och dot-blot-hybridiseringsanalysen inkluderades DNA från icke-besläktade bakterier.

Tabell 1: PCR-primrar och sonder för att amplifiera produkter för identifiering av patogena, saprofyt- och intermediära klader av Leptospira. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Analys av dot-blot-hybridisering
Tekniken kallas dot-blot eftersom hålen som DNA-provet placeras i har en prickform, och när de sugs in för att fixeras på plats genom vakuumsugning får de denna form. Denna teknik utvecklades av Kafatos et al.40. Tekniken gör det möjligt att göra en semikvantifiering av Leptospira i varje PCR-positivt prov. Protokollet består av en denaturering med NaOH 0,4 M vid rumstemperatur, prover med Leptospira DNA från 30 ng till 0,05 ng, motsvarande 6 x 106 till 1 x 104 leptospirer, torkas på ett nylonmembran med en 96-brunnars dot-blot-apparat. Efter immobilisering binds DNA:t till membranet genom exponering för 120 mJ UV-ljus. Varje DNA-sond konjugeras med digoxigenin-11 dUTP genom ett terminalt överföringskatalyssteg i 3'-änden (Digoxigenin är en växtsteroid erhållen från Digitalis purpurea, som används som en reporter41). Efter den stränga hybridiseringen av den märkta DNA-sonden (50 pmol) vid den specifika temperaturen på mål-DNA, visualiseras DNA-hybriderna genom kemiluminiscensreaktionen med den anti-digoxigenin alkaliska fosfatasantikroppen kovalent konjugerad med dess substrat CSPD. Luminiscensen fångas genom exponering för en röntgenfilm (figur 2).

Figure 2
Figur 2: Steg i proceduren för PCR-dot-blot-analysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av prover

  1. Koncentra varje vattenprov i 1,5 ml mikrocentrifugrör genom centrifugering vid 8 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Upprepa detta steg, så många gånger som krävs, för att koncentrera provet till en volym på 250 μL.
  2. Använd DNA-extraktionssatsen enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
  3. Utför den specifika PCR enligt den dot-blot-sond som ska användas (tabell 1).
    1. Utför amplifieringarna i PCR-rör med den slutliga volymen på 25 μL innehållande 1 X buffert, 2,5 enheter Taq-polymeras, 1 μM av varje primer, 0,2 mM av varje dNTP, 1,5 mM MgCl2 och 100 ng mål-DNA från varje vattenprov eller referensgenomiskt DNA.
    2. Programmera PCR-reaktionen i en termocykler enligt termocykelförhållandena (tabell 2).
    3. Förvara reaktionerna vid 4 °C fram till användning.
  4. Placera 10 μL av varje PCR-produkt som ska torkas i en separat brunn på en platta med 96 hål.
  5. Tillsätt 40 μL TE i varje brunn och blanda med pipettering.
    OBS: Plattan med 96 brunnar kan förseglas och förvaras vid 4 °C över natten. Följ instruktionerna i tilläggsfil 6 för att förbereda buffertar och lösningar för protokollet. Figur 3 visar stegen för provberedning.

Tabell 2: Termocykliska PCR-betingelser för generna 16S, lipL41 och lipL32. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Figure 3
Figur 3: PCR och provberedning. Genom att tillämpa det specifika PCR-protokollet överfördes PCR-produkten till en mikrotiterplatta och 40 μL TE tillsattes till varje brunn. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Montering av dot-blot-apparaten

OBS: Monteringen av dot-blot-apparaten visas i figur 4. Använd handskar under proceduren för att hantera de alkaliska lösningarna och skydda nylonmembranet från kontaminering.

Figure 4
Figur 4: Montering av dot-blot-apparat. Filterpapperet och nylonmembranet (tidigare fuktat i 10 X SSPE) måste placeras i rätt ordning. Monteringen måste säkras med skruvarna ordentligt innan vakuumet appliceras. Varje brunn måste tvättas med TE, och PCR-produkterna laddas i sina respektive brunnar. Efter att PCR-produkten har överförts genom membranet tvättas varje brunn igen med TE och får torka. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Skär nylonmembranet (se materialtabell) och filterpapper i ark med storleken 12 x 8,5 cm.
  2. Markera membranet med en permanent markör.
  3. Gör en skåra med en sax i ena kanten för att ange rätt orientering. Använd markeringen för att komma ihåg provbeställningen.
  4. Fukta membranet och filterpappret med 10 x koksalt-natriumfosfat-EDTA-buffert (SSPE; 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4 och 0,02 M EDTA, pH 7,4) (tilläggsfil 6). Hantera membranet med en ren, trubbig pincett.
  5. Montera dot-blot-kammaren; Först filterpappret, följt av membranet över plasttätningen. Fäst locket med skruvarna på tvären.
  6. Anslut kammaren till vakuumet, placera 100 μL TE i varje brunn, håll vakuumet i 1 minut och stoppa det sedan.
  7. Slå på vakuumet med låg hastighet och fyll på 50 μL av varje prov i motsvarande brunn på membranet i dot-blot-apparaten (enligt den förutbestämda membranfördelningen).
    OBS: Homogenisera varje sample i hemagglutinationsbrunnsplattan 96 innan du placerar den i dot-blot-kammaren.
  8. Låt dammsugaren torka membranet. Om det behövs, slå försiktigt på kammaren för att frigöra bubblorna i provet.
  9. Tvätta varje brunn genom att placera 100 μL TE i den med ett kontinuerligt vakuum och låta den torka.
    OBS: Efter att överföringen är klar är det avgörande att först stänga av pumpen och ta bort den. Underlåtenhet att göra det kan leda till att återflöde kommer in i apparaten. DNA behöver inte ett denatureringssteg om ett positivt laddat nylonmembran används, men om man använder annat inert stöd kan ett fördenatureringssteg och alkalibaserad denaturering behövas41.

3. DNA-denaturering och fixering

OBS: Figur 5 illustrerar proceduren för DNA-membranfixering.

Figure 5
Figur 5: Procedur för fixering av DNA-membran. DNA:t denatureras i en alkalisk lösning. Därefter neutraliseras det med 10 X SSPE och membranet torkas. Därefter transbelyseras membranet. Membranet rehydreras med 2 X SSPE och förhybridiseras över natten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Inkubera membranet med 0,4 M NaOH i 10 minuter vid rumstemperatur.
  2. Balansera membranet med 10 X SSPE i 10 minuter vid rumstemperatur.
  3. Torka membranet vid 80 °C i 2 timmar.
  4. Stråla med 120 mJ UV-ljus i 3 min. Se till att proverna är riktade med ansiktet nedåt mot UV-ljuskällan. Om du använder en UV-tvärbindare, kontrollera att samples är vända uppåt och upprepa detta steg två gånger.
    OBS: Membranet måste vara helt torrt innan UV-tvärbindning. DNA kommer att immobiliseras av en kovalent bindning till nylonmembranet. Varje tvärbindning tar cirka 18'' till 1' med en optimal UV-bestrålningsdos, för de flesta hybridiseringsexperiment, på cirka 0,6-0,8 kJ/m2.
    Exponering för UV-strålning är skadligt för ögon och hud. Använd lämplig skyddsutrustning och undvik exponering för bar hud.
  5. Tvätta membranet med 2 X SSPE i 10 min.
  6. Vik försiktigt membranet och sätt in det i hybridiseringsröret (använd ett 15 ml mikrocentrifugrör).
  7. Tillsätt 10 ml av förhybridiseringslösningen (tilläggsfil 6) till röret och inkubera vid 42 °C över natten. Se till att röret har förseglats ordentligt för att förhindra läckage.

4. Hybridisering

  1. Ta bort 5 ml av förhybridiseringslösningen från hybridiseringsröret. För att använda 5 ml en andra gång, förvara den i ett annat rör och förvara den vid -4 °C.
  2. Tillsätt 15 μL av den märkta sonden (tabell 1) till hybridiseringsröret. Skölj spetsen i lösningen för att säkerställa att den märkta sonden har införts ordentligt i spädningen.
    OBS: DNA-sondens bindning är inte lika stark som antigen-antikroppsbindningen. Därför kan förändringar i koncentrationen av sonden eller DNA i provet påverka intensiteten av den emitterade fluorescensen. DNA-sonder är stökiometriska, vilket innebär att antalet sondmolekyler bundna till DNA motsvarar antalet DNA-molekyler som finns i lösningen. Figur 6 visar sondens hybridisering.
  3. Inkubera vid 42 °C över natten.
  4. Utför DIG-märkning av DNA-sond. Följ instruktionerna i tabell 3 för att blanda reagenserna och inkubera sedan blandningen vid 37 °C i 1 timme. Tillsätt sedan 80 μL destillerat vatten och förvara den svansförsedda sonden vid 4 °C.

Figure 6
Figur 6: Hybridisering av sonder. Volymen på hybridiseringsbufferten justeras och den digoxigenin-märkta sonden inkorporeras för att möjliggöra sondens hybridisering över natten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 3: Reagenser för sonderna med märkning med digoxigenin (DIG). Klicka här för att ladda ner denna tabell.

5. Kemiluminiscens (anti-DIG-märkning)

  1. Tvätta membranet två gånger med 2 X SSPE/0,1 % SDS i rumstemperatur i 10 minuter.
  2. Inkubera membranet med 5 X SSPE/0,1 % SDS vid sondens glödgningstemperatur i 15 minuter.
    OBS: I det här steget, använd en behållare med lock för att hålla temperaturen så länge som möjligt. Säkerställ en jämn och konstant temperatur över hela membranet. Den ungefärliga volymen i varje tvätt är 100 ml av den angivna lösningen.
  3. Tvätta membranet en gång med Buffer 1 (Supplementary File 6) i rumstemperatur i 5 min.
  4. Tvätta membranet en gång med Buffer 2 (Supplementary File 6) i rumstemperatur i 30 minuter.
  5. Tvätta membranet med buffert 2 och tillsätt anti-digoxigeninantikroppen (15 μL) (se materialtabell) och inkubera sedan i 45 minuter (inkubationstiden kan variera mellan 30 och 60 minuter). Denna sekundära antikropp märker sonden för detektion.
    OBS: Membranet kan förvaras i buffert 2 med anti-digoxigeninantikroppen över natten vid 4-8 °C. Anti-DIG-märkning av kemiluminiscensprocessen visas i figur 7.

Figure 7
Figur 7: Anti-DIG-märkning av kemiluminiscensprocessen. De obundna nukleinsyrorna avlägsnas med buffertlösningar. Sonden är i linje med mål-DNA:t och överskottet avlägsnas. Membranet blockeras med den blockerande 1 X-bufferten och anti-DIG-antikroppen tillsätts (1:10000). Klicka här för att se en större version av denna figur.

6. Kamiluminescens (applicering av substrat)

  1. Tvätta membranet två gånger i buffert 1 i rumstemperatur i 15 minuter.
  2. Tvätta en gång i buffert 3 (se tilläggsfil 6) i rumstemperatur i 5 minuter, så att membranet kan tömma det mesta av bufferten och lämna den nästan torr.
  3. Tillsätt CSPD färdig att använda (dinatrium 3-(4-metoxispiro {1,2-dioxetan-3,2′-(5′-klor) tricykloj [3.3.1.13,7] dekan}-4-yl) fenylfosfat, se Materialförteckning), och låt stå i 5 min, (med fuktade fingrar homogenisera CSPD från ena sidan till den andra).
  4. Lägg membranet i en genomskinlig plastpåse (12,5 x 9 cm) som passar membranmåttet. Ta försiktigt bort luftbubblor, fördela CSPD jämnt och värmeförsegla påsen.
  5. Inkubera membranet i ett vattenbad vid 37 °C i 15 minuter (upp till 30 minuter) och se till att membranet med proverna placeras nedåt så att det är väl nedsänkt. Se till att temperaturen förblir konstant och väl fördelad över membranet.
  6. Torka plastpåsen och fäst den med tejp på en redan använd röntgenfilm. Detta möjliggör enkel hantering under exponeringsproceduren.
    OBS: Figur 8 visar substratappliceringen av kemiluminiscensprocessen.

Figure 8
Figur 8: Substratapplicering av kemiluminiscensprocessen. Den fria antikroppen avlägsnas och substratet CSPD (1:250) tillsätts till membranet. Reaktionen aktiveras genom inkubation vid 37 °C och membranet är arrangerat för att registrera kemiluminiscensen i en röntgenfilm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

7. Kamiluminescens (detektion)

  1. Utför exponeringsproceduren. I mörkrummet förbereder du framkallnings- och fixeringslösningarna (se Materialförteckning) i respektive fack.
  2. I mörker, placera försiktigt det fasta membranet mot en ny röntgenfilm och sätt in det i en röntgenkassett (se Materialtabell).
  3. Registrera tidpunkten för exponeringen. Exponeringstiden kan variera från 1 min till 30 min eller mer. Börja med 5 min och anpassa tiden därefter.
  4. Fukta röntgenfilmen i framkallningslösning i 1-3 minuter och skölj försiktigt med kranvatten (15-45 s).
  5. Fukta röntgenfilmen i fixeringslösning i 1-3 min och skölj försiktigt med kranvatten (45 s).
  6. Låt röntgenfilmen lufttorka och dokumentera analysen i en synlig vit ljuslåda.
    OBS: Undvik att skaka membranet under röntgenexponeringstiden. Detektionsprocessen visas i figur 9.
  7. Gå vidare till resultattolkningen. I den exponerade röntgenfilmen kan prickarna med emission visuellt lokaliseras och korrespondera med de DNA-fragment som har sondens hybridisering. Intensiteten på den utsända signalen beror på luminiscensen och exponeringens varaktighet.
    OBS: Membran kan förvaras torkade mellan filterpapper i flera månader i rumstemperatur.

Figure 9
Figur 9: Detektion av kemiluminiscensprocessen. Under mörka förhållanden utsätts membranet för en röntgenfilm inuti en röntgenkassett. Därefter fick den stå under utställningstiden, och sedan framkallades och fixerades röntgenfilmen. Till slut lufttorkades den och tolkades. Klicka här för att se en större version av denna figur.

8. Förfarande för avhybridisering av membran

  1. Tvätta membranet två gånger i 10 minuter med destillerat vatten.
  2. Tvätta membranet i 20 minuter med 0,4 M NaOH vid 53 °C (två gånger).
  3. Tvätta membranet två gånger i 10 minuter med 2 X SSPE.
  4. Låt membranet torka i rumstemperatur.
  5. Behåll membranet och återgå till steg 3.5 i protokollet.
    OBS: Membranet kan förvaras i förhybridiseringsbufferten över natten vid 4-8 °C. Nästa dag, starta om med en inkubation vid 42 °C i 1 timme, så att förhybridiseringsbufferten kan nå temperaturen. Fortsätt sedan till steg 3.5 i protokollet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att bedöma teknikens effektivitet användes genomiskt DNA från rena kulturer av varje Leptospira serovar, tillsammans med den kladspecifika sonden. Membran preparerades med 100 ng genomiskt DNA per PCR-reaktion för varje serovar, följt av åtta genomiskt DNA från icke-besläktade bakterier och variabla koncentrationer av genomiskt DNA från ad hoc Leptospira-serovarerna. Varje analys inkluderade positiv, negativ och icke-mallkontroll. Detta icke-besläktade genomiska DNA visade ingen affinitet för dot-blot-sonderna. Membranfördelningen och punktblotta membranen visas i Kompletterande Figur 2, Kompletterande Figur 3, Kompletterande Figur 4, Kompletterande Figur 5, Kompletterande Figur 6, Kompletterande Figur 7. När det gäller saprofytkladen, med användning av DB_Saproprobe med PCR-produkten på 1059 bp amplifierad med primrar DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD, och PCR-produkten på 517 bp amplifierad med primrar DB_16SSapREV och DB_16SSapFWD med genomiskt DNA från Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I, Det var möjligt att detektera mellan 0,05-0,1 ng saprofyt-DNA (tilläggsfigur 2 och tilläggsfigur 3). På samma sätt, för detektion av den intermediära kladen, med användning av DB_Interprobe med PCR-produkten på 1059 bp amplifierad med primrar DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD, och PCR-produkten på 299-301 bp amplifierad med primrarna DB_16SInterREV och DB_16SInterFWD med genomiskt DNA från Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6 (kompletterande figur 4 och kompletterande figur 5) var det möjligt att detektera cirka 0,1 ng av det intermediära DNA:t. För den patogena kladen med DB_16 S-patoproben med PCR-produkten på 1059 bp amplifierad med primrar DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD, eller DBlipL41probe med PCR-produkten på 479 bp amplifierad med primrar DB_lipL41REV och DB_lipL41FWD med genomisk DNA-blandning från patogena Leptospira serovars, Det var möjligt att detektera DNA-koncentrationer mellan 0,3-0,6 ng patogent DNA (tilläggsfigur 6 och tilläggsfigur 7).

Analyserna som är utformade för att identifiera de tre kladerna kan användas individuellt för varje klad. Vid värdefulla och knappa prover kan dock ett enda membran beredas med primrar DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD, som förstärker en produkt med 1058-1069 bp. Denna produkt kan sedan hybridiseras med DB_Interprobe, DB_Saproprobe och DB_16SPathoprobe individuellt, med dehybridiseringssteget (steg 8) före var och en av dem. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att identifiera alla klader i samma membran.

I fältvattenproverna tillämpades lipL32-sondprotokollet. Varje vattenprovs DNA användes i en koncentration av 100 ng per PCR-reaktion. Dessutom inkluderades en kontroll av DNA-extraktionsprotokollet, som bestod av att spika 100 ng Leptospira genomiskt DNA i ett 15 ml destillerat vattenprov. Negativa och positiva kontroller inkluderades också (figur 10).

Tabell 4: Beskrivning av vattenprover och djup. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Figure 10
Figur 10: Punkt-blot-analys av varje vattenprov. A) Membranfördelning och B) punkt-blot av DB_lipL32probe och produkten (262 bp) av primers DB_lipL32REV och DB_lipL32FWD av fältvattenproverna. Ytan på Pond 3 visar ett positivt resultat, och både extraktionsprotokollkontrollen och de positiva kontrollerna har en intensiv signal. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Beskrivningen av vattenprovet visas i tabell 4, och punkt-blot-membranfördelningen och bilden visas i figur 9. Pricken A7 visar att Leptospiral-DNA fanns på ytan av damm 3. För att bestämma den DNA-koncentration som fanns i damm 3 utfördes en dot-blot-analys med kända DNA-koncentrationer av en blandning av Leptospira-serovarer och lipL32-sonden (Figur 11). Membranet framställdes med genomiskt DNA fördelat från 100 ng till 1 x 10-13 ng i varje prick. Den lägsta koncentration som utan tvekan kan detekteras var cirka 0,3 ng, vilket motsvarar 6 x 105 GEq i vattenproverna.

Figure 11
Figur 11: Dot-blot-analys med kända DNA-koncentrationer av en blandning av Leptospira serovarer och lipL32-sonden. A) Membranfördelning och B) Punkt-blot av DB_lipL32probe och produkten (262 bp) av primrar DB_lipL32REV och DB_lipL32FWD med spädningar (1:2) av en genomisk DNA-blandning av patogena Leptospira serovarer. Sondens signal kan lätt detekteras ner till 3,91 x 10-1 ng Leptospira DNA-blandning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: PCR-amplifieringsprodukter visualiserade genom elektroforetisk separation. Körfält 1. Molekylviktsmarkör 100 bp DNA-stege. Körfält 2. PCR baserad på lipL32-genen med patogen Leptospira DNA-blandning som mall; Körfält 3. PCR baserad på lipL41-genen med patogen Leptospira DNA-blandning som mall; Körfält 4. PCR baserad på 16S rRNA-genen med patogen Leptospira DNA-blandning som mall; Körfält 5. PCR baserad på 16S rRNA-genen med primrar DB_16SSapREV och DB_16SSapFWD, och Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I DNA som mall; Körfält 6. PCR baserad på 16S rRNA-genen med primers DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD, och Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I DNA som mall; Körfält 7. PCR baserad på 16S rRNA-genen med primrar DB_16SInterREV och DB_16SInterFWD, och Leptospira fainei, serovar Hurstbridge stam BUT6 DNA som mall; Körfält 8. PCR baserad på 16S rRNA-genen med primrar DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD, samt Leptospira fainei, serovar Hurstbridge stam BUT6 DNA som mall. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: (A) Membranfördelning och (B) punkt-blot av DB_Saproprobe och produkten (1059 bp) av primrar DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD av genomiskt DNA från Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: (A) Membranfördelning och (B) punkt-blot av DB_Saproprobe med produkten (517 bp) av primrar DB_16SSapREV och DB_16SSapFWD av genomiskt DNA från Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: (A) Membranfördelning och (B) punkt-blot av DB_Interprobe med produkten (1059 bp) av primrar DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD och genomiskt DNA från Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: (A) Membranfördelning och B) punkt-blot av DB_Interprobe och produkten (299-301 bp) av primrar DB_16SInterREV och DB_16SInterFWD med genomiskt DNA från Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 6: (A) Membranfördelning och (B) punkt-blot av DB_16 S-patoprobeoch produkten (1059 bp) av primrar DB_16SPathoREV och DB_16SPathoFWD med genomisk DNA-blandning av patogena Leptospira serovars. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur 7: (A) Membranfördelning och (B) punkt-blot i DB_lipL41probe med produkten (479 bp) av primrar DB_lipL41REV och DB_lipL41FWD med genomisk DNA-blandning av patogena Leptospira serovars. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 1: Anpassning av saprofyt Leptospira-arter med primrarna och sonden baserat på 16S ribosomala RNA-sekvensen. Primers är markerade i fetstil och svart för att identifiera dem, och deras riktning anges av svarta pilar. Sonden är markerad i fetstil och markerad i grått, och dess position är markerad med en grå linje. De justerade sekvenserna är markerade i ljusgrått, medan de icke-motsvarande sekvenserna är i svartvitt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Anpassning av intermediära Leptospira-arter med primrarna och sonden baserat på 16S ribosomala RNA-sekvensen. Primers är markerade i fetstil och svart för att identifiera dem, och deras riktning anges av svarta pilar. Sonden är markerad i fetstil och markerad i grått, och dess position är markerad med en grå linje. De justerade sekvenserna är i ljusgrått, medan de icke-motsvarande sekvenserna visas i svartvitt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 3: Anpassning av patogena Leptospira-arter till primrar och sond baserat på lipL32-gensekvensen. Primers är markerade i fetstil och svart för att identifiera dem, och deras riktning anges av svarta pilar. Sonden är markerad i fetstil och markerad i grått, och dess position är markerad med en grå linje. De justerade sekvenserna är i ljusgrått, medan de icke-motsvarande sekvenserna visas i svartvitt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 4: Anpassning av patogena Leptospira-arter till primrar och sond baserat på lipL41-gensekvensen. För att identifiera dem är primers i fetstil och markerade i svart, med deras riktning indikerad av svarta pilar. Sonden är markerad i fetstil och markerad i mörkgrått, och dess position är markerad med en grå linje. De justerade sekvenserna är i ljusgrått, medan de icke-motsvarande sekvenserna är i svart och vitt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 5: Anpassning av Leptospira-arter med primrarna som riktar sig mot 16S ribosomala RNA-sekvensen och sonderna för saprofyt, intermediära och patogena arter. För deras identifiering indikeras primers i fetstil och markeras i svart, med deras riktning markerad med svarta pilar. Sonderna är markerade i fetstil och markerade i grått, med deras positioner representerade av grå linjer. De justerade sekvenserna är i ljusgrått och de icke-motsvarande sekvenserna är i vitt och svart. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 6: Buffertar och lösningar för dot-blot-analysen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritiska stegen i dot-blot-tekniken inkluderar (1) DNA-immobilisering, (2) blockering av de fria bindningsställena på membranet med icke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellan sonden och målfragmentet under glödgningsförhållanden, (4) avlägsnande av den ohybridiserade sonden och (5) detektion av reportermolekylen41.

PCR-Dot-bloten har vissa begränsningar, till exempel att tekniken inte ger information om storleken på det hybridiserade fragmentet37, att den kräver dehybridisering av ett enda membran innan rehybridisering med en andra eller tredje sond, och att den kräver mycket tid och ansträngning för att få fram slutresultatet.

Denna teknik har visat överensstämmelse med andra molekylära tekniker42,43 och dess tillämpningar. Omvänd dot-blot, nanogold dot-blot21 och dot-ELISA42 har använts för detektion av specifika gener i organismer som Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 och Mycobacterium tuberculosis48,49 baserat på 16S rRNA29,43, och för detektion av DNA eller RNA från växter Virus41. Detektionsgränsen (LOD) definierad som den lägsta koncentration av mikroorganismen som kan mätas konsekvent och tillförlitligt med denna teknik50, varierade från 100 pg (5 x 104 bakterier) för H. pylori47 till en enda cell av B. burgdorferi i kliniska prover45, och en fg, som är mindre än en cell, av M. tuberculosis48,49.

En värdefull aspekt av denna kombinerade metod är dess förmåga att förlänga detektionsgränsen med en ordning, vilket övervinner falskt negativa resultat på grund av två provförhållanden som kan leda till inkonsekventa resultat: (1) prover med otillräckligt DNA, eller (2) provkontaminering, vilket möjliggör 100 % detektion av positiva prover 25,45,47,48,49. PCR-Dot-bloten har kapacitet att detektera lägre mängder av amplifierade produkter än de som kan detekteras i agarosgelelektrofores, och den undviker kontaminering som en följd av andra amplifieringssteg, som i kapslad och semi-nästlad PCR. Dessa fördelar är särskilt kritiska när man arbetar med miljöprover som innehåller en låg bakteriell laddning, som kan innehålla ett bredare spektrum av hämmare och DNA från orelaterade källor som kan störa de molekylära teknikerna.

Tidigare forskning tyder på att leptospirer kan identifieras av DNA-sonder märkta med fotobiotin som når en LOD på 5 pg (5 x 103 leptospirer)51. DIG-märkta sonder detekterar 0,1-1 pg (102 leptospirer), medan 32P-märkta sonder detekterar 1-5 pg (750 till 1000 leptospirer)51, och biotinmärkta sonder detekterar 5 pg (2500 leptospirer)52. Vidare uppnådde 32P-märkta prober för saprofyten Leptospira en LOD på 1,95 ng och för patogen Leptospira 3,9 ng53. I denna studie fastställdes liknande LOD:er för de tre kladerna. LOD för patogena arter var ungefär 0,3 ng av genomiskt DNA (6-8 x 104 GEq) (Figur 11), och för saprofyter och intermediära arter var den nere på 0,1 ng (2 x 104 GEq). Noterbart är att tidigare studier har utförts med hjälp av rena Leptospira-kulturer 51 och serum från experimentellt infekterade guldhamstrar, i syfte att upptäcka patogen Leptospira54,55 och att tillämpa DNA-hybridisering med 32P märkt som ett verktyg för identifiering och klassificering av Leptospira56. Dessa sonder uppvisar hög specificitet och visar inte korshybridisering med icke-homologt DNA från andra mikroorganismer 19,51,54,55,56,57, och kan skilja även mellan närbesläktade arter som Leptonema 57. Inte heller i detta arbete observerades någon hybridisering med icke-homologt DNA. Även om icke-isotopiska sonder inte är lika känsliga som isotopsonder58 eller andra tekniker43, kan man förvänta sig att kombinationen PCR-Dot-blot tillåter upp till en tiofaldig ökning av känsligheten jämfört med andra PCR-baserade tekniker, vilket ses vid detektion av Leishmania och bovint herpesvirus 4 (BHV4)24,26.

Å andra sidan har dot-blot-testet för identifiering av Leptospira använts mer frekvent med antikroppar, och på senare tid med monoklonala antikroppar som ett alternativ för att diagnostisera människor och djur i urinprov 59,60,61,62. I dessa studier bearbetas provet direkt på membranet utan föregående steg, och antikropparna riktar sig mot specifika Leptospira-ytproteiner som är associerade med patogenesen. Mab-Dot-blot ELISA, till exempel, visar hög känslighet och specificitet och detekterar så lite som 1 μg bakteriehomogenat62. Resultaten från Mab-Dot-blot-analysen kan jämföras med PCR-analyser, som vanligtvis har LOD runt 103 leptospirer/ml urin eller 9,3 ng Leptospirahomogenat 63. Mängden genomiskt DNA som kan amplifieras med PCR är 100 celler (500 fg DNA)61. Dessa tidigare studier använde renkulturer eller kliniska prover utan berikningsprocedurer och var inriktade på bättre diagnos. Med tanke på att infekterade råttor kan utsöndra så mycket som 107 leptospirer/ml urin64, och hundar kan utsöndra mellan 102 och 106 leptospirer/ml urin65, vilket fungerar som källor till kontaminering av vattenförekomster, kräver miljöproverna leptospiralberikning. In vitro PCR-amplifieringen av det riktade DNA:t före blotting möjliggör en förbättring av procedurens känslighet med upp till tio gånger52,55. Vanligtvis skulle produkten förstärkt av en slutpunkts-PCR inte visualiseras i en agarosgelelektrofores; Icke desto mindre blir det uppenbart genom den specifika hybridiseringen av den DIG-märkta sonden i punktbloten.

Även om mycket forskning om Leptospira och leptospiros har fokuserat på sjukdomsdiagnos, är lite känt om deras ekologi i vattendrag och deras utbredning inom dem. PCR-Dot-blot-tekniken utökar verktygslådan för att studera Leptospira och leptospiros, och erbjuder fördelen att screena ett stort antal prover och påskynda resultat och tolkning. PCR-Dot-blot är en relativt billig, enkel och icke-radioaktiv teknik som kan rymma flera sonder på ett enda membran. Dessutom eliminerar det behovet av sofistikerad utrustning och komplexa arbetsflöden, vilket kan vara en utmaning i resursbegränsade miljöer.

Effekten av denna studie ligger i dess framtida tillämpning för att studera stora vattenmassor på olika djup, såväl som andra ekologiska nischer och provtyper, inklusive jord, stillastående vatten, avföring, blod och vävnader.

Sammanfattningsvis demonstrerar detta arbete tillämpningen av PCR-Dot-blot-tekniken, baserad på digoxigeninmärkning av DNA-sonder för identifiering av de tre kladerna inom släktet Leptospira. Denna metod effektiviserar identifieringsprocessen genom att reducera den till ett enda amplifieringssteg och möjliggör antingen tre samtidiga hybridiseringar eller tre på varandra följande hybridiseringar med ett enda membran. Detektionsgränserna som uppnås med denna teknik liknar de som uppnås med radioaktiva sonder53, vilket gör den till ett värdefullt verktyg för att identifiera Leptospira i vattenprover från naturliga källor. Följaktligen erbjuder denna teknik ökad känslighet och ger exakta och konsekventa resultat vid utvärdering av prover med minimala mängder bakteriellt DNA. Det fungerar som ett alternativt tillvägagångssätt för att studera dynamiken hos Leptospira i vattenförekomster och kan underlätta bedömning och övervakning av bredare miljöprover, vilket hjälper till att genomföra förebyggande åtgärder mot överföring av denna mikroorganism.

Om du har problem med tekniken kan du tänka på följande felsökningshöjdpunkter: (1) Om prickarna har oregelbundna former, kontrollera att vakuumsystemet är ordentligt stängt på tvären och upprepa sedan överföringen. (2) Om hybridiseringsröret går sönder under proceduren över natten, vilket gör att membranet förlorar hybridiseringsbufferten, se avsnittet "De-hybridiseringsprocedur" och starta om processen. (3) Om inga prickar är synliga, kassera inte membranet; fortsätt till avsnittet "De-hybridiseringsprocedur" för att upprepa hybridiseringsstegen. (3) Om ojämna vita områden märks på den framkallade röntgenfilmen, se till att inga luftbubblor fångas in under påsförseglingsprocessen. (5) Om ojämna svarta områden observeras på den framkallade röntgenfilmen, kontrollera att CSPD har fördelats noggrant med hjälp av fuktade fingrar. (6) Om röntgenfilmen visar skuggor av prickarna, se till att filmen inte flyttas under exponeringstiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte föreligger någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi står i tacksamhetsskuld till Leptospira-samlingen vid Institutionen för mikrobiologi och immunologi, fakulteten för veterinärmedicin och zooteknik, National Autonomous University of Mexico. Vi är tacksamma för den generösa donationen av referensstammarna Leptospira ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6 och Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I till Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Vi tackar Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, CIBAC-samordnaren, och personalen för deras logistiska stöd. EDT var under Terminal Project-programmet för studenter på grundnivå vid Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Vi är medvetna om att det finns Biorender.com programvara för att skapa figurerna 1 och 3 till 9.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit Invitrogen K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) Promega M3001
Whatman filter paper, grade 1, Merk WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m Roche 11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody Roche 11093274910
Medium Base EMJH Difco S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH Difco BD 279510
Blocking Reagent Roche 11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate Merk 11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm Sigma Aldrich D3159
Developer Carestream Carestream Health Inc GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP Roche 11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) Promega H5032
Ficoll 400 Sigma Aldrich F8016
Fixer Carestream Carestream Health Inc GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa Sigma Aldrich L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa Sigma Aldrich L-9150 It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40) Sigma Aldrich PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) Sigma Aldrich 9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich 7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich 7558-79-4
Terminal transferase, recombinant Roche 3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl) Sigma-Aldrich 1185-53-1
SSPE 20X Sigma-Aldrich S2015-1L It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Probes Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer Thermo-Scientific ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm Sigma-Aldrich 1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl Gilson SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen 3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl Axygen T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl Axygen TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot BIORAD 1706545
Portable Hergom Suction Hergom 7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) Hoefer PH90-115V
UV Crosslinker Hoefer UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler Hybaid HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 Fuji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055 (2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387, 65-97 (2015).
  3. Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
  4. Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
  5. Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
  6. Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
  7. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898 (2015).
  8. Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843 (2015).
  9. Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
  10. Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
  11. Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
  12. Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
  13. Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
  14. Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
  15. Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051 (2015).
  16. Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721 (2022).
  17. Gillespie, R. W., Ryno, J. Epidemiology of leptospirosis. American Journal of Public Health and Nation’s Health. 53 (6), 950-955 (1963).
  18. Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
  19. Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
  20. Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
  21. Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
  22. Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  23. Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
  24. Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
  25. Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
  26. Pilatti, M. M., Ferreira, S. deA., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
  27. Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
  28. Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
  29. Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
  30. Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M. Leptospira taxonomy: then and now. Medycyna Weterynaryjna. 78 (10), 489-496 (2022).
  31. Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816 (2018).
  32. Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
  33. Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241 (2016).
  34. Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28 (2006).
  35. Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
  36. Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996 (2016).
  37. Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
  38. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  39. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607 (2008).
  40. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  41. Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , Springer Protocols Handbooks. Humana, NewYork, NY. 303-321 (2020).
  42. Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317 (2021).
  43. Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
  44. Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
  45. Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
  46. Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
  47. Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
  48. Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
  49. Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356 (2007).
  50. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  51. Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
  52. Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
  53. Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
  54. Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
  55. Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
  56. Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
  57. Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
  58. Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
  59. Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
  60. Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
  61. Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  62. Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250 (2017).
  63. Levett, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14 (2), 296-326 (2001).
  64. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
  65. Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).

Tags

Denna månad i JoVE Leptospira Dot-blot PCR Digoxigenin
Polymeraskedjereaktion och dot-blot-hybridisering för <i>Leptospira-detektion</i> i vattenprover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delgadillo-Tellez, E.,… More

Delgadillo-Tellez, E., Zavaleta-Villa, B., Atilano-López, D., Hernández-Castro, R., Olivo-Díaz, A., Carrillo-Casas, E. M. Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples. J. Vis. Exp. (208), e65435, doi:10.3791/65435 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter