Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Su Örneklerinde Leptospira Tespiti için Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Nokta-Blot Hibridizasyonu,

Published: June 14, 2024 doi: 10.3791/65435
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

Summary

Bu çalışmada, su örneklerinde üç ana daldan Leptospira'yı tespit etmek için bir nokta-leke uygulaması tasarlanmıştır. Bu yöntem, bir anti-digoksigenin antikoru tarafından kolayca tespit edilen, digoksigenin etiketli bir prob tarafından spesifik olarak hedeflenen minimum DNA miktarlarının tanımlanmasına izin verir. Bu yaklaşım, tarama amaçları için değerli ve tatmin edici bir araçtır.

Abstract

Nokta lekesi, taşıyıcı DNA'nın varlığında prob hibridizasyonuyla özel olarak hedeflenen minimum miktarda DNA'nın tanımlanmasını sağlayan basit, hızlı, hassas ve çok yönlü bir tekniktir. Bilinen bir miktarda DNA'nın, nokta-leke aparatı kullanılarak ve elektroforetik ayırma olmaksızın naylon zar gibi inert bir katı destek üzerine aktarılmasına dayanır. Naylon membranlar, yüksek nükleik asit bağlama kapasitesi (400 μg/cm2), yüksek mukavemet avantajına sahiptir ve pozitif veya nötr yüklüdür. Kullanılan prob, digoksijenenin (DIG) ile uzun süre etiketlenmiş 18 ila 20 bazdan oluşan oldukça spesifik bir ssDNA fragmanıdır. Prob, Leptospira DNA'sı ile konjuge olacaktır. Prob, hedef DNA ile hibritlendikten sonra, bir anti-digoksigenin antikoru tarafından tespit edilir ve bir X-ışını filminde ortaya çıkan emisyonları sayesinde kolay tespit edilmesini sağlar. Emisyonlu noktalar, ilgilenilen DNA parçalarına karşılık gelecektir. Bu yöntem, çok uzun bir yarı ömre sahip olabilen probun izotopik olmayan etiketlemesini kullanır. Bu standart immüno-etiketin dezavantajı, izotopik problardan daha düşük bir hassasiyettir. Bununla birlikte, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve nokta-blot deneylerinin birleştirilmesiyle hafifletilir. Bu yaklaşım, hedef dizinin zenginleştirilmesini ve algılanmasını sağlar. Ek olarak, iyi bilinen bir standardın seri seyreltilmesiyle karşılaştırıldığında nicel bir uygulama olarak kullanılabilir. Su örneklerinde üç ana daldan Leptospira'yı tespit etmek için bir nokta-leke uygulaması burada sunulmaktadır. Bu metodoloji, Leptospiral DNA'nın varlığına dair kanıt sağlamak için santrifüjleme ile konsantre edildikten sonra büyük miktarlarda suya uygulanabilir. Bu, genel tarama amaçları için değerli ve tatmin edici bir araçtır ve suda bulunabilecek diğer kültürlenemeyen bakteriler için kullanılabilir, bu da ekosistemin anlaşılmasını geliştirir.

Introduction

İnsanlarda leptospirosis esas olarak çevresel kaynaklardan kaynaklanır 1,2. Göllerde, nehirlerde ve akarsularda Leptospira'nın varlığı, yaban hayatı ve sonunda bu su kütleleriyle temas edebilecek evcil ve üretim hayvanları arasında leptospirosis bulaşmasının bir göstergesidir 1,3,4. Ayrıca, Leptospira, kanalizasyon, durgun ve musluk suyu dahil olmak üzere doğal olmayan kaynaklarda tespit edilmiştir 5,6.

Leptospira, dünya çapında dağılmış bir bakteridir 7,8 ve çevrenin korunması ve iletilmesindeki rolü iyi bilinmektedir. Leptospira, değişken pH ve mineraller9 altında içme suyunda ve doğal su kütlelerinde1 hayatta kalabilir. Ayrıca damıtılmış suda10 uzun süre hayatta kalabilir ve sabit pH (7.8) altında 152 güne kadar hayatta kalabilir11. Ayrıca, Leptospira zorlu koşullarda hayatta kalmak için bakteri konsorsiyumlarında etkileşime girebilir12,13. Azospirillum ve Sphingomonas ile tatlı sudaki biyofilmlerin bir parçası olabilir ve hatta 49 ° C'yi aşan sıcaklıklarda büyüme ve dayanma yeteneğine sahiptir14,15. Ayrıca su ile tıkanmış toprakta çoğalabilir ve 379 güne kadarcanlı kalabilir 16 ve hastalığa neden olma yeteneğini bir yıl kadar uzun süre koruyabilir17,18. Bununla birlikte, su kütleleri içindeki ekoloji ve bunların içinde nasıl dağıldığı hakkında çok az şey bilinmektedir.

Keşfinden bu yana, Leptospira cinsinin çalışması serolojik testlere dayanıyordu. İçinde bulunduğumuz yüzyıla kadar, bu spiroketin çalışmasında moleküler teknikler daha yaygın hale gelmedi. Nokta-leke, (1) 16S rRNA'ya dayalı bir izotopik prob ve basitler arası dizi tekrarına (ISSR) 19,20, (2) idrara uygulanan insan leptospirozu için nanogold bazlı bir immünolojik test olarak21 veya (3) sığır idrar örnekleri için antikor bazlı bir test olarak22. Teknik, başlangıçta izotopik problara dayandığı için kullanım dışı kaldı. Bununla birlikte, PCR ile birleştiğinde gelişmiş sonuçlar veren iyi bilinen bir tekniktir ve izotopik olmayan probların kullanılması nedeniyle güvenli kabul edilir. PCR, bir numunede eser miktarlarda bulunabilen spesifik bir DNA fragmanını amplifiye ederek Leptospira DNA'sının zenginleştirilmesinde çok önemli bir rol oynar. Her PCR döngüsü sırasında, hedeflenen DNA fragmanının miktarı reaksiyonda iki katına çıkar. Reaksiyonun sonunda, amplikon bir milyondan fazla23 faktörü ile çarpılmıştır. PCR ile amplifiye edilen, genellikle agaroz elektroforezinde görülmeyen ürün, nokta lekesi 24,25,26'da DIG etiketli bir prob ile spesifik hibridizasyon yoluyla görünür hale gelir.

Nokta-leke tekniği basit, sağlam ve çok sayıda numune için uygundur, bu da onu sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar için erişilebilir kılar. (1) oral bakteriler27, (2) gıda ve dışkı28 gibi diğer numune türleri ve (3) kültürlenemeyen bakterilerintanımlanması 29 dahil olmak üzere, genellikle diğer moleküler tekniklerle uyumlu olarak çeşitli bakteri çalışmalarında kullanılmıştır. Dot-blot tekniğinin sunduğu avantajlar arasında şunlar yer alır: (1) Membran, 200 μg/cm2'den fazla nükleik asit ve 400 μg/cm2'ye kadar bağlayabilen yüksek bir bağlama kapasitesine sahiptir; (2) Nokta lekesi sonuçları, özel ekipman gerektirmeden görsel olarak yorumlanabilir ve (3) oda sıcaklığında (RT) yıllarca rahatlıkla saklanabilir.

Leptospira cinsi patojenik, orta ve saprofit dallar olarak sınıflandırılmıştır30,31. Bu kladlar arasındaki ayrım, lipL41, lipL32 ve 16 S rRNA gibi spesifikgenlere dayalı olarak elde edilebilir. LipL32 patojenik dallarda bulunur ve çeşitli serolojik ve moleküler araçlarda yüksek hassasiyet gösterirken, saprofit türlerindeyoktur 21. Temizlik geni lipL41, kararlı ekspresyonu ile bilinir ve moleküler tekniklerde32 kullanılırken, 16S rRNA geni bunların sınıflandırılması için kullanılır.

Bu metodoloji, santrifüjleme ile konsantre edildikten sonra büyük hacimlerde suya uygulanabilir. Leptospiral DNA'nın varlığını ve ait olduğu kolu tespit etmek için bir su kütlesi içindeki çeşitli noktaların ve derinliklerin değerlendirilmesine izin verir. Bu araç hem ekolojik hem de genel tarama amaçları için değerlidir ve suda bulunabilecek diğer kültürlenemeyen bakterileri tespit etmek için de kullanılabilir.

Ek olarak, PCR ve nokta lekesi tahlilleri, karmaşık veya pahalı ekipmana sahip olmayanlar da dahil olmak üzere çok çeşitli laboratuvarlar için teknik ve ekonomik olarak uygun maliyetlidir. Bu çalışma, doğal su kütlelerinden toplanan su örneklerinde üç Leptospira dalının tanımlanması için digoksigenin bazlı nokta-lekeyi uygulamayı amaçlamaktadır.

Bakteri suşları
On iki Leptospira serovarı (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tasma ve Wolffi) bu çalışmaya dahil edildi. Bu serovarlar, Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi Veterinerlik ve Zooteknik Fakültesi, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki koleksiyonun bir parçasıdır ve şu anda mikroaglütinasyon testinde (MAT) kullanılmaktadır.

Tüm Leptospira serovarları EMJH'de kültürlendi ve DNA'ları ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak ekstrakte edildi (bkz. On iki serovarın bir genomik DNA karışımı, Leptospira patojenik sınıfı için pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Leptospira ara sınıfının pozitif bir kontrolü olarak, Leptospira fainei serovar Hurstbridge suşu BUT6'dan genomik DNA dahil edildi ve Leptospira saprofit sınıfı için pozitif bir kontrol olarak, Leptospira biflexa serovar Patoc suşu Patoc I'in genomik DNA'sı da dahil edildi.

Negatif kontroller boş bir plazmit, akraba olmayan bakterilerden (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii ve Escherichia coli) DNA'dan ve şablon olmayan kontrol olarak görev yapan PCR dereceli sudan oluşuyordu.

Su örnekleri
Cuemanco Biyolojik ve Su Ürünleri Araştırma Merkezi'nden (CIBAC) (19 ° 16' 54" N 99 ° 6 '11" W) tabakalı-gelişigüzel örnekleme yöntemi kullanılarak on iki deneme yakalama örneği toplandı. Bu örnekler yüzeysel, 10 ve 30 cm olmak üzere üç derinlikte elde edilmiştir (Şekil 1A, B). Su toplama prosedürleri, nesli tükenmekte olan veya korunan herhangi bir türü etkilemedi. Her örnek steril 15 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplandı. Numuneyi toplamak için, her tüp nazikçe suya batırıldı, seçilen derinlikte dolduruldu ve ardından kapatıldı. Numuneler 22 °C'de tutuldu ve işlenmek üzere derhal laboratuvara taşındı.

Her numune, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 8000 x g'da steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde santrifüjleme yoluyla konsantre edildi. Bu adım, tüm numuneler daha sonra DNA ekstraksiyonu için kullanılan tek bir tüpe konsantre edilene kadar tekrarlandı (Şekil 1C).

Figure 1
Şekil 1: Santrifüjleme ile su örneklerinin konsantrasyonu. (A) Su örnekleme havuzları ve (B) Doğal akarsular. (C) Santrifüjleme bazlı su numunesinin gerektiği kadar tekrarlanan adımlarla işlenmesi (n). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DNA ekstraksiyonu
Toplam DNA, üreticinin talimatlarına göre ticari bir Genomik DNA kiti kullanılarak izole edildi (bkz. Malzeme Tablosu). DNA ekstraksiyonları 20 μL elüsyon tamponunda ayrıştırıldı ve DNA konsantrasyonu 260-280 nm'de bir UV Spektrofotometre ile belirlendi ve kullanıma kadar 4 ° C'de saklandı.

PCR amplifikasyonu
PCR hedefleri, Leptospira cinsinden DNA'yı tanımlayan ve patojenik, saprofit ve orta olmak üzere üç dal arasında ayrım yapılmasına izin veren 16S rRNA, lipL41 ve lipL32 genleriydi. Hem primerler hem de prob tasarımları, Ahmed ve ark., Azali ve ark., Bourhy ve ark., Weiss ve ark. ve Branger ve ark.33,34,35,36,37 tarafından yapılan önceki çalışmalara dayanıyordu. Her bir probun, primerin ve amplifiye edilmiş parçanın dizisi Tablo 1'de açıklanmıştır ve bunların referans dizileriyle hizalanması Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5'te verilmiştir. PCR reaktifleri ve termosiklasyon koşulları protokol bölümünde açıklanmıştır.

Amplifikasyon ürünleri, Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, etidyum-bromür tespiti ile 45 dakika boyunca 60 V'ta TAE'de (40 mM Tris bazı, 20 mM Asetik asit ve 1 mM EDTA; pH 8.3) %1'lik bir agaroz jel üzerinde elektroforetik ayırma ile görselleştirildi. Her bir serovardan elde edilen genomik DNA, her PCR reaksiyonunda 6 x 106 ila 1 x 104 genomik eşdeğer kopya (GEq) arasında değişen konsantrasyonlarda kullanıldı, L. interrogans'ın genom boyutuna dayalı olarak (4, 691, 184 bp)38 patojenik Leptospira için, saprofit Leptospira için L. biflexa'nın (3, 956, 088 bp)39 genom boyutu, ve L. fainei serovar Hurstbridge suşu BUT6'nın (4, 267, 324 bp) genom boyutu, erişim numarası AKWZ00000000.2.

Probların duyarlılığı, her deneyde her bir patojenik serovar, L. biflexa serovar Patoc suşu Patoc I ve L. fainei serovar Hurstbridge suşu BUT6'dan alınan DNA ile değerlendirildi. PCR ve nokta-blot hibridizasyon testinin özgüllüğünü değerlendirmek için, ilgili olmayan bakterilerden alınan DNA dahil edildi.

Tablo 1: Leptospira'nın patojenik, saprofit ve ara sınıflarını tanımlamak için ürünleri çoğaltmak için PCR primerleri ve probları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Nokta-blot hibridizasyon deneyi
Bu tekniğe nokta-leke adı verilir çünkü DNA örneğinin yerleştirildiği delikler nokta şeklindedir ve vakumla emme ile yerlerine sabitlenmek üzere emildiklerinde bu şekli alırlar. Bu teknik Kafatos ve ark.40 tarafından geliştirilmiştir. Teknik, her PCR pozitif numunede Leptospira'nın yarı miktar tayinine izin verir. Protokol, oda sıcaklığında NaOH 0.4 M ile bir denatürasyondan, 6 x 106 ila 1 x 104 leptospire karşılık gelen 30 ng ila 0.05 ng Leptospira DNA'lı numunelerden oluşur, 96 oyuklu bir nokta lekesi aparatı ile bir naylon membran üzerine lekelenir. İmmobilizasyondan sonra DNA, 120 mJ UV ışığına maruz bırakılarak zara bağlanır. Her DNA probu, 3' ucunda bir terminal transferaz kataliz adımı ile digoksigenin-11 dUTP ile konjuge edilir (Digoksigenin, raportör olarak kullanılan Digitalis purpurea'dan elde edilen bir bitki steroididir41). Etiketli DNA probunun (50 pmol) spesifik sıcaklıkta hedef DNA üzerine sıkı bir şekilde hibridizasyonunu takiben, DNA hibritleri, substratı CSPD ile kovalent olarak konjuge edilmiş anti-digoksigenin alkalin fosfataz antikoru ile kemilüminesans reaksiyonu ile görselleştirilir. Lüminesans, bir X-ışını filmine maruz bırakılarak yakalanır (Şekil 2).

Figure 2
Şekil 2: PCR-nokta-leke testi için prosedür adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Numune hazırlama

  1. Her su örneğini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 8.000 x g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca konsantre edin. Numuneyi 250 μL'lik bir hacme konsantre etmek için bu adımı gerektiği kadar tekrarlayın.
  2. DNA ekstraksiyon kitini üreticinin talimatlarına göre kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Kullanılacak nokta-leke probuna göre spesifik PCR'yi gerçekleştirin (Tablo 1).
    1. Amplifikasyonları, 1 X tampon, 2.5 birim Taq polimeraz, her primerden 1 μM, her dNTP'den 0.2 mM, 1.5 mMMgCl2 ve her su örneğinden veya referans genomik DNA'dan 100 ng hedef DNA içeren 25 μL'lik son hacme sahip PCR tüplerinde gerçekleştirin.
    2. PCR reaksiyonunu bir termosiklerde termosikling koşullarına göre programlayın (Tablo 2).
    3. Reaksiyonları kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  4. Lekelenecek her PCR ürününden 10 μL'yi 96 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin.
  5. Her kuyucuğa 40 μL TE ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
    NOT: 96 oyuklu plaka kapatılabilir ve gece boyunca 4 °C'de saklanabilir. Protokol için arabellekler ve çözeltiler hazırlamak için Ek Dosya 6'da verilen talimatları izleyin. Şekil 3 , numune hazırlama adımlarını göstermektedir.

Tablo 2: 16S, lipL41 ve lipL32 genleri için PCR termosiklasyon koşulları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: PCR ve numune hazırlama. Spesifik PCR protokolü uygulanarak, PCR ürünü bir mikrotitre plakasına aktarıldı ve her oyuğa 40 μL TE ilave edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Nokta leke aparatının montajı

NOT: Nokta leke aparatının montajı Şekil 4'te gösterilmiştir. İşlem sırasında, alkali çözeltileri tutmak ve naylon zarı kontaminasyondan korumak için eldiven giyin.

Figure 4
Şekil 4: Nokta lekesi aparatı montajı. Filtre kağıdı ve naylon membran (önceden 10 X SSPE ile nemlendirilmiş) doğru sırada düzenlenmelidir. Vakum uygulanmadan önce tertibat vidalarla sıkıca sabitlenmelidir. Her kuyunun TE ile yıkanması gerekir ve PCR ürünleri ilgili kuyucuklarına yüklenir. PCR ürünü membrandan aktarıldıktan sonra, her bir kuyucuk tekrar TE ile yıkanır ve kurumaya bırakılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Naylon membranı kesin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve kağıdı 12 x 8,5 cm boyutunda tabakalar halinde filtreleyin.
  2. Membranı kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin.
  3. Doğru yönü belirtmek için bir kenarında makasla bir çentik açın. Örnek siparişi hatırlamak için işareti kullanın.
  4. Membranı ve filtre kağıdını 10 X Salin-sodyum fosfat-EDTA tamponu (SSPE; 3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4 ve 0.02 M EDTA, pH 7.4) ile nemlendirin (Ek Dosya 6). Membranı temiz, kör uçlu bir cımbızla tutun.
  5. Nokta lekesi odasını monte edin; Önce filtre kağıdı, ardından plastik conta üzerindeki zar. Kapağı vidalarla çapraz olarak sabitleyin.
  6. Hazneyi vakuma bağlayın, her bir oyuğa 100 μL TE yerleştirin, vakumu 1 dakika tutun ve ardından durdurun.
  7. Vakumu düşük hızda açın ve her bir numuneden 50 μL'yi nokta-leke aparatının zarındaki ilgili kuyuya yükleyin (önceden kararlaştırılmış zar dağılımını takiben).
    NOT: Her bir numuneyi, nokta leke odasına yerleştirmeden önce hemaglutinasyon 96 oyuklu plakada homojenize edin.
  8. Vakumun zarı kurumasına izin verin. Gerekirse, numunedeki kabarcıkları serbest bırakmak için hazneye hafifçe vurun.
  9. Her bir kuyuyu sürekli bir vakumla 100 μL TE koyarak ve kurumasını sağlayarak yıkayın.
    NOT: Aktarımı tamamladıktan sonra, önce pompayı kapatmak ve sökmek çok önemlidir. Bunun yapılmaması, cihaza geri akışın girmesine neden olabilir. Pozitif yüklü bir naylon membran kullanılıyorsa DNA'nın bir denatürasyon adımına ihtiyacı yoktur, ancak başka bir inert destek kullanılıyorsa, bir ön denatürasyon adımı ve alkali bazlı denatürasyon gerekebilir41.

3. DNA denatürasyonu ve fiksasyonu

NOT: Şekil 5 , DNA zarı fiksasyon prosedürünü göstermektedir.

Figure 5
Şekil 5: DNA-membran fiksasyon prosedürü. DNA, alkali bir çözelti içinde denatüre edilir. Daha sonra 10 X SSPE ile nötralize edilir ve zar kurutulur. Daha sonra, zar transilluminasyona tabi tutulur. Membran 2 X SSPE ile rehidre edilir ve gece boyunca önceden hibritlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Membranı 0.4 M NaOH ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  2. Membranı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10 X SSPE ile dengeleyin.
  3. Membranı 80 °C'de 2 saat kurutun.
  4. 120 mJ UV ışığı ile 3 dakika boyunca aydınlatın. Numunelerin yüzü aşağı bakacak şekilde UV ışık kaynağına doğru yönlendirildiğinden emin olun. UV çapraz bağlayıcı kullanıyorsanız, numunelerin yukarı baktığını onaylayın ve bu adımı iki kez tekrarlayın.
    NOT: UV çapraz bağlamadan önce membran tamamen kuru olmalıdır. DNA, naylon zara kovalent bir bağ ile hareketsiz hale getirilecektir. Her çapraz bağlama, çoğu hibridizasyon deneyi için yaklaşık 0.6-0.8 kJ /m2'lik optimal bir UV ışınlama dozu ile yaklaşık 18 '' ila 1' alır.
    UV ışınlarına maruz kalmak gözler ve cilt için zararlıdır. Uygun koruyucu ekipman giyin ve çıplak cilde maruz kalmaktan kaçının.
  5. Membranı 2 X SSPE ile 10 dakika yıkayın.
  6. Membranı dikkatlice katlayın ve hibridizasyon tüpüne yerleştirin (15 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanın).
  7. Tüpe 10 mL ön hibridizasyon çözeltisi (Ek Dosya 6) ekleyin ve gece boyunca 42 ° C'de inkübe edin. Herhangi bir sızıntıyı önlemek için borunun uygun şekilde kapatıldığından emin olun.

4. Hibridizasyon

  1. Hibridizasyon tüpünden 5 mL ön hibridizasyon solüsyonunu çıkarın. 5 mL'yi ikinci kez kullanmak için başka bir tüpte saklayın ve -4 °C'de saklayın.
  2. Hibridizasyon tüpüne 15 μL etiketli prob (Tablo 1) ekleyin. Etiketli probun seyreltmeye iyice damlatıldığından emin olmak için ucu solüsyonun içine durulayın.
    NOT: DNA probunun bağlanması, antijen-antikor bağlanması kadar güçlü değildir. Bu nedenle, numunedeki prob veya DNA'nın konsantrasyonundaki değişiklikler, yayılan floresanın yoğunluğunu etkileyebilir. DNA probları stokiyometriktir, yani DNA'ya bağlı prob moleküllerinin sayısı, çözeltide bulunan DNA moleküllerinin sayısına eşdeğerdir. Şekil 6 , prob hibridizasyonunu göstermektedir.
  3. Gece boyunca 42 °C'de inkübe edin.
  4. DNA probu DIG etiketlemesi gerçekleştirin. Reaktifleri karıştırmak için Tablo 3'te belirtilen talimatları izleyin, ardından karışımı 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Daha sonra, 80 μL damıtılmış su ekleyin ve kuyruklu probu 4 °C'de saklayın.

Figure 6
Şekil 6: Prob hibridizasyonu. Hibridizasyon tamponunun hacmi ayarlanır ve digoksigenin etiketli prob, probun gece boyunca hibridizasyonuna izin vermek için dahil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Digoksigenin (DIG) ile etiketlenen problar için reaktifler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Kemilüminesans (anti-DIG etiketleme)

  1. Membranı oda sıcaklığında 2 X SSPE /% 0.1 SDS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  2. Membranı, probun tavlama sıcaklığında 5 X SSPE /% 0.1 SDS ile 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu adımda, sıcaklığı mümkün olduğu kadar uzun süre korumak için kapaklı bir kap kullanın. Membran boyunca eşit ve sabit sıcaklık sağlayın. Her yıkamadaki yaklaşık hacim, belirtilen çözeltinin 100 mL'sidir.
  3. Membranı Tampon 1 (Ek Dosya 6) ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir kez yıkayın.
  4. Membranı Tampon 2 (Ek Dosya 6) ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir kez yıkayın.
  5. Membranı Tampon 2 ile yıkayın ve anti-digoksigenin antikorunu (15 μL) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), ardından 45 dakika inkübe edin (inkübasyon süresi 30-60 dakika arasında değişebilir). Bu ikincil antikor, tespit için probu etiketler.
    NOT: Membran, anti-digoksigenin antikoru ile Tampon 2'de gece boyunca 4-8 °C'de saklanabilir. Kemilüminesans işleminin anti-DIG etiketlemesi Şekil 7'de gösterilmiştir.

Figure 7
Şekil 7: Kemilüminesans işleminin anti-DIG etiketlemesi. Bağlanmamış nükleik asitler tampon çözeltilerle uzaklaştırılır. Prob hedef DNA ile hizalanır ve fazlalık çıkarılır. Membran, bloke edici 1 X tamponu ile bloke edilir ve anti-DIG antikoru eklenir (1:10000). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Kemilüminesans (substrat uygulaması)

  1. Membranı Tampon 1'de oda sıcaklığında 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  2. Tampon 3'te bir kez ( Ek dosya 6'ya bakın) oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın, zarın tamponun çoğunu boşaltmasına izin verin ve neredeyse kuru bırakın.
  3. CSPD'yi kullanıma hazır hale getirin (Disodyum 3-(4-metoksispiro {1,2-dioksetan-3,2" - (5'-kloro) trisiklo [3.3.1.13,7] dekan}-4-il) fenil fosfat, Malzeme Tablosuna bakınız) ve 5 dakika bekletin (nemli parmaklarla CSPD'yi bir taraftan diğer tarafa homojenize edin).
  4. Membranı, membran boyutuna uyan şeffaf bir plastik torbaya (12,5 x 9 cm) yerleştirin. Hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın, CSPD'yi eşit şekilde dağıtın ve torbayı ısıyla kapatın.
  5. Membranı 37 °C'de bir su banyosunda 15 dakika (30 dakikaya kadar olabilir) inkübe edin ve numunelerin bulunduğu zarın iyice suya daldırılacak şekilde aşağı doğru yerleştirildiğinden emin olun. Sıcaklığın sabit kaldığından ve zar üzerinde iyi dağıldığından emin olun.
  6. Plastik torbayı kurutun ve önceden kullanılmış bir radyografik film üzerine bantla sabitleyin. Bu, maruz kalma prosedürü sırasında kolay kullanım sağlayacaktır.
    NOT: Şekil 8 , kemilüminesans işleminin substrat uygulamasını göstermektedir.

Figure 8
Şekil 8: Kemilüminesans işleminin substrat uygulaması. Serbest antikor çıkarılır ve substrat CSPD (1:250) membrana eklenir. Reaksiyon, 37 ° C'de inkübasyon ile aktive edilir ve zar, bir X-ışını filminde kemilüminesansı kaydetmek için düzenlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. Kemilüminesans (tespit)

  1. Pozlama prosedürünü gerçekleştirin. Karanlık odada, geliştirici ve sabitleyici solüsyonları ( Malzeme Tablosuna bakınız) ilgili tepsilerde hazırlayın.
  2. Karanlıkta, sabit zarı yeni bir radyografik filme bakacak şekilde dikkatlice yerleştirin ve bir radyografik kasete yerleştirin (bkz.
  3. Maruz kalma süresini kaydedin. Maruz kalma süresi 1 dakika ila 30 dakika veya daha fazla arasında değişebilir. 5 dakika ile başlayın ve süreyi buna göre ayarlayın.
  4. X-ışını filmini geliştirici solüsyonunda 1-3 dakika nemlendirin ve musluk suyuyla (15-45 sn) nazikçe durulayın.
  5. X-ışını filmini sabitleyici solüsyonda 1-3 dakika nemlendirin ve musluk suyuyla (45 sn) nazikçe durulayın.
  6. X-ışını filminin kurumasına izin verin ve testi görünür beyaz bir ışık kutusunda belgeleyin.
    NOT: X ışınına maruz kalma süresi boyunca zarı sallamaktan kaçının. Algılama işlemi Şekil 9'da gösterilmiştir.
  7. Sonuç yorumlamasına devam edin. Açıkta kalan X-ışını filminde, emisyonlu noktalar görsel olarak konumlandırılabilir ve probun hibridizasyonuyla DNA parçalarına karşılık gelebilir. Yayılan sinyalin yoğunluğu, lüminesansa ve maruz kalma süresine bağlıdır.
    NOT: Membranlar, oda sıcaklığında birkaç ay boyunca filtre kağıdı arasında kurutulmuş olarak saklanabilir.

Figure 9
Şekil 9: Kemilüminesans işleminin tespiti. Karanlık koşullar altında, zar bir X-ışını kaseti içindeki bir X-ışını filmine maruz bırakılır. Daha sonra, sergi süresi boyunca durmasına izin verildi ve daha sonra X-ışını filmi geliştirildi ve sabitlendi. Son olarak havayla kurutuldu ve yorumlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

8. Membran de-hibridizasyon prosedürü

  1. Membranı damıtılmış su ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  2. Membranı 53 ° C'de 0,4 M NaOH ile 20 dakika boyunca yıkayın (iki kez).
  3. Membranı 2 X SSPE ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  4. Membranın oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
  5. Membranı koruyun ve protokolün 3.5 adımına dönün.
    NOT: Membran, gece boyunca 4-8 °C'de ön hibridizasyon tamponunda saklanabilir. Ertesi gün, 1 saat boyunca 42 ° C'de bir inkübasyon ile yeniden başlatın ve ön hibridizasyon tamponunun sıcaklığa ulaşmasına izin verin. Ardından, protokolün 3.5 adımına geçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tekniğin etkinliğini değerlendirmek için, her bir Leptospira serovarının saf kültürlerinden elde edilen genomik DNA, dala özgü prob ile birlikte kullanıldı. Membranlar, her bir serovar için PCR reaksiyonu başına 100 ng genomik DNA ile hazırlandı, ardından akraba olmayan bakterilerin sekiz genomik DNA'sı ve ad hoc Leptospira serovarlarının değişken genomik DNA konsantrasyonları izledi. Her tahlil pozitif, negatif ve şablon olmayan kontrolü içeriyordu. Bu ilişkili olmayan genomik DNA, nokta-leke probları için bir afinite göstermedi. Membran dağılımı ve nokta-blot membranları Ek Şekil 2, Ek Şekil 3, Ek Şekil 4, Ek Şekil 5, Ek Şekil 6, Ek Şekil 7'de gösterilmiştir. Saprofit kladı ile ilgili olarak, DB_Saproprobe'ninSPathoREV ve DB_16 S PathoFWD primer DB_16 leri ile amplifiye edilmiş 1059 bp'lik PCR ürünü ve Leptospira biflexa serovar Patoc I'in genomik DNA DB_16'sı ileSSapREV ve DB_16SSapFWD primerleri ile amplifiye edilmiş 517 bp'lik PCR ürünü kullanılarak, 0.05-0.1 ng arasında saprofit DNA tespit etmek mümkün olmuştur (Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3). Benzer şekilde, ara sınıfın tespiti için, DB_16SPathoREV ve DB_16 S PathoFWD primerleri ile amplifiye edilmiş 1059 bp'lik PCR ürünü ile DB_Interprobe ve Leptospira fainei serovar Hurstbridge suşu BUT6'nın genomik DNA'sı ile DB_16 DB_16SInterFWD primerleri ile amplifiye edilmiş 299-301 bp'lik PCR ürünü kullanılarak (Ek Şekil 4 ve Ek Şekil 5), ara DNA'nın yaklaşık 0.1 ng'sini tespit etmek mümkün oldu. Benzer şekilde,SPathoREVve DB_16 S PathoFWD primer DB_16 leri ile amplifiye edilmiş 1059 bp'lik PCR ürünü ile DB_16 S Pathoprobe veya patojenik Leptospira serovarlarından genomik DNA karışımı ile DB_lipL41REV ve DB_lipL41FWD primerler tarafından amplifiye edilmiş 479 bp'lik PCR ürünü ile DBlipL41probe kullanan patojenik sınıf için, 0.3-0.6 ng patojenik DNA arasında değişen DNA konsantrasyonlarını tespit etmek mümkün olmuştur (Ek Şekil 6 ve Ek Şekil 7).

Üç sınıfı tanımlamak için tasarlanan tahliller, her bir dal için ayrı ayrı kullanılabilir. Bununla birlikte, değerli ve kıt numuneler söz konusu olduğunda, 1058-1069 bp'lik bir ürünü amplifiye edenSPathoREV ve DB_16SPathoFWD DB_16 primerlerle tek bir membran hazırlanabilir. Bu ürün daha sonra DB_Interprobe, DB_Saproprobe ve DB_16SPathoprobe ile ayrı ayrı, her birinden önce de-hibridizasyon adımı (adım 8) ile hibritlenebilir. Bu yaklaşım, aynı zardaki tüm dalların tanımlanmasına izin verir.

Saha su örneklerinde lipL32 prob protokolü uygulanmıştır. Her su örneğinin DNA'sı, PCR reaksiyonu başına 100 ng'lik bir konsantrasyonda kullanıldı. Ek olarak, 100 ng Leptospira genomik DNA'nın 15 mL'lik damıtılmış bir su örneğine dönüştürülmesinden oluşan bir DNA ekstraksiyon protokolü kontrolü dahil edildi. Negatif ve pozitif kontroller de dahil edildi (Şekil 10).

Tablo 4: Su numunelerinin tanımı ve derinliği. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: Her su numunesinin nokta-leke analizi. (A) Saha su numunelerinin DB_lipL32REV ve DB_lipL32FWD primerlerinin DB_lipL32probe ve (262 bp) ürününün membran dağılımı ve (B) nokta-lekesi. Gölet 3'ün yüzeyi pozitif bir sonuç gösterir ve hem ekstraksiyon protokolü kontrolü hem de pozitif kontroller yoğun bir sinyale sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Su numunesi açıklaması Tablo 4'te gösterilmiştir ve nokta-leke membran dağılımı ve görüntüsü Şekil 9'da gösterilmiştir. A7 noktası, Leptospiral DNA'nın gölet 3'ün yüzeyinde bulunduğunu göstermektedir. Gölet 3'te bulunan DNA konsantrasyonunu belirlemek için, Leptospira serovarları ve lipL32 probu karışımının bilinen DNA konsantrasyonları ile bir nokta-leke testi yapıldı (Şekil 11). Zar, her noktada 100 ng'den 1 x 10-13 ng'ye dağıtılan genomik DNA ile hazırlandı. Kuşkusuz tespit edilebilen minimum konsantrasyon, su örneklerinde 6 x 105 GEq'ye karşılık gelen yaklaşık 0,3 ng idi.

Figure 11
Şekil 11: Leptospira serovarları ve lipL32 probunun bir karışımının bilinen DNA konsantrasyonları ile nokta-blot testi. (A) DB_lipL32probe membran dağılımı ve (B) patojenik Leptospira serovarlarının genomik DNA karışımının dilüsyonları (1: 2) ile DB_lipL32REV ve DB_lipL32FWD primerlerin ürünü (262 bp). Probun sinyali, 3.91 x 10-1 ng Leptospira DNA karışımına kadar kolayca tespit edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Elektroforetik ayırma ile görselleştirilen PCR amplifikasyon ürünleri. Şerit 1. Moleküler ağırlık işaretleyici 100 bp DNA Merdiveni. Şerit 2. Şablon olarak patojenik Leptospira DNA karışımı ile lipL32 genine dayalı PCR; Şerit 3. Şablon olarak patojenik Leptospira DNA karışımı ile lipL41 genine dayalı PCR; Şerit 4. Şablon olarak patojenik Leptospira DNA karışımı ile 16S rRNA genine dayalı PCR; Şerit 5. DB_16SSapREV ve DB_16 S SapFWD primerleri olan 16S rRNA genine dayalı PCR veşablon olarak Leptospira biflexa serovar Patoc suşu Patoc I DNA'sı; Şerit 6. Primerler DB_16SPathoREV ve DB_16SPathoFWD ile 16S rRNA genine dayalı PCR ve şablon olarak Leptospira biflexa serovar Patoc suşu Patoc I DNA'sı; Şerit 7. Şablon olarak SInterREV ve DB_16SInterFWD primerleri DB_16 16S rRNA genine ve şablon olarak Leptospira fainei, serovar Hurstbridge suşu BUT6 DNA'sına dayalı PCR; Şerit 8. Şablon olarak S PathoREVve DB_16 S PathoFWD DB_16 primerleri olan 16SrRNA genine ve Leptospira fainei, serovar Hurstbridge suşu BUT6 DNA'sına dayalı PCR. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: (A) Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I'nin genomik DNA'sınınS PathoREVve DB_16SPathoFWD DB_16 primerlerin DB_Saproprobe ve ürününün (1059 bp) membran dağılımı ve (B) nokta-lekesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: (A) Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I'in genomik DNA'DB_16 sınınSSapREV ve DB_16SSapFWD primerlerinin (517 bp) ürünü (517 bp) ile DB_Saproprobe membran dağılımı ve (B) nokta-lekesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: (A)SPathoREV ve DB_16 S PathoFWD primerlerinin (1059 bp) ürünü (1059 bp) ve Leptospira fainei serovar Hurstbridge suşu BUT6'nın genomik DNA DB_16'sı ile DB_Interprobe membran dağılımı ve (B) nokta-lekesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: (A) Leptospira fainei serovar Hurstbridge suşu BUT6'nın genomik DNA'sı ileSInterREV ve DB_16SInterFWD primerlerinin DB_16 DB_Interprobe ve ürününün (299-301 bp) membran dağılımı ve B) nokta-lekesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: (A) DB_16SPathoprobe'un membran dağılımı ve (B) nokta-lekesi ve patojenik Leptospira serovarlarının genomik DNA karışımı ile DB_16SPathoREV ve DB_16SPathoFWD primerlerinin ürünü (1059 bp). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: (A) Patojenik Leptospira serovarlarının genomik DNA karışımı ile DB_lipL41REV ve DB_lipL41FWD primerlerin ürünü (479 bp) ile DB_lipL41probe membran dağılımı ve (B) nokta-lekesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Saprofit Leptospira türlerinin, 16S ribozomal RNA dizisine dayalı primerler ve prob ile hizalanması. Primerler, yönleri siyah oklarla gösterilecek şekilde, kimlikleri için kalın ve siyah renkle vurgulanır. Prob kalın olarak gösterilir ve gri renkle vurgulanır ve konumu gri bir çizgi ile işaretlenir. Hizalanmış diziler açık gri renkle vurgulanırken, karşılık gelmeyen diziler siyah beyaz renktedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Ara Leptospira türlerinin, 16S ribozomal RNA dizisine dayalı primerler ve prob ile hizalanması. Primerler, yönleri siyah oklarla gösterilecek şekilde, kimlikleri için kalın ve siyah renkle vurgulanır. Prob kalın olarak gösterilir ve gri renkle vurgulanır ve konumu gri bir çizgi ile işaretlenir. Hizalanmış diziler açık gri renkteyken, karşılık gelmeyen diziler siyah beyaz olarak gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Patojenik Leptospira türlerinin, lipL32 gen dizisine dayalı primerler ve prob ile hizalanması. Primerler, yönleri siyah oklarla gösterilecek şekilde, kimlikleri için kalın ve siyah renkle vurgulanır. Prob kalın olarak gösterilir ve gri renkle vurgulanır ve konumu gri bir çizgi ile işaretlenir. Hizalanmış diziler açık gri renkteyken, karşılık gelmeyen diziler siyah beyaz olarak gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Patojenik Leptospira türlerinin, lipL41 gen dizisine dayalı primerler ve prob ile hizalanması. Tanımlamaları için, astarlar kalın ve siyahla vurgulanmıştır ve yönleri siyah oklarla belirtilmiştir. Prob kalın olarak gösterilir ve koyu gri renkle vurgulanır ve konumu gri bir çizgi ile işaretlenir. Hizalanmış diziler açık gri renkteyken, karşılık gelmeyen diziler siyah beyazdır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: Leptospira türlerinin 16S ribozomal RNA dizisini hedefleyen primerler ve saprofit, ara ve patojenik türler için problar ile hizalanması. Tanımlamaları için, astarlar kalın harflerle gösterilir ve yönleri siyah oklarla işaretlenerek siyahla vurgulanır. Problar kalın olarak gösterilir ve konumları gri çizgilerle temsil edilerek gri renkle vurgulanır. Hizalanmış diziler açık gri renktedir ve karşılık gelmeyen diziler beyaz ve siyah renktedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 6: Nokta-leke tahlili için tamponlar ve çözeltiler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nokta-blot tekniğinin kritik adımları şunları içerir: (1) DNA immobilizasyonu, (2) membran üzerindeki serbest bağlanma bölgelerinin homolog olmayan DNA ile bloke edilmesi, (3) tavlama koşulları altında prob ve hedef fragman arasındaki tamamlayıcılık, (4) hibritlenmemiş probun çıkarılması ve (5) raportör molekülün41 tespiti.

PCR-Dot-blot'un, tekniğin hibritleştirilmiş parçanın37 boyutu hakkında bilgi sağlamaması, ikinci veya üçüncü bir prob ile yeniden hibridizasyondan önce tek bir zarın de-hibridizasyonunu gerektirmesi ve nihai sonuç için önemli ölçüde zaman ve çaba gerektirmesi gibi belirli sınırlamaları vardır.

Bu teknik, diğer moleküler teknikler42,43 ve uygulamaları ile tutarlılık göstermiştir. Ters nokta-leke, nanoaltın nokta-leke21 ve nokta-ELISA42, Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 ve Mycobacterium tuberculosis48,49 gibi organizmalarda 16S rRNA 29,43'e dayalı olarak spesifik genlerin tespiti ve bitkinin DNA veya RNA'sının tespiti için kullanılmıştır Virüsler41. Bu teknikle tutarlı ve güvenilir bir şekilde ölçülebilen mikroorganizmanın en düşük konsantrasyonu olarak tanımlanan tespit limiti (LOD)50, H. pylori47 için 100 pg (5 x 104 bakteri), klinik örneklerde tek bir B. burgdorferi hücresine45 ve bir hücreden daha az olan bir fg'ye kadar değişmektedir. M. tuberculosis48,49.

Bu birleşik metodolojinin değerli bir yönü, tutarsız sonuçlara yol açabilecek iki numune koşulu nedeniyle yanlış negatif sonuçların üstesinden gelerek tespit limitini bir sıra uzatma yeteneğidir: (1) yetersiz DNA'ya sahip numuneler veya (2) pozitif numunelerin %100 tespitine izin veren numune kontaminasyonu 25,45,47,48,49. PCR-Dot-blot, agaroz jel elektroforezinde tespit edilebilenlerden daha düşük miktarlarda amplifiye edilmiş ürünleri tespit etme kapasitesine sahiptir ve iç içe geçmiş ve yarı iç içe PCR'de olduğu gibi ikinci amplifikasyon adımlarının bir sonucu olarak kontaminasyonu önler. Bu avantajlar, moleküler tekniklerle etkileşime girebilecek ilgisiz kaynaklardan daha geniş bir inhibitör ve DNA yelpazesi içerebilen düşük bakteri yükü içeren çevresel numunelerle çalışırken özellikle kritiktir.

Önceki çalışmalar, leptospirlerin, 5 pg (5 x 103 leptospires) bir LOD'ye ulaşan fotobiyotin ile etiketlenmiş DNA probları ile tanımlanabileceğini düşündürmektedir51. DIG etiketli problar 0.1-1 pg (10 2 leptospires) tespit ederken, 32P etiketli prob 1-5 pg (750 ila1000 leptospires)51 ve biotin etiketli problar 5 pg (2500 leptospires) algılar52. Ayrıca, saprofit Leptospira için 32P etiketli prob, 1.95 ng'lik bir LOD'ye ve patojenik Leptospira için 3.9 ng53'e ulaştı. Bu çalışmada, üç sınıf için benzer LOD'ler kurulmuştur. Patojenik türler için LOD yaklaşık 0.3 ng genomik DNA (6-8 x 104 GEq) idi (Şekil 11) ve saprofit ve ara türler için 0.1 ng'ye (2 x 104 GEq) düştü. Özellikle, önceki araştırmalar, patojenik Leptospira 54,55'i tespit etmeyi ve Leptospira 56'nın tanımlanması ve sınıflandırılması için bir araç olarak etiketlenmiş 32P ile DNA hibridizasyonunu uygulamayı amaçlayan, deneysel olarak enfekte olmuş altın hamsterlerden elde edilen saf Leptospirakültürleri 51 ve serumlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir . Bu problar yüksek özgüllük sergiler ve diğer mikroorganizmalardanhomolog olmayan DNA ile çapraz hibridizasyon göstermez 19,51,54,55,56,57 ve Leptonema57 gibi yakından ilişkili türler arasında bile ayrım yapabilir. Aynı şekilde, bu çalışmada, homolog olmayan DNA ile herhangi bir hibridizasyon gözlenmemiştir. İzotopik olmayan problar, izotopik problar58 veya diğer teknikler43 kadar hassas olmasa da, Leishmania ve sığır herpes virüsü 4'ün (BHV4) tespitinde görüldüğü gibi, PCR-Dot-blot kombinasyonunun diğer PCR tabanlı tekniklere kıyasla duyarlılıkta on kata kadar artışa izin vermesi beklenebilir24,26.

Öte yandan, Leptospira tanımlaması için nokta-leke testi, idrar örneklerinde insan ve hayvanları teşhis etmek için bir alternatif olarak antikorlarla ve son zamanlarda monoklonal antikorlarla daha sık kullanılmaktadır 59,60,61,62. Bu çalışmalarda, numune önceden adımlar atılmadan doğrudan zar üzerine işlenir ve antikorlar patogenez ile ilişkili spesifik Leptospira yüzey proteinlerini hedef alır. Örneğin Mab-Dot-blot ELISA, 1 μg kadar az bakteri homojenat62 tespit ederek yüksek hassasiyet ve özgüllük gösterir. Mab-Dot-blot testinden elde edilen sonuçlar, tipik olarak yaklaşık 103 leptospires/ml idrar veya 9.3 ng Leptospira homojenat63 LOD'ye sahip PCR testleriyle karşılaştırılabilir. PCR ile amplifiye edilebilen genomik DNA miktarı 100 hücredir (500 fg DNA)61. Bu önceki çalışmalar, zenginleştirme prosedürleri olmadan saf kültürler veya klinik örnekler kullandı ve daha iyi tanıya yönelikti. Enfekte sıçanların 107 leptospir / mL idrar64 salgılayabildiği ve köpeklerin 102 ila 106 leptospir / mL idrar65 salgılayabildiği ve su kütleleri için kontaminasyon kaynağı olarak hizmet ettiği göz önüne alındığında, çevresel numuneler leptospiral zenginleştirme gerektirir. Lekelemeden önce hedeflenen DNA'nın in vitro PCR amplifikasyonu, prosedür hassasiyetinde on kata kadar bir iyileşme sağlar52,55. Genellikle, bir uç nokta PCR ile amplifiye edilen ürün, bir agaroz jel elektroforezinde görselleştirilmez; bununla birlikte, nokta-leke içindeki DIG etiketli probun spesifik hibridizasyonuyla belirginleşir.

Leptospira ve leptospirosis ile ilgili birçok araştırma hastalık teşhisine odaklanmış olsa da, su kütlelerindeki ekolojileri ve içlerindeki dağılımları hakkında çok az şey bilinmektedir. PCR-Dot-blot tekniği, Leptospira ve leptospirosis'i incelemek için araç kutusuna katkıda bulunur ve çok sayıda numuneyi tarama ve sonuçları ve yorumlamayı hızlandırma avantajı sunar. PCR-Dot-blot, tek bir zar üzerinde birden fazla probu barındırabilen nispeten düşük maliyetli, basit ve radyoaktif olmayan bir tekniktir. Ayrıca, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda zorlayıcı olabilen karmaşık ekipman ve karmaşık iş akışlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır.

Bu çalışmanın etkisi, farklı derinliklerdeki büyük su kütlelerinin yanı sıra toprak, durgun su, dışkı, kan ve dokular dahil olmak üzere diğer ekolojik nişler ve numune türlerini incelemek için gelecekteki uygulamasında yatmaktadır.

Sonuç olarak, bu çalışma, Leptospira cinsi içindeki üç dalın tanımlanması için DNA problarının digoksigenin etiketlemesine dayanan PCR-Dot-blot tekniğinin uygulanmasını göstermektedir. Bu yöntem, tanımlama sürecini tek bir amplifikasyon adımına indirgeyerek kolaylaştırır ve tek bir zar kullanarak üç eşzamanlı hibridizasyona veya üç ardışık hibridizasyona izin verir. Bu teknikle elde edilen tespit sınırları, radyoaktif problar53 ile elde edilenlere benzer, bu da onu doğal kaynaklardan alınan su örneklerinde Leptospira'yı tanımlamak için değerli bir araç haline getirir. Sonuç olarak, bu teknik daha fazla hassasiyet sunar ve minimum miktarda bakteri DNA'sı içeren numuneleri değerlendirirken doğru ve tutarlı sonuçlar sağlar. Su kütlelerinde Leptospira'nın dinamiklerini incelemek için alternatif bir yaklaşım olarak hizmet eder ve bu mikroorganizmanın bulaşmasına karşı önleyici tedbirlerin uygulanmasına yardımcı olarak daha geniş çevresel örneklerin değerlendirilmesine ve gözetimine yardımcı olabilir.

Teknikle ilgili zorluklar olması durumunda, aşağıdaki sorun giderme vurgularını göz önünde bulundurun: (1) Noktalar düzensiz şekillere sahipse, vakum sisteminin çapraz olarak güvenli bir şekilde kapatıldığını kontrol edin ve ardından aktarımı tekrarlayın. (2) Hibridizasyon tüpünün gece prosedürü sırasında kırılması ve zarın hibridizasyon tamponunu kaybetmesine neden olması durumunda, "De-hibridizasyon prosedürü" bölümüne bakın ve işlemi yeniden başlatın. (3) Nokta görünmüyorsa, zarı atmayın; Hibridizasyon adımlarını tekrarlamak için "De-hibridizasyon prosedürü" bölümüne ilerleyin. (3) Geliştirilen X-ışını filminde eşit olmayan beyaz alanlar fark edilirse, torba kapatma işlemi sırasında hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun. (5) Geliştirilen X-ışını filminde eşit olmayan siyah alanlar gözlenirse, CSPD'nin nemli parmaklar kullanılarak iyice dağıtıldığını onaylayın. (6) X-ışını filmi noktaların gölgelerini gösteriyorsa, pozlama süresi boyunca filmin hareket etmediğinden emin olun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi, Veterinerlik ve Zootekni Fakültesi, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nün Leptospira koleksiyonuna borçluyuz. Referans Leptospira suşlarının cömert bağışı için minnettarız; Leptospira fainei serovar Hurstbridge suşu BUT6 ve Leptospira biflexa serovar Patoc suşu Patoc I'den Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma'ya. CIBAC Koordinatörü Dr. José Antonio Ocampo Cervantes'e ve personele lojistik destekleri için teşekkür ederiz. EDT, Metropolitan Özerk Üniversitesi-Kampüsü Cuajimalpa'nın lisans öğrencileri için Terminal Projesi programı kapsamındaydı. Şekil 1 ve 3'ten 9'a kadar olan şekillerin oluşturulması için Biorender.com yazılımı kabul ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit Invitrogen K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) Promega M3001
Whatman filter paper, grade 1, Merk WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m Roche 11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody Roche 11093274910
Medium Base EMJH Difco S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH Difco BD 279510
Blocking Reagent Roche 11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate Merk 11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm Sigma Aldrich D3159
Developer Carestream Carestream Health Inc GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP Roche 11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) Promega H5032
Ficoll 400 Sigma Aldrich F8016
Fixer Carestream Carestream Health Inc GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa Sigma Aldrich L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa Sigma Aldrich L-9150 It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40) Sigma Aldrich PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) Sigma Aldrich 9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich 7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich 7558-79-4
Terminal transferase, recombinant Roche 3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl) Sigma-Aldrich 1185-53-1
SSPE 20X Sigma-Aldrich S2015-1L It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Probes Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer Thermo-Scientific ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm Sigma-Aldrich 1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl Gilson SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen 3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl Axygen T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl Axygen TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot BIORAD 1706545
Portable Hergom Suction Hergom 7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) Hoefer PH90-115V
UV Crosslinker Hoefer UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler Hybaid HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 Fuji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055 (2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387, 65-97 (2015).
  3. Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
  4. Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
  5. Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
  6. Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
  7. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898 (2015).
  8. Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843 (2015).
  9. Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
  10. Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
  11. Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
  12. Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
  13. Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
  14. Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
  15. Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051 (2015).
  16. Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721 (2022).
  17. Gillespie, R. W., Ryno, J. Epidemiology of leptospirosis. American Journal of Public Health and Nation’s Health. 53 (6), 950-955 (1963).
  18. Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
  19. Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
  20. Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
  21. Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
  22. Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  23. Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
  24. Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
  25. Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
  26. Pilatti, M. M., Ferreira, S. deA., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
  27. Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
  28. Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
  29. Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
  30. Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M. Leptospira taxonomy: then and now. Medycyna Weterynaryjna. 78 (10), 489-496 (2022).
  31. Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816 (2018).
  32. Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
  33. Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241 (2016).
  34. Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28 (2006).
  35. Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
  36. Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996 (2016).
  37. Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
  38. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  39. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607 (2008).
  40. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  41. Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , Springer Protocols Handbooks. Humana, NewYork, NY. 303-321 (2020).
  42. Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317 (2021).
  43. Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
  44. Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
  45. Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
  46. Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
  47. Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
  48. Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
  49. Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356 (2007).
  50. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  51. Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
  52. Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
  53. Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
  54. Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
  55. Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
  56. Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
  57. Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
  58. Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
  59. Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
  60. Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
  61. Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  62. Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250 (2017).
  63. Levett, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14 (2), 296-326 (2001).
  64. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
  65. Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 208 Leptospira Dot-blot PCR Digoxigenin
Su Örneklerinde <i>Leptospira</i> Tespiti için Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Nokta-Blot Hibridizasyonu,
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delgadillo-Tellez, E.,… More

Delgadillo-Tellez, E., Zavaleta-Villa, B., Atilano-López, D., Hernández-Castro, R., Olivo-Díaz, A., Carrillo-Casas, E. M. Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples. J. Vis. Exp. (208), e65435, doi:10.3791/65435 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter