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Biology

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन और पानी के नमूनों में लेप्टोस्पाइरा का पता लगाने के लिए डॉट-ब्लॉट हाइब्रिडाइजेशन

Published: June 14, 2024 doi: 10.3791/65435
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

Summary

इस अध्ययन में, पानी के नमूनों में तीन मुख्य समूहों से लेप्टोस्पाइरा का पता लगाने के लिए एक डॉट-ब्लॉट एप्लिकेशन डिज़ाइन किया गया था। यह विधि विशेष रूप से एक डिगॉक्सिजेनिन-लेबल जांच द्वारा लक्षित न्यूनतम डीएनए मात्रा की पहचान के लिए अनुमति देती है, आसानी से एक एंटी-डिगॉक्सिजेनिन एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है। यह दृष्टिकोण स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए एक मूल्यवान और संतोषजनक उपकरण है।

Abstract

डॉट-ब्लॉट एक सरल, तेज, संवेदनशील और बहुमुखी तकनीक है जो विशेष रूप से वाहक डीएनए की उपस्थिति में जांच संकरण द्वारा लक्षित डीएनए की न्यूनतम मात्रा की पहचान करने में सक्षम बनाती है। यह एक अक्रिय ठोस समर्थन पर डीएनए की एक ज्ञात मात्रा के हस्तांतरण पर आधारित है, जैसे कि नायलॉन झिल्ली, डॉट-ब्लॉट तंत्र का उपयोग करके और इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण के बिना। नायलॉन झिल्ली में उच्च न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता (400 μg / सेमी2), उच्च शक्ति का लाभ होता है, और सकारात्मक या तटस्थ रूप से चार्ज किया जाता है। उपयोग की जाने वाली जांच 18 से 20 आधारों का एक अत्यधिक विशिष्ट ssDNA टुकड़ा है जो लंबे समय तक digoxigenin (DIG) के साथ लेबल किया गया है। जांच लेप्टोस्पाइरा डीएनए के साथ संयुग्मित होगी। एक बार जब जांच लक्ष्य डीएनए के साथ संकरित हो जाती है, तो यह एक एंटी-डिगॉक्सिजेनिन एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है, जिससे एक्स-रे फिल्म में प्रकट इसके उत्सर्जन के माध्यम से इसका आसान पता लगाया जा सकता है। उत्सर्जन के साथ डॉट्स ब्याज के डीएनए टुकड़ों के अनुरूप होंगे। यह विधि जांच के गैर-आइसोटोपिक लेबलिंग को नियोजित करती है, जिसमें बहुत लंबा आधा जीवन हो सकता है। इस मानक इम्यूनो-लेबल का दोष आइसोटोपिक जांच की तुलना में कम संवेदनशीलता है। फिर भी, यह युग्मन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और डॉट-ब्लॉट परख द्वारा कम किया जाता है। यह दृष्टिकोण लक्ष्य अनुक्रम के संवर्धन और इसकी पहचान को सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, यह एक मात्रात्मक अनुप्रयोग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब एक प्रसिद्ध मानक के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के खिलाफ तुलना की जाती है। पानी के नमूनों में तीन मुख्य समूहों से लेप्टोस्पाइरा का पता लगाने के लिए एक डॉट-ब्लॉट एप्लिकेशन यहां प्रस्तुत किया गया है। लेप्टोस्पाइरल डीएनए की उपस्थिति का प्रमाण प्रदान करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा केंद्रित होने के बाद इस पद्धति को बड़ी मात्रा में पानी पर लागू किया जा सकता है। यह सामान्य स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए एक मूल्यवान और संतोषजनक उपकरण है, और इसका उपयोग अन्य गैर-संवर्धन योग्य बैक्टीरिया के लिए किया जा सकता है जो पानी में मौजूद हो सकते हैं, पारिस्थितिकी तंत्र की समझ को बढ़ाते हैं।

Introduction

मनुष्यों में लेप्टोस्पायरोसिस मुख्य रूप से पर्यावरणीय स्रोतों 1,2 से उत्पन्न होता है। झीलों, नदियों और धाराओं में लेप्टोस्पाइरा की उपस्थिति वन्यजीवों और घरेलू और उत्पादन जानवरों के बीच लेप्टोस्पायरोसिस संचरण का एक संकेतक है जो अंततः पानी के इन निकायों के संपर्क में आ सकता है 1,3,4. इसके अलावा, लेप्टोस्पाइरा को गैर-प्राकृतिक स्रोतों में पहचाना गया है, जिसमें सीवेज, स्थिर और नल का पानी 5,6 शामिल है।

लेप्टोस्पाइरा एक दुनिया भर में वितरित बैक्टीरिया 7,8 है, और इसके संरक्षण और संचरण में पर्यावरण की भूमिका अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त किया गया है. लेप्टोस्पाइरा चर पीएच और खनिजों9 के तहत पीने के पानी में जीवित रह सकता है, और पानी के प्राकृतिक निकायों में1. यह आसुत जल10 में भी लंबे समय तक जीवित रह सकता है, और निरंतर पीएच (7.8) के तहत, यह 152 दिनों तक जीवित रह सकताहै 11. इसके अलावा, लेप्टोस्पाइरा कठोर परिस्थितियों12,13 जीवित रहने के लिए बैक्टीरियल कंसोर्टियम में बातचीत कर सकते हैं. यह एज़ोस्पिरिलम और स्फिंगोमोनास के साथ मीठे पानी में बायोफिल्म का हिस्सा हो सकता है और यहां तक कि 49 डिग्री सेल्सियस14,15 से अधिक तापमान बढ़ने और स्थायी करने में सक्षम है। यह भी जलभराव वाली मिट्टी में गुणा कर सकते हैं और अप करने के लिए व्यवहार्य रह सकते हैं 379 दिनों16, के रूप में लंबे समय के रूप में एक वर्ष17,18 के लिए रोग पैदा करने की अपनी क्षमता को बनाए रखने. हालांकि, जल निकायों के भीतर पारिस्थितिकी के बारे में बहुत कम जानकारी है और यह उनके भीतर कैसे वितरित किया जाता है।

इसकी खोज के बाद से, जीनस लेप्टोस्पाइरा का अध्ययन सीरोलॉजिकल परीक्षणों पर आधारित था। यह वर्तमान शताब्दी तक नहीं था कि आणविक तकनीक इस स्पिरोचेट के अध्ययन में अधिक प्रचलित हो गई। डॉट धब्बा शायद ही (1) 16एस आरआरएनए पर आधारित एक समस्थानिक जांच और एक अंतर-सरल अनुक्रम दोहराने (आईएसएसआर)19,20 पर आधारित एक समस्थानिक जांच का उपयोग करके इसकी पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है, (2) मानव लेप्टोस्पायरोसिस के लिए नैनोगोल्ड आधारित इम्यूनोसे के रूप में मूत्र21 पर लागू होता है, या (3) गोजातीय मूत्र नमूनों के लिए एंटीबॉडी आधारित परख के रूप में22. तकनीक अनुपयोगी हो गई क्योंकि यह मूल रूप से आइसोटोपिक जांच पर आधारित थी। हालांकि, यह एक प्रसिद्ध तकनीक है, जो पीसीआर के साथ मिलकर, बेहतर परिणाम देती है, और इसे गैर-आइसोटोपिक जांच के उपयोग के कारण सुरक्षित माना जाता है। पीसीआर एक विशिष्ट डीएनए टुकड़े को बढ़ाकर लेप्टोस्पाइरा डीएनए के संवर्धन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो एक नमूने में ट्रेस मात्रा में पाया जा सकता है। प्रत्येक पीसीआर चक्र के दौरान, लक्षित डीएनए टुकड़े की मात्रा प्रतिक्रिया में दोगुनी हो जाती है। प्रतिक्रिया के अंत में, amplicon अधिक से अधिकएक लाख 23 के एक कारक से गुणा किया गया है. पीसीआर द्वारा प्रवर्धित उत्पाद, अक्सर अगारोज वैद्युतकणसंचलन में दिखाई नहीं देता है, डॉट-ब्लॉट 24,25,26में डीआईजी-लेबल जांच के साथ विशिष्ट संकरण के माध्यम से दिखाई देता है।

डॉट-ब्लॉट तकनीक सरल, मजबूत और कई नमूनों के लिए उपयुक्त है, जिससे यह सीमित संसाधनों वाली प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ हो जाती है। यह (1) मौखिक बैक्टीरिया27, (2) इस तरह के भोजन और मल28 के रूप में अन्य नमूना प्रकार, और (3) unculturable बैक्टीरिया29 की पहचान सहित बैक्टीरिया के अध्ययन की एक किस्म में कार्यरत किया गया है, अक्सर अन्य आणविक तकनीकों के साथ समझौते में. डॉट-ब्लॉट तकनीक द्वारा दिए जाने वाले लाभों में से हैं: (1) झिल्ली में एक उच्च बाध्यकारी क्षमता होती है, जो न्यूक्लिक एसिड के 200 μg/cm2 से अधिक और 400 μg/cm2 तक बांधने में सक्षम होती है; (2) डॉट-ब्लॉट परिणामों को विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना नेत्रहीन व्याख्या की जा सकती है, और (3) उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर वर्षों तक आसानी से संग्रहीत किया जा सकता है।

जीनस लेप्टोस्पाइरा रोगजनक, मध्यवर्ती, और सैप्रोफाइटिक समूहों30,31 में वर्गीकृत किया गया है. इन समूहों के बीच भेद विशिष्ट जीनों जैसे lipL41, lipL32 और 16S rRNA के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है। LipL32 रोगजनक समूहों में मौजूद है और विभिन्न सीरोलॉजिकल और आणविक उपकरणों में उच्च संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है, जबकि यह सैप्रोफाइट प्रजातियों21 में अनुपस्थित है। हाउसकीपिंग जीन लिपएल 41 अपनी स्थिर अभिव्यक्ति के लिए जाना जाता है और आणविक तकनीकों32 में उपयोग किया जाता है, जबकि 16एस आरआरएनए जीन का उपयोग उनके वर्गीकरण के लिए किया जाता है।

इस पद्धति को पानी की बड़ी मात्रा में लागू किया जा सकता है जब वे सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा केंद्रित हो जाते हैं। यह लेप्टोस्पाइरल डीएनए की उपस्थिति और उस क्लैड का पता लगाने के लिए एक जल निकाय के भीतर विभिन्न बिंदुओं और गहराई के आकलन की अनुमति देता है जिससे यह संबंधित है। यह उपकरण पारिस्थितिक और सामान्य स्क्रीनिंग उद्देश्यों दोनों के लिए मूल्यवान है और इसे पानी में मौजूद अन्य गैर-संवर्धन योग्य बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए भी नियोजित किया जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, पीसीआर और डॉट-ब्लॉट परख प्रयोगशालाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए तकनीकी और आर्थिक रूप से सस्ती हैं, यहां तक कि परिष्कृत या महंगे उपकरणों की कमी वाले भी। इस अध्ययन का उद्देश्य पानी के प्राकृतिक निकायों से एकत्र किए गए पानी के नमूनों में तीन लेप्टोस्पाइरा समूहों की पहचान के लिए डिगोक्सिजेनिन-आधारित डॉट-ब्लॉट को लागू करना है।

बैक्टीरियल उपभेदों
बारह लेप्टोस्पाइरा सेरोवर (शरद ऋतु, बटाविया, ब्रातिस्लावा, कैनिकोला, सेलेडोनी, ग्रिपोथायफोसा, हार्डजोप्राजिटनो, इक्टेरोहेमोरेजिया, पोमोना, पाइरोजेन, तारासोवी और वोल्फी) को इस अध्ययन में शामिल किया गया था। ये सेरोवर माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग, पशु चिकित्सा और ज़ूटेक्निक्स संकाय, मेक्सिको के राष्ट्रीय स्वायत्त विश्वविद्यालय में संग्रह का हिस्सा हैं, और वर्तमान में इनका उपयोग माइक्रोग्लूटिनेशन टेस्ट (एमएटी) में किया जाता है।

सभी लेप्टोस्पाइरा सेरोवर ईएमजेएच में सुसंस्कृत थे, और उनके डीएनए को एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके निकाला गया था। बारह सेरोवर्स के एक जीनोमिक डीएनए मिश्रण का उपयोग लेप्टोस्पाइरा रोगजनक क्लैड के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। लेप्टोस्पाइरा मध्यवर्ती क्लैड के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, लेप्टोस्पाइरा फेनी सेरोवर हर्स्टब्रिज स्ट्रेन BUT6 से जीनोमिक डीएनए को शामिल किया गया था, और लेप्टोस्पाइरा सैप्रोफाइट क्लेड के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, लेप्टोस्पाइरा बिफ्लेक्सा सेरोवर पटोक स्ट्रेन पैटोक I के जीनोमिक डीएनए को भी शामिल किया गया था।

नकारात्मक नियंत्रणों में एक खाली प्लाज्मिड, गैर-संबंधित बैक्टीरिया (यूरियाप्लाज्मा यूरियालिटिकम, स्टैफिलोकोकस ऑरियस, ब्रुसेला एबोर्टस, साल्मोनेला टाइफिमुरियम, शिगेला बॉयडी, क्लेबसिएला निमोनिया, एसिनेटोबैक्टर बाउमानी और एस्चेरिचिया कोलाई) से डीएनए और पीसीआर-ग्रेड पानी शामिल थे, जो गैर-टेम्पलेट नियंत्रण के रूप में कार्य करते थे।

पानी के नमूने
बारह परीक्षण हड़पने के नमूने Cuemanco जैविक और जलीय कृषि अनुसंधान केंद्र (CIBAC) (19 ° 16 ' 54 "N 99 ° 6' 11" W) से एक स्तरीकृत-बेतरतीब नमूना विधि का उपयोग करके एकत्र किए गए थे। ये नमूने तीन गहराई पर प्राप्त किए गए थे: सतही, 10, और 30 सेमी (चित्रा 1 ए, बी)। जल संग्रह प्रक्रियाओं ने किसी भी लुप्तप्राय या संरक्षित प्रजातियों को प्रभावित नहीं किया। प्रत्येक नमूना एक बाँझ 15 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र किया गया था। नमूना एकत्र करने के लिए, प्रत्येक ट्यूब धीरे से पानी में डूबा हुआ था, चयनित गहराई पर भरा हुआ था, और फिर सील कर दिया गया था। नमूने 22 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था और तुरंत प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में ले जाया गया.

प्रत्येक नमूना कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 8000 x ग्राम पर बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा केंद्रित किया गया था। यह कदम तब तक दोहराया गया जब तक कि सभी नमूने एक ट्यूब में केंद्रित नहीं हो गए, जिसका उपयोग डीएनए निष्कर्षण(चित्रा 1सी)के लिए किया गया था।

Figure 1
चित्र 1: सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पानी के नमूनों की एकाग्रता। (ए) पानी का नमूना तालाब, और (बी) प्राकृतिक धाराएं। (सी) सेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित पानी का नमूना प्रसंस्करण बार-बार चरणों में जितनी बार आवश्यक हो (एन)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डीएनए निष्कर्षण
निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक जीनोमिक डीएनए किट का उपयोग करके कुल डीएनए को अलग किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)। डीएनए निष्कर्षण क्षालन बफर के 20 माइक्रोन में eluted थे, और डीएनए एकाग्रता 260-280 एनएम पर एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा निर्धारित किया गया था, और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.

पीसीआर प्रवर्धन
पीसीआर लक्ष्य 16एस आरआरएनए, लिपएल 41, और लिपएल 32 जीन थे, जो जीनस लेप्टोस्पाइरा से डीएनए की पहचान करते हैं और तीन समूहों के बीच अंतर की अनुमति देते हैं: रोगजनक, सैप्रोफाइटिक और मध्यवर्ती। दोनों प्राइमर और जांच डिजाइन अहमद एट अल, अज़ाली एट अल, बोर्ही एट अल, वीस एट अल, और ब्रैंजर एट अल.33,34,35,36,37 द्वारा पिछले कार्यों पर आधारित थे। प्रत्येक जांच, प्राइमर, और प्रवर्धित टुकड़ा के अनुक्रम तालिका 1 में वर्णित हैं, और संदर्भ दृश्यों के साथ उनके संरेखण पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2, पूरक फ़ाइल 3, पूरक फ़ाइल 4, और पूरक फ़ाइल 5 में प्रदान किए जाते हैं। पीसीआर अभिकर्मकों और thermocycling शर्तों प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित हैं.

प्रवर्धन उत्पादों को टीएई (40 एमएम ट्रिस बेस, 20 एमएम एसिटिक एसिड, और 1 एमएम ईडीटीए; पीएच 8.3) में 1% अगारोज जेल पर इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण द्वारा कल्पना की गई थी, एथिडियम-ब्रोमाइड डिटेक्शन के साथ 45 मिन के लिए 60 वी पर, जैसा कि पूरक चित्रा 1में दिखाया गया है। प्रत्येक सेरोवर से प्राप्त जीनोमिक डीएनए का उपयोग प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में 6 x 106 से 1 x 104 जीनोमिक समकक्ष प्रतियों (GEq) तक की सांद्रता के साथ किया गया था, जो L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 रोगजनक लेप्टोस्पाइरा के लिए जीनोम आकार के आधार पर, L. biflexa का जीनोम आकार (3, 956, 088 bp)39 सैप्रोफाइटिक लेप्टोस्पाइरा के लिए, और L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 (4, 267, 324 bp) का जीनोम आकार परिग्रहण संख्या AKWZ00000000.2 के साथ।

जांच की संवेदनशीलता प्रत्येक रोगजनक सेरोवर से डीएनए के साथ मूल्यांकन किया गया था, L. biflexa serovar Patoc तनाव Patoc मैं, और L. fainei सेरोवर हर्स्टब्रिज तनाव BUT6 प्रत्येक प्रयोग में. पीसीआर और डॉट-ब्लॉट संकरण परख की विशिष्टता का आकलन करने के लिए, गैर-संबंधित बैक्टीरिया से डीएनए शामिल किया गया था।

तालिका 1: पीसीआर प्राइमरों और जांच लेप्टोस्पाइरा के रोगजनक, सैप्रोफाइट और मध्यवर्ती समूहों की पहचान करने के लिए उत्पादों को बढ़ाने के लिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डॉट-धब्बा संकरण परख
तकनीक को डॉट-ब्लॉट कहा जाता है क्योंकि जिन छिद्रों में डीएनए नमूना रखा जाता है, उनमें डॉट आकार होता है, और जब उन्हें वैक्यूम सक्शन द्वारा जगह में तय करने के लिए चूसा जाता है, तो वे इस आकार को प्राप्त करते हैं। इस तकनीक Kafatos एट al.40 द्वारा विकसित किया गया था. तकनीक प्रत्येक पीसीआर-पॉजिटिव नमूने में लेप्टोस्पाइरा के अर्ध-परिमाणीकरण की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल कमरे के तापमान पर NaOH 0.4 एम के साथ एक विकृतीकरण के होते हैं, लेप्टोस्पाइरा डीएनए के साथ नमूने 30 एनजी से 0.05 एनजी, 6 x 106 से 1 x 104 लेप्टोस्पायर के अनुरूप, 96-अच्छी तरह से डॉट-ब्लॉट तंत्र के साथ एक नायलॉन झिल्ली पर धब्बा लगाया जाता है। स्थिरीकरण के बाद, डीएनए 120 एमजे यूवी प्रकाश के संपर्क में झिल्ली से बंधा होता है। प्रत्येक डीएनए जांच 3 'अंत में एक टर्मिनल ट्रांसफरेज़ उत्प्रेरण कदम द्वारा digoxigenin-11 dUTP के साथ संयुग्मित है (Digoxigenin एक संयंत्र स्टेरॉयड Digitalis purpurea से प्राप्त है, एक रिपोर्टर41 के रूप में इस्तेमाल किया). लक्ष्य डीएनए पर विशिष्ट तापमान पर लेबल डीएनए जांच (50 पीएमओएल) के कड़े संकरण के बाद, डीएनए संकरों को एंटी-डिगोक्सिजेनिन क्षारीय फॉस्फेट एंटीबॉडी के साथ केमिलुमिनेसेंस प्रतिक्रिया द्वारा कल्पना की जाती है जो इसके सब्सट्रेट सीएसपीडी के साथ सहसंयोजक रूप से संयुग्मित होती है। ल्यूमिनेसेंस को एक्स-रे फिल्म(चित्रा 2)के संपर्क में आकर कब्जा कर लिया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: पीसीआर-डॉट-धब्बा परख के लिए प्रक्रिया के चरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. नमूना तैयार करना

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 8,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में प्रत्येक पानी के नमूने को केंद्रित करें। इस चरण को दोहराएं, जितनी बार आवश्यक हो, नमूना को 250 माइक्रोन की मात्रा में केंद्रित करने के लिए।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. डॉट-ब्लॉट जांच के अनुसार विशिष्ट पीसीआर करें जिसका उपयोग किया जाएगा (तालिका 1)।
    1. 1 एक्स बफर युक्त 25 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के साथ पीसीआर ट्यूबों में प्रवर्धन प्रदर्शन, टाक पोलीमरेज़ की 2.5 इकाइयां, प्रत्येक प्राइमर के 1 माइक्रोन, प्रत्येक डीएनटीपी के 0.2 एमएम, 1.5 एमएम एमजीसीएल2, और प्रत्येक पानी के नमूने या संदर्भ जीनोमिक-डीएनए से लक्ष्य डीएनए के 100 एनजी।
    2. थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों (तालिका 2) के अनुसार थर्मोसाइक्लर में पीसीआर प्रतिक्रिया को प्रोग्राम करें।
    3. उपयोग होने तक प्रतिक्रियाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 10 माइक्रोन को 96-अच्छी तरह से प्लेट के एक अलग कुएं में धब्बा दिया जाना चाहिए।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से टीई के 40 माइक्रोन जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिश्रण करें।
    नोट: 96-अच्छी तरह से प्लेट को सील किया जा सकता है और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के लिए बफ़र्स और समाधान तैयार करने के लिए पूरक फ़ाइल 6 में दिए गए निर्देशों का पालन करें। चित्रा 3 नमूना तैयार करने के चरणों को दर्शाता है।

तालिका 2: 16एस, लिपएल 41, और लिपएल 32 जीन के लिए पीसीआर थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पीसीआर और नमूना तैयार करना। विशिष्ट पीसीआर प्रोटोकॉल को लागू करते हुए, पीसीआर उत्पाद को माइक्रोटिटर प्लेट में स्थानांतरित किया गया था, और टीई के 40 माइक्रोन को प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. डॉट-ब्लॉट उपकरण को असेंबल करना

नोट: डॉट-ब्लॉट तंत्र का संयोजन चित्र 4में दिखाया गया है। प्रक्रिया के दौरान, क्षार समाधान को संभालने और नायलॉन झिल्ली को संदूषण से बचाने के लिए दस्ताने पहनें।

Figure 4
चित्रा 4: डॉट-ब्लॉट उपकरण कोडांतरण। फिल्टर पेपर और नायलॉन झिल्ली (पहले 10 एक्स एसएसपीई में सिक्त) को सही क्रम में व्यवस्थित किया जाना चाहिए। वैक्यूम लगाने से पहले असेंबली को शिकंजा के साथ कसकर सुरक्षित किया जाना चाहिए। प्रत्येक कुएं को टीई से धोया जाना चाहिए, और पीसीआर उत्पादों को उनके संबंधित कुओं में लोड किया जाता है। झिल्ली के माध्यम से पीसीआर उत्पाद को स्थानांतरित करने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से टीई के साथ फिर से धोया जाता है और सूखने की अनुमति दी जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. नायलॉन झिल्ली को काटें ( सामग्री की तालिकादेखें) और फिल्टर पेपर को 12 x 8.5 सेमी आकार की चादरों में फ़िल्टर करें।
  2. एक स्थायी मार्कर के साथ झिल्ली को चिह्नित करें।
  3. सही अभिविन्यास को इंगित करने के लिए एक किनारे पर कैंची के साथ एक पायदान बनाएं। नमूना क्रम को याद रखने के लिए चिह्न का उपयोग करें।
  4. 10 एक्स खारा-सोडियम फॉस्फेट-ईडीटीए बफर (एसएसपीई; 3 एम एनएसीएल, 0.2 एम एनएएच2पीओ4, और 0.02 एम ईडीटीए, पीएच 7.4) (पूरक फ़ाइल 6) के साथ झिल्ली और फिल्टर पेपर को गीला करें। एक साफ, कुंद समाप्त चिमटी के साथ झिल्ली को संभालें।
  5. डॉट-ब्लॉट चैंबर को इकट्ठा करें; सबसे पहले, फिल्टर पेपर, उसके बाद प्लास्टिक सील पर झिल्ली। शिकंजा के साथ कवर को क्रॉसवर्ड तरीके से सुरक्षित करें।
  6. कक्ष को वैक्यूम से कनेक्ट करें, प्रत्येक कुएं में टीई के 100 माइक्रोन रखें, 1 मिनट के लिए वैक्यूम पकड़ें, और फिर इसे रोकें।
  7. कम गति पर वैक्यूम पर स्विच करें और प्रत्येक नमूने के 50 माइक्रोन को डॉट-ब्लॉट तंत्र की झिल्ली पर संबंधित कुएं में लोड करें (पूर्व-निर्धारित झिल्ली वितरण के बाद)।
    नोट: डॉट-ब्लॉट कक्ष में रखने से पहले हेमग्लगुटिनेशन 96 अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक नमूने को समरूप करें।
  8. वैक्यूम झिल्ली सूखी करने के लिए अनुमति दें. यदि आवश्यक हो, धीरे नमूना में बुलबुले जारी करने के लिए कक्ष मारा.
  9. एक निरंतर वैक्यूम के साथ इसमें TE के 100 माइक्रोन रखकर और इसे सूखने की अनुमति देकर प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें।
    नोट: स्थानांतरण पूरा करने के बाद, पहले पंप को बंद करना और इसे अलग करना महत्वपूर्ण है। ऐसा करने में विफलता के परिणामस्वरूप उपकरण में भाटा प्रवेश कर सकता है। डीएनए एक विकृतीकरण कदम की जरूरत नहीं है अगर एक सकारात्मक चार्ज नायलॉन झिल्ली का उपयोग किया जाता है, लेकिन अगर अन्य निष्क्रिय समर्थन का उपयोग, एक पूर्व विकृतीकरण कदम और क्षार आधारित विकृतीकरण41 की जरूरत हो सकती है.

3. डीएनए विकृतीकरण और निर्धारण

नोट: चित्रा 5 डीएनए झिल्ली निर्धारण प्रक्रिया को दिखाता है।

Figure 5
चित्रा 5: डीएनए-झिल्ली निर्धारण प्रक्रिया। डीएनए को एक क्षारीय घोल में विकृत किया जाता है। अगला, इसे 10 एक्स एसएसपीई के साथ बेअसर किया जाता है, और झिल्ली सूख जाती है। अगला, झिल्ली transilluminated है. झिल्ली को 2 एक्स एसएसपीई के साथ पुनर्जलीकरण किया जाता है और रात भर पूर्व-संकरित किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.4 एम NaOH के साथ झिल्ली सेते हैं.
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 10 एक्स एसएसपीई के साथ झिल्ली को संतुलित करें।
  3. 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली सूखी.
  4. 3 मिनट के लिए 120 एमजे यूवी प्रकाश के साथ ट्रांसल्यूमिनेट। सुनिश्चित करें कि नमूने यूवी प्रकाश स्रोत की ओर नीचे की ओर उन्मुख हैं। यदि यूवी-क्रॉसलिंकर का उपयोग कर रहे हैं, तो पुष्टि करें कि नमूने ऊपर की ओर हैं और इस चरण को दो बार दोहराएं।
    नोट: यूवी क्रॉसलिंकिंग से पहले झिल्ली पूरी तरह से सूखी होनी चाहिए। डीएनए को नायलॉन झिल्ली के लिए एक सहसंयोजक बंधन द्वारा स्थिर किया जाएगा। प्रत्येक क्रॉस-लिंकिंग एक इष्टतम यूवी विकिरण खुराक के साथ लगभग 18 '' से 1 'लेता है, अधिकांश संकरण प्रयोगों के लिए, लगभग 0.6-0.8 केजे / एम2।
    यूवी विकिरण के संपर्क में आना आंखों और त्वचा के लिए हानिकारक है। उपयुक्त सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और नंगे त्वचा के संपर्क में आने से बचें।
  5. 10 मिनट के लिए 2 एक्स एसएसपीई के साथ झिल्ली धो लें।
  6. झिल्ली को सावधानी से मोड़ो और इसे संकरण ट्यूब में डालें (15 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करें)।
  7. ट्यूब में पूर्व-संकरण समाधान (पूरक फ़ाइल 6) के 10 एमएल जोड़ें और रात भर 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि किसी भी रिसाव को रोकने के लिए ट्यूब को ठीक से सील कर दिया गया है।

4. संकरण

  1. संकरण ट्यूब से पूर्व संकरण समाधान के 5 एमएल निकालें। दूसरी बार 5 एमएल का उपयोग करने के लिए, इसे दूसरी ट्यूब में रखें और इसे -4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. संकरण ट्यूब में लेबल जांच (तालिका 1) के 15 माइक्रोन जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए समाधान में टिप कुल्ला कि लेबल जांच अच्छी तरह से कमजोर पड़ने में डाला गया था।
    नोट: डीएनए जांच का बंधन एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग जितना मजबूत नहीं है। इसलिए, नमूने में जांच या डीएनए की एकाग्रता में परिवर्तन उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं। डीएनए जांच स्टोइकोमेट्रिक हैं, जिसका अर्थ है कि डीएनए से बंधे जांच अणुओं की संख्या समाधान में मौजूद डीएनए अणुओं की संख्या के बराबर है। चित्रा 6 जांच संकरण को दर्शाता है।
  3. रात भर 42 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. डीएनए जांच डीआईजी लेबलिंग करें। अभिकर्मकों को मिश्रण करने के लिए तालिका 3 में निर्दिष्ट निर्देशों का पालन करें, फिर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें। अगला, आसुत जल के 80 माइक्रोन जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर पूंछ जांच की दुकान.

Figure 6
चित्रा 6: जांच संकरण। संकरण बफर की मात्रा समायोजित किया जाता है, और डिगोक्सिजेनिन-लेबल जांच को रात भर जांच के संकरण की अनुमति देने के लिए शामिल किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: डिगॉक्सिजेनिन (डीआईजी) के साथ लेबलिंग जांच के लिए अभिकर्मक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. केमिलुमिनेसेंस (एंटी-डीआईजी टैगिंग)

  1. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2 एक्स एसएसपीई/0.1% एसडीएस के साथ झिल्ली को दो बार धोएं।
  2. 15 मिनट के लिए जांच के annealing तापमान पर 5 एक्स एसएसपीई/0.1% एसडीएस के साथ झिल्ली सेते हैं.
    नोट: इस चरण में, तापमान को यथासंभव लंबे समय तक बनाए रखने के लिए ढक्कन वाले कंटेनर का उपयोग करें। झिल्ली भर में एक समान और निरंतर तापमान सुनिश्चित करें। प्रत्येक धोने में अनुमानित मात्रा संकेत समाधान के 100 एमएल है।
  3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बफर 1 (पूरक फ़ाइल 6) के साथ एक बार झिल्ली धो लें.
  4. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बफर 2 (पूरक फ़ाइल 6) के साथ एक बार झिल्ली धो लें.
  5. बफर 2 के साथ झिल्ली धो लें और एंटी-डिगोक्सिजेनिन एंटीबॉडी (15 माइक्रोन) ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें, फिर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (इनक्यूबेशन समय 30-60 मिनट से भिन्न हो सकता है)। यह द्वितीयक एंटीबॉडी पता लगाने के लिए जांच को टैग करता है।
    नोट: झिल्ली को बफर 2 में एंटी-डिगोक्सिजेनिन एंटीबॉडी के साथ रात भर 4-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। केमिलुमिनेसेंस प्रक्रिया के एंटी-डीआईजी टैगिंग को चित्र 7में दर्शाया गया है।

Figure 7
चित्रा 7: केमिलुमिनेसेंस प्रक्रिया के एंटी-डीआईजी टैगिंग। अबंधित न्यूक्लिक एसिड को बफर समाधान के साथ हटा दिया जाता है। जांच लक्ष्य डीएनए के साथ गठबंधन है, और अतिरिक्त हटा दिया जाता है. झिल्ली अवरुद्ध 1 एक्स बफर के साथ अवरुद्ध है, और विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी (1: 10000) जोड़ा जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. केमिलुमिनेसेंस (सब्सट्रेट आवेदन)

  1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बफर 1 में दो बार झिल्ली धो लें.
  2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बफर 3 ( पूरक फ़ाइल 6 देखें) में एक बार धो लें, झिल्ली बफर के सबसे नाली करने के लिए अनुमति देता है, यह लगभग सूखी छोड़ने.
  3. उपयोग करने के लिए तैयार सीएसपीडी जोड़ें (डिसोडियम 3- (4-मेथॉक्सीस्पिरो {1,2-डाइऑक्सेटेन-3,2′- (5′-क्लोरो) ट्राइसाइक्लो [3.3.1.13,7] डेकन} -4-वाईएल) फिनाइल फॉस्फेट , सामग्री की तालिकादेखें), और 5 मिनट के लिए रहने दें, (नम उंगलियों के साथ सीएसपीडी को एक तरफ से दूसरी तरफ समरूप करें)।
  4. झिल्ली को एक पारदर्शी प्लास्टिक बैग (12.5 x 9 सेमी) में रखें जो झिल्ली आयाम को फिट करता है। हवाई बुलबुले को सावधानी से हटा दें, समान रूप से सीएसपीडी वितरित करें, और बैग को गर्मी-सील करें।
  5. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में झिल्ली को इनक्यूबेट करें (यह 30 मिनट तक हो सकता है), और सुनिश्चित करें कि नमूनों के साथ झिल्ली को नीचे की ओर रखा गया है ताकि यह अच्छी तरह से जलमग्न हो। सुनिश्चित करें कि तापमान स्थिर रहता है और झिल्ली पर अच्छी तरह से वितरित होता है।
  6. प्लास्टिक बैग को सुखाएं और पहले से इस्तेमाल की जा रही रेडियोग्राफिक फिल्म पर स्कॉच टेप से इसे ठीक करें। यह एक्सपोज़र प्रक्रिया के दौरान आसान हैंडलिंग की अनुमति देगा।
    नोट: चित्रा 8 केमिलुमिनेसेंस प्रक्रिया के सब्सट्रेट आवेदन को दर्शाता है।

Figure 8
चित्रा 8: केमिलुमिनेसेंस प्रक्रिया के सब्सट्रेट आवेदन। मुक्त एंटीबॉडी हटा दिया जाता है, और सब्सट्रेट सीएसपीडी (1:250) झिल्ली में जोड़ा जाता है। प्रतिक्रिया 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा सक्रिय होती है और एक्स-रे फिल्म में केमिलुमिनेसेंस रिकॉर्ड करने के लिए झिल्ली की व्यवस्था की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

7. केमिलुमिनेसेंस (पहचान)

  1. एक्सपोजर प्रक्रिया करें। डार्करूम में, संबंधित ट्रे में डेवलपर और फिक्सर समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें।
  2. अंधेरे में, ध्यान से एक नई रेडियोग्राफिक फिल्म का सामना करना पड़ तय झिल्ली जगह और यह एक रेडियोग्राफिक कैसेट ( सामग्री की तालिकादेखें) में डालें.
  3. एक्सपोजर का समय पंजीकृत करें। एक्सपोजर का समय 1 मिनट से 30 मिनट या उससे अधिक तक भिन्न हो सकता है। 5 मिनट के साथ शुरू करें और तदनुसार समय समायोजित करें।
  4. 1-3 मिनट के लिए डेवलपर समाधान में एक्स-रे फिल्म को नम करें और नल के पानी (15-45 एस) के साथ धीरे से कुल्ला।
  5. 1-3 मिनट के लिए फिक्सर समाधान में एक्स-रे फिल्म नम और नल के पानी (45 एस) के साथ धीरे कुल्ला.
  6. एक्स-रे फिल्म को हवा में सूखने दें और परख को एक दृश्यमान सफेद लाइटबॉक्स में दस्तावेज करें।
    नोट: एक्स-रे एक्सपोजर समय के दौरान झिल्ली को हिलाने से बचें। पता लगाने की प्रक्रिया चित्रा 9 में दर्शाया गया है.
  7. परिणाम व्याख्या के लिए आगे बढ़ें। उजागर एक्स-रे फिल्म में, उत्सर्जन के साथ डॉट्स नेत्रहीन स्थित हो सकते हैं और जांच के संकरण के साथ डीएनए के टुकड़ों के अनुरूप हो सकते हैं। उत्सर्जित संकेत की तीव्रता ल्यूमिनेसेंस और एक्सपोजर की अवधि पर निर्भर करती है।
    नोट: झिल्ली कमरे के तापमान पर कई महीनों के लिए फिल्टर पेपर के बीच सूखे संग्रहीत किया जा सकता है.

Figure 9
चित्रा 9: केमिलुमिनेसेंस प्रक्रिया का पता लगाना। अंधेरे परिस्थितियों में, झिल्ली एक एक्स-रे कैसेट के अंदर एक एक्स-रे फिल्म के संपर्क में है। इसके बाद, इसे प्रदर्शनी समय के दौरान खड़े होने की अनुमति दी गई, और फिर एक्स-रे फिल्म विकसित और तय की गई। अंत में, इसे हवा में सुखाया गया और व्याख्या की गई। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

8. झिल्ली डी-संकरण प्रक्रिया

  1. आसुत जल के साथ 10 मिनट के लिए झिल्ली दो बार धो लें.
  2. 53 डिग्री सेल्सियस (दो बार) पर 0.4 एम NaOH के साथ 20 मिनट के लिए झिल्ली धो लें।
  3. 2 एक्स एसएसपीई के साथ 10 मिनट के लिए झिल्ली दो बार धो लें।
  4. झिल्ली को कमरे के तापमान पर सूखने दें।
  5. झिल्ली रखें और प्रोटोकॉल के चरण 3.5 पर लौटें।
    नोट: झिल्ली को पूर्व-संकरण बफर में रात भर 4-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। अगले दिन, 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेशन के साथ पुनः आरंभ करें, जिससे पूर्व-संकरण बफर तापमान तक पहुंच सके। फिर, प्रोटोकॉल के चरण 3.5 पर आगे बढ़ें।

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Representative Results

तकनीक की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए, प्रत्येक लेप्टोस्पाइरा सेरोवर की शुद्ध संस्कृतियों से जीनोमिक डीएनए का उपयोग क्लेड-विशिष्ट जांच के साथ किया गया था। झिल्ली प्रत्येक सेरोवर के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया प्रति जीनोमिक डीएनए के 100 एनजी के साथ तैयार किए गए थे, इसके बाद गैर-संबंधित बैक्टीरिया के आठ जीनोमिक डीएनए और तदर्थ लेप्टोस्पाइरा सेरोवर के जीनोमिक डीएनए के चर सांद्रता थे। प्रत्येक परख सकारात्मक, नकारात्मक, और गैर टेम्पलेट नियंत्रण शामिल. इन गैर-संबंधित जीनोमिक डीएनए ने डॉट-ब्लॉट जांच के लिए एक आत्मीयता नहीं दिखाई। झिल्ली वितरण और डॉट-ब्लॉट झिल्ली को पूरक चित्र 2, अनुपूरक चित्र 3, अनुपूरक चित्र 4, अनुपूरक चित्र 5, अनुपूरक चित्र 6, अनुपूरक चित्र 7 में दिखाया गया है। सैप्रोफाइट क्लेड के बारे में, 1059 बीपी के पीसीआर उत्पाद के साथ DB_Saproprobe का उपयोग करके प्राइमरों DB_16एसपैथोरेव औरDB_16 एसपैथोएफडब्ल्यूडी के साथ प्रवर्धित किया जाता है, और 517 बीपी के पीसीआर उत्पादकोप्राइमरों DB_16 एस सैपरेव और DB_16एससैपएफडब्ल्यूडी के साथ लेप्टोस्पाइरा बिफ्लेक्सा सेरोवर पैटोक स्ट्रेन पैटोक I के जीनोमिक डीएनए के साथ प्रवर्धित किया जाता है, सैप्रोफाइट डीएनए (पूरक चित्रा 2 और पूरक चित्रा 3) के 0.05-0.1 एनजी के बीच पता लगाना संभव था। इसी तरह, मध्यवर्ती क्लेड का पता लगाने के लिए, प्राइमरों DB_16एसपैथोरेव औरDB_16 एसपैथोएफडब्ल्यूडी के साथ प्रवर्धित 1059 बीपी के पीसीआर उत्पाद के साथ DB_Interprobe का उपयोग करके, और 299-301 बीपी के पीसीआर उत्पाद को प्राइमरों DB_16साथप्रवर्धित किया गया है लेप्टोस्पाइरा फेनी सेरोवर हर्स्टब्रिज स्ट्रेन बट 6 (अनुपूरक चित्रा 4 और पूरक चित्रा 5) के जीनोमिक डीएनए के साथ एसDB_16 इंटरएफडब्ल्यूडी), मध्यवर्ती डीएनए के लगभग 0.1 एनजी का पता लगाना संभव था। इसी तरह, प्राइमरों DB_16एसपैथोरेव औरDB_16 एसपैथोएफडब्ल्यूडी द्वारा प्रवर्धित 1059 बीपी के पीसीआर उत्पाद के साथ DB_16एसपैथोप्रोब का उपयोग करके रोगजनक क्लैड के लिए, या 479 बीपी के पीसीआर उत्पाद के साथ DBlipL41probe के साथ प्राइमरों द्वारा प्रवर्धित DB_lipL41REV और रोगजनक लेप्टोस्पाइरा सेरोवर से जीनोमिक डीएनए मिश्रण के साथ DB_lipL41FWD, रोगजनक डीएनए (अनुपूरक चित्रा 6 और पूरक चित्रा 7) के 0.3-0.6 एनजी तक डीएनए सांद्रता का पता लगाना संभव था।

तीन समूहों की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किए गए परख प्रत्येक क्लैड के लिए व्यक्तिगत रूप से उपयोग किए जा सकते हैं। हालांकि, मूल्यवान और दुर्लभ नमूनों के मामले में, एक एकल झिल्लीप्राइमरों DB_16 एसपैथोरेव औरDB_16 एसपैथोएफडब्ल्यूडी के साथ तैयार की जा सकती है, जो 1058-1069 बीपी उत्पाद को बढ़ाती है। इस उत्पाद को तब DB_Interprobe, DB_Saproprobe और DB_16एसपैथोप्रोब के साथ व्यक्तिगत रूप से संकरण किया जा सकता है, उनमें से प्रत्येक से पहले डी-संकरण चरण (चरण 8) के साथ। यह दृष्टिकोण एक ही झिल्ली में सभी समूहों की पहचान के लिए अनुमति देता है।

क्षेत्र के पानी के नमूनों में, lipL32 जांच प्रोटोकॉल लागू किया गया था। प्रत्येक पानी के नमूने के डीएनए पीसीआर प्रतिक्रिया प्रति 100 एनजी की एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया था. इसके अतिरिक्त, एक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल नियंत्रण शामिल किया गया था, जिसमें 15 एमएल आसुत जल के नमूने में लेप्टोस्पाइरा जीनोमिक डीएनए के 100 एनजी स्पाइकिंग शामिल थे। नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण भी शामिल थे (चित्रा 10)।

तालिका 4: पानी के नमूने विवरण और गहराई। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: प्रत्येक पानी के नमूने के डॉट-धब्बा परख। (ए) झिल्ली वितरण और (बी) DB_lipL32probe के डॉट-ब्लॉट और प्राइमरों के उत्पाद (262 बीपी) DB_lipL32REV और क्षेत्र के पानी के नमूनों में से DB_lipL32FWD। तालाब 3 की सतह एक सकारात्मक परिणाम दिखाती है, और निष्कर्षण प्रोटोकॉल नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण दोनों में एक तीव्र संकेत होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पानी का नमूना विवरण तालिका 4में दिखाया गया है, और डॉट-ब्लॉट झिल्ली वितरण और छवि चित्रा 9में दिखाया गया है। डॉट ए 7 से पता चलता है कि लेप्टोस्पाइरल डीएनए तालाब 3 की सतह पर मौजूद था। तालाब 3 में मौजूद डीएनए एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए, लेप्टोस्पाइरा सेरोवर के मिश्रण के ज्ञात डीएनए सांद्रता के साथ एक डॉट-ब्लॉट परख और लिपएल 32 जांच (चित्रा 11) का प्रदर्शन किया गया था। झिल्ली जीनोमिक डीएनए प्रत्येक डॉट में 1 एक्स 10-13 एनजी के लिए 100 एनजी से वितरित के साथ तैयार किया गया था. निस्संदेह पता लगाया जा सकता है कि न्यूनतम एकाग्रता लगभग 0.3 एनजी था, जो पानी के नमूनों में 6 x 105 GEq के अनुरूप था।

Figure 11
चित्रा 11: लेप्टोस्पाइरा सेरोवर और लिपएल 32 जांच के मिश्रण के ज्ञात डीएनए सांद्रता के साथ डॉट-ब्लॉट परख। (ए) झिल्ली वितरण और (बी) DB_lipL32probe के डॉट-ब्लॉट और प्राइमरों के उत्पाद (262 बीपी) DB_lipL32REV और रोगजनक लेप्टोस्पाइरा सेरोवर के जीनोमिक डीएनए मिश्रण के कमजोर पड़ने (1: 2) के साथ DB_lipL32FWD। जांच के संकेत को लेप्टोस्पाइरा डीएनए मिश्रण के 3.91 x 10-1 एनजी तक आसानी से पता लगाया जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों इलेक्ट्रोफोरेटिक जुदाई द्वारा कल्पना। लेन 1. आणविक भार मार्कर 100 बीपी डीएनए सीढ़ी। लेन 2. एक टेम्पलेट के रूप में रोगजनक लेप्टोस्पाइरा डीएनए मिश्रण के साथ लिपएल 32 जीन पर आधारित पीसीआर; लेन 3. एक टेम्पलेट के रूप में रोगजनक लेप्टोस्पाइरा डीएनए मिश्रण के साथ lipL41 जीन पर आधारित पीसीआर; लेन 4. टेम्पलेट के रूप में रोगजनक लेप्टोस्पाइरा डीएनए मिश्रण के साथ 16एस आरआरएनए जीन पर आधारित पीसीआर; लेन 5. प्राइमरों के साथ 16एस आरआरएनए जीन पर आधारित पीसीआर DB_16एससैपरेव और DB_16एससैपएफडब्ल्यूडी, और लेप्टोस्पाइरा बिफ्लेक्सा सेरोवर पैटोक स्ट्रेन पैटोक I डीएनए टेम्पलेट के रूप में; लेन 6. प्राइमर DB_16SPathoREV और DB_16SPathoFWD के साथ 16एस आरआरएनए जीन पर आधारित पीसीआर, और टेम्पलेट के रूप में लेप्टोस्पाइरा बिफ्लेक्सा सेरोवर पैटोक स्ट्रेन पैटोक I डीएनए; लेन 7. प्राइमरों DB_16 के साथ 16एस आरआरएनए जीन पर आधारित पीसीआरएस इंटररेवऔर DB_16एसइंटरएफडब्ल्यूडी, और लेप्टोस्पाइरा फेनी, सेरोवर हर्स्टब्रिज तनाव BUT6 डीएनए टेम्पलेट के रूप में; लेन 8. प्राइमरों DB_16 के साथ 16एस आरआरएनए जीन पर आधारित पीसीआरएसपैथोरेव और DB_16एसपैथोएफडब्ल्यूडी, और लेप्टोस्पाइरा फेनी, सेरोवर हर्स्टब्रिज स्ट्रेन बीयूटी 6 डीएनए एक टेम्पलेट के रूप में। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: (ए) झिल्ली वितरण और (बी) DB_Saproprobe के डॉट-ब्लॉट और प्राइमरों के उत्पाद (1059 बीपी)DB_16 एसपैथोरेव और लेप्टोस्पाइरा बिफ्लेक्सा सेरोवर पटोक, पैटोक I के जीनोमिक डीएनए केDB_16 एसपैथोएफडब्ल्यूडी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: (ए) झिल्ली वितरण और (बी) प्राइमरों के उत्पाद (517 बीपी) के साथ DB_Saproprobe का डॉट-ब्लॉट DB_16एससैपरेव और लेप्टोस्पाइरा बिफ्लेक्सा सेरोवर पटोक, पैटोक I के जीनोमिक डीएनए के DB_16एससैपएफडब्ल्यूडी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 4: (ए) झिल्ली वितरण और (बी)प्राइमरोंके उत्पाद (1059 बीपी) के साथ DB_Interprobe का डॉट-ब्लॉट DB_16 एस पैथोरेव और DB_16एसपैथोएफडब्ल्यूडी और लेप्टोस्पाइरा फेनी सेरोवर हर्स्टब्रिज स्ट्रेन बीयूटी 6 के जीनोमिक डीएनए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 5: (ए) झिल्ली वितरण और बी) DB_Interprobe के डॉट-ब्लॉट और प्राइमरों के उत्पाद (299-301 बीपी)DB_16 एसइंटररेव और DB_16एसइंटरएफडब्ल्यूडी लेप्टोस्पाइरा फेनी सेरोवर हर्स्टब्रिज स्ट्रेन बीयूटी 6 के जीनोमिक डीएनए के साथ। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 6: (ए) झिल्ली वितरण और (बी)DB_16 एसपैथोप्रोब के डॉट-ब्लॉट और रोगजनक लेप्टोस्पाइरा सेरोवर के जीनोमिक डीएनए मिश्रण के साथएसपैथोरेव और DB_16एसपैथोएफडब्ल्यूडी DB_16 प्राइमरों के उत्पाद (1059 बीपी)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 7: (ए) झिल्ली वितरण और (बी) प्राइमरों के उत्पाद (479 बीपी) के साथ DB_lipL41probe के डॉट-ब्लॉट DB_lipL41REV और रोगजनक लेप्टोस्पाइरा सेरोवर के जीनोमिक डीएनए मिश्रण के साथ DB_lipL41FWD। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: 16एस राइबोसोमल आरएनए अनुक्रम के आधार पर प्राइमरों और जांच के साथ सैप्रोफाइट लेप्टोस्पाइरा प्रजातियों का संरेखण। प्राइमरों को उनकी पहचान के लिए बोल्ड और काले रंग में हाइलाइट किया जाता है, उनकी दिशा काले तीरों द्वारा इंगित की जाती है। जांच को बोल्ड में इंगित किया गया है और ग्रे में हाइलाइट किया गया है, और इसकी स्थिति को ग्रे लाइन के साथ चिह्नित किया गया है। संरेखित अनुक्रम हल्के भूरे रंग में हाइलाइट किए गए हैं, जबकि गैर-संबंधित अनुक्रम काले और सफेद रंग में हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: 16एस राइबोसोमल आरएनए अनुक्रम के आधार पर प्राइमरों और जांच के साथ मध्यवर्ती लेप्टोस्पाइरा प्रजातियों का संरेखण। प्राइमरों को उनकी पहचान के लिए बोल्ड और काले रंग में हाइलाइट किया जाता है, उनकी दिशा काले तीरों द्वारा इंगित की जाती है। जांच को बोल्ड में इंगित किया गया है और ग्रे में हाइलाइट किया गया है, और इसकी स्थिति को ग्रे लाइन के साथ चिह्नित किया गया है। संरेखित अनुक्रम हल्के भूरे रंग में हैं, जबकि गैर-संबंधित अनुक्रम काले और सफेद रंग में दिखाए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: प्राइमरों के साथ रोगजनक लेप्टोस्पाइरा प्रजातियों का संरेखण और लिपएल 32 जीन अनुक्रम के आधार पर जांच। प्राइमरों को उनकी पहचान के लिए बोल्ड और काले रंग में हाइलाइट किया जाता है, उनकी दिशा काले तीरों द्वारा इंगित की जाती है। जांच को बोल्ड में इंगित किया गया है और ग्रे में हाइलाइट किया गया है, और इसकी स्थिति को ग्रे लाइन के साथ चिह्नित किया गया है। संरेखित अनुक्रम हल्के भूरे रंग में हैं, जबकि गैर-संबंधित अनुक्रम काले और सफेद रंग में दिखाए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: प्राइमरों के साथ रोगजनक लेप्टोस्पाइरा प्रजातियों का संरेखण और लिपएल 41 जीन अनुक्रम के आधार पर जांच। उनकी पहचान के लिए, प्राइमर बोल्ड में होते हैं और काले रंग में हाइलाइट किए जाते हैं, उनकी दिशा काले तीरों द्वारा इंगित की जाती है। जांच को बोल्ड में इंगित किया गया है और गहरे भूरे रंग में हाइलाइट किया गया है, और इसकी स्थिति को ग्रे लाइन के साथ चिह्नित किया गया है। संरेखित अनुक्रम हल्के भूरे रंग में हैं, जबकि गैर-संबंधित अनुक्रम काले और सफेद रंग में हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 5: 16एस राइबोसोमल आरएनए अनुक्रम को लक्षित करने वाले प्राइमरों के साथ लेप्टोस्पाइरा प्रजातियों का संरेखण और सैप्रोफाइट, मध्यवर्ती और रोगजनक प्रजातियों के लिए जांच। उनकी पहचान के लिए, प्राइमरों को बोल्ड में इंगित किया जाता है और काले रंग में हाइलाइट किया जाता है, उनकी दिशा काले तीरों द्वारा चिह्नित होती है। जांच को बोल्ड में इंगित किया जाता है और ग्रे में हाइलाइट किया जाता है, जिसमें उनकी स्थिति ग्रे लाइनों द्वारा दर्शाई जाती है। संरेखित अनुक्रम हल्के भूरे रंग में हैं, और गैर-संबंधित अनुक्रम सफेद और काले रंग में हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 6: डॉट-ब्लॉट परख के लिए बफ़र्स और समाधान। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

डॉट-ब्लॉट तकनीक के महत्वपूर्ण चरणों में शामिल हैं (1) डीएनए स्थिरीकरण, (2) गैर-समरूप डीएनए के साथ झिल्ली पर मुक्त बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करना, (3) एनीलिंग शर्तों के तहत जांच और लक्ष्य टुकड़े के बीच पूरकता, (4) असंकरित जांच को हटाने, और (5) रिपोर्टर अणु41 का पता लगाना।

पीसीआर-डॉट-धब्बा इस तरह के तकनीक संकरित टुकड़ा37 के आकार के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है के रूप में कुछ सीमाओं, यह एक दूसरे या तीसरे जांच के साथ फिर से संकरण से पहले एक एकल झिल्ली के डी-संकरण की आवश्यकता है, और यह काफी समय और अंतिम परिणाम के लिए प्रयास की आवश्यकता है.

इस तकनीक ने अन्य आणविक तकनीकों42,43 और इसके अनुप्रयोगों के साथ स्थिरता दिखाई है। रिवर्स डॉट-ब्लॉट, नैनोगोल्ड डॉट-ब्लॉट21, और डॉट-एलिसा42 को ट्रेपोनेमा44, बोरेलिया बर्गडोरफेरी45, ई कोलाई46, हेलिकोबैक्टर पाइलोरी47, और माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस48,49 जैसे जीवों में विशिष्ट जीन का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया है, जो 16एस आरआरएनए29,43 पर आधारित है, और पौधे के डीएनए या आरएनए का पता लगाने के लिए वायरस41. पता लगाने की सीमा (एलओडी) को सूक्ष्मजीव की सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जिसे इस तकनीक50 द्वारा लगातार और मज़बूती से मापा जा सकता है, एच. पाइलोरी47 के लिए 100 पीजी (5 x 104 बैक्टीरिया) से लेकर नैदानिक नमूनों में बी. बर्गडोरफेरी की एकल कोशिकातक 45, और एक एफजी, जो एक कोशिका से कम है, एम. तपेदिकका 48,49.

इस संयुक्त पद्धति का एक मूल्यवान पहलू एक आदेश द्वारा पता लगाने की सीमा का विस्तार करने की क्षमता है, दो नमूना स्थितियों के कारण झूठे नकारात्मक परिणामों पर काबू पाने के लिए जो असंगत परिणाम पैदा कर सकते हैं: (1) अपर्याप्त डीएनए के साथ नमूने, या (2) नमूना संदूषण, सकारात्मक नमूनों का 100% पता लगाने की अनुमति देता है 25,45,47,48,49. पीसीआर-डॉट-ब्लॉट में उन लोगों की तुलना में प्रवर्धित उत्पादों की कम मात्रा का पता लगाने की क्षमता होती है जिन्हें अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन में पाया जा सकता है, और यह दूसरे प्रवर्धन चरणों के परिणामस्वरूप संदूषण से बचा जाता है, जैसा कि नेस्टेड और अर्ध-नेस्टेड पीसीआर में होता है। कम बैक्टीरियल चार्ज वाले पर्यावरणीय नमूनों के साथ काम करते समय ये फायदे विशेष रूप से महत्वपूर्ण होते हैं, जिसमें असंबंधित स्रोतों से अवरोधक और डीएनए की एक विस्तृत श्रृंखला हो सकती है जो आणविक तकनीकों में हस्तक्षेप कर सकती है।

पिछले काम से पता चलता है कि लेप्टोस्पायर की पहचान डीएनए जांच द्वारा की जा सकती है, जिसमें फोटोबायोटिन 5 पीजी (5 x 10,3 लेप्टोस्पायर)51के एलओडी तक पहुंचता है। डीआईजी-लेबल जांच 0.1-1 पीजी (102 लेप्टोस्पायर) का पता लगाती है, जबकि 32पी-लेबल वाली जांच 1-5 पीजी (750 से 1000 लेप्टोस्पायर)51का पता लगाती है, और बायोटिन-लेबल वाली जांच 5 पीजी (2500 लेप्टोस्पायर)52का पता लगाती है। इसके अलावा, सैप्रोफाइट लेप्टोस्पाइरा के लिए 32पी-लेबल जांच 1.95 एनजी के एलओडी और रोगजनक लेप्टोस्पाइरा के लिए, 3.9 एनजी53 तक पहुंच गई। इस अध्ययन में, तीन समूहों के लिए समान एलओडी स्थापित किए गए थे। रोगजनक प्रजातियों के लिए एलओडी जीनोमिक डीएनए (6-8 x 104 जीईक्यू) (चित्रा 11) का लगभग 0.3 एनजी था, और सैप्रोफाइट और मध्यवर्ती प्रजातियों के लिए, यह 0.1 एनजी (2 x 104 जीईक्यू) तक नीचे था। विशेष रूप से, पिछले शोध प्रयोगात्मक रूप से संक्रमित गोल्डन हैम्स्टर्स से शुद्ध लेप्टोस्पाइरा संस्कृतियों51 और सेरा का उपयोग करके आयोजित किए गए थे, जिसका उद्देश्य रोगजनक लेप्टोस्पाइरा 54,55 का पता लगाना था, और लेप्टोस्पाइरा56 की पहचान और वर्गीकरण के लिए एक उपकरण के रूप में लेबल किए गए 32पी के साथ डीएनए संकरण लागू करना था . ये जांच उच्च विशिष्टता प्रदर्शित करती है और अन्य सूक्ष्मजीवों 19,51,54,55,56,57से गैर-समरूप डीएनए के साथ क्रॉस-संकरण नहीं दिखाती है, और लेप्टोनिमा57 जैसे निकट से संबंधित प्रजातियों के बीच भी अंतर कर सकती है . इसी तरह, इस काम में, गैर-समरूप डीएनए के साथ कोई संकरण नहीं देखा गया था। हालांकि गैर-आइसोटोपिक जांचआइसोटोपिक जांच 58 या अन्य तकनीकों43 के रूप में संवेदनशील नहीं हैं, यह उम्मीद की जा सकती है कि पीसीआर-डॉट-ब्लॉट संयोजन अन्य पीसीआर-आधारित तकनीकों की तुलना में संवेदनशीलता में दस गुना वृद्धि की अनुमति देता है, जैसा कि लीशमैनिया और गोजातीय हर्पीसवायरस 4 (बीएचवी 4) 24,26का पता लगाने में देखा गया है।

दूसरी ओर, लेप्टोस्पाइरा पहचान के लिए डॉट धब्बा परख अधिक बार एंटीबॉडी के साथ नियोजित किया गया है, और हाल ही में मूत्र के नमूनों 59,60,61,62में मनुष्यों और जानवरों के निदान के लिए एक विकल्प के रूप में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ. इन अध्ययनों में, नमूना सीधे पूर्व चरणों के बिना झिल्ली पर संसाधित होता है, और एंटीबॉडी रोगजनन से जुड़े विशिष्ट लेप्टोस्पाइरा सतह प्रोटीन को लक्षित करते हैं। Mab-डॉट-ब्लॉट एलिसा, उदाहरण के लिए, उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता दिखाता है, बैक्टीरियल होमोजेनेट62 के 1 μg जितना कम पता लगाता है। मैब-डॉट-ब्लॉट परख से प्राप्त परिणाम पीसीआर परख के बराबर हो सकते हैं, जिसमें आम तौर पर एलओडी लगभग 103 लेप्टोस्पायर/एमएल मूत्र या 9.3 एनजी लेप्टोस्पाइरा होमोजेनेट63 होता है। पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जा सकता है कि जीनोमिक डीएनए की मात्रा 100 कोशिकाओं (डीएनए के 500 एफजी)61है. इन पिछले अध्ययनों ने संवर्धन प्रक्रियाओं के बिना शुद्ध संस्कृतियों या नैदानिक नमूनों का उपयोग किया और बेहतर निदान की ओर उन्मुख थे। यह देखते हुए कि संक्रमित चूहे मूत्र64 के 107 लेप्टोस्पायर / एमएल के रूप में उत्सर्जित कर सकते हैं, और कुत्ते 102 से 106 लेप्टोस्पायर / मूत्र65 के एमएल के बीच उत्सर्जित कर सकते हैं, जल निकायों के लिए संदूषण के स्रोतों के रूप में कार्य कर सकते हैं, पर्यावरण के नमूनों को लेप्टोस्पाइरल संवर्धन की आवश्यकता होती है। सोख्ता से पहले लक्षित डीएनए के इन विट्रो पीसीआर प्रवर्धन में दस गुना52,55 तक की प्रक्रिया संवेदनशीलता में सुधार की अनुमति देता है। आमतौर पर, एक अंत-बिंदु पीसीआर द्वारा प्रवर्धित उत्पाद को अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन में नहीं देखा जाएगा; बहरहाल, यह डॉट-ब्लॉट में डीआईजी-लेबल जांच के विशिष्ट संकरण के माध्यम से स्पष्ट हो जाता है।

जबकि लेप्टोस्पाइरा और लेप्टोस्पायरोसिस पर बहुत सारे शोध ने रोग निदान पर ध्यान केंद्रित किया है, जल निकायों में उनकी पारिस्थितिकी और उनके भीतर उनके वितरण के बारे में बहुत कम जानकारी है। पीसीआर-डॉट-ब्लॉट तकनीक लेप्टोस्पाइरा और लेप्टोस्पायरोसिस का अध्ययन करने के लिए टूलबॉक्स में जोड़ती है, बड़ी संख्या में नमूनों की जांच करने और परिणामों और व्याख्या में तेजी लाने का लाभ प्रदान करती है। पीसीआर-डॉट-ब्लॉट एक अपेक्षाकृत कम लागत वाली, सरल और गैर-रेडियोधर्मी तकनीक है जो एक ही झिल्ली पर कई जांच को समायोजित कर सकती है। इसके अलावा, यह परिष्कृत उपकरणों और जटिल वर्कफ़्लो की आवश्यकता को समाप्त करता है, जो संसाधन-सीमित सेटिंग्स में चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

इस अध्ययन का प्रभाव विभिन्न गहराई पर पानी के बड़े निकायों के साथ-साथ मिट्टी, स्थिर पानी, मल, रक्त और ऊतकों सहित अन्य पारिस्थितिक निचे और नमूना प्रकारों का अध्ययन करने के लिए इसके भविष्य के अनुप्रयोग में निहित है।

अंत में, यह काम पीसीआर-डॉट-ब्लॉट तकनीक के अनुप्रयोग को प्रदर्शित करता है, जो जीनस लेप्टोस्पाइरा के भीतर तीन समूहों की पहचान के लिए डीएनए जांच के डिगॉक्सिजेनिन लेबलिंग पर आधारित है। यह विधि पहचान प्रक्रिया को एक एकल प्रवर्धन चरण में कम करके सुव्यवस्थित करती है और एक झिल्ली का उपयोग करके तीन एक साथ संकरण या तीन लगातार संकरण की अनुमति देती है। इस तकनीक के साथ प्राप्त पता लगाने की सीमा रेडियोधर्मी जांच53 के साथ हासिल की गई सीमाओं के समान है, जिससे यह प्राकृतिक स्रोतों से पानी के नमूनों में लेप्टोस्पाइरा की पहचान करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन जाता है। नतीजतन, यह तकनीक बढ़ी हुई संवेदनशीलता प्रदान करती है और बैक्टीरियल डीएनए की न्यूनतम मात्रा के साथ नमूनों का मूल्यांकन करते समय सटीक और सुसंगत परिणाम प्रदान करती है। यह जल निकायों में लेप्टोस्पाइरा की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में कार्य करता है और इस सूक्ष्मजीव के संचरण के खिलाफ निवारक उपायों के कार्यान्वयन में सहायता करते हुए व्यापक पर्यावरणीय नमूनों के मूल्यांकन और निगरानी में सहायता कर सकता है।

तकनीक के साथ कठिनाइयों के मामले में, निम्नलिखित समस्या निवारण हाइलाइट्स पर विचार करें: (1) यदि डॉट्स में अनियमित आकार हैं, तो जांचें कि वैक्यूम सिस्टम सुरक्षित रूप से क्रॉसवर्ड बंद है और फिर स्थानांतरण दोहराएं। (2) यदि संकरण ट्यूब रातोंरात प्रक्रिया के दौरान टूट जाती है, जिससे झिल्ली संकरण बफर खो देती है, तो "डी-संकरण प्रक्रिया" अनुभाग देखें और प्रक्रिया को पुनरारंभ करें। (3) यदि कोई बिंदु दिखाई नहीं दे रहे हैं, तो झिल्ली को त्यागें नहीं; संकरण चरणों को दोहराने के लिए "डी-संकरण प्रक्रिया" अनुभाग पर आगे बढ़ें। (3) यदि विकसित एक्स-रे फिल्म पर असमान सफेद क्षेत्रों को देखा जाता है, तो सुनिश्चित करें कि बैग-सीलिंग प्रक्रिया के दौरान कोई हवाई बुलबुले फंस गए हैं। (5) यदि विकसित एक्स-रे फिल्म पर असमान काले क्षेत्र देखे जाते हैं, तो पुष्टि करें कि सीएसपीडी को नम उंगलियों का उपयोग करके अच्छी तरह से वितरित किया गया है। (6) यदि एक्स-रे फिल्म डॉट्स की छाया दिखाती है, तो सुनिश्चित करें कि एक्सपोज़र समय के दौरान फिल्म को स्थानांतरित नहीं किया गया है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग, पशु चिकित्सा और ज़ूटेक्निक्स संकाय, मेक्सिको के राष्ट्रीय स्वायत्त विश्वविद्यालय के लेप्टोस्पाइरा संग्रह के ऋणी हैं। हम संदर्भ लेप्टोस्पाइरा उपभेदों के उदार दान के लिए आभारी हैं; लेप्टोस्पाइरा फेनी सेरोवर हर्स्टब्रिज स्ट्रेन BUT6 और लेप्टोस्पाइरा बिफ्लेक्सा सेरोवर पैटोक I से डॉ. एलेजांद्रो डे ला पेना मोक्टेज़ुमा। हम डॉ. जोस एंटोनियो ओकाम्पो सर्वेंटेस, CIBAC समन्वयक और कर्मियों को उनके रसद समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। ईडीटी मेट्रोपॉलिटन ऑटोनॉमस यूनिवर्सिटी-कैंपस कुआजिमल्पा के स्नातक छात्रों के लिए टर्मिनल प्रोजेक्ट कार्यक्रम के तहत था। हम आंकड़े 1, और 3 से 9 के निर्माण के लिए Biorender.com सॉफ्टवेयर को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit Invitrogen K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) Promega M3001
Whatman filter paper, grade 1, Merk WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m Roche 11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody Roche 11093274910
Medium Base EMJH Difco S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH Difco BD 279510
Blocking Reagent Roche 11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate Merk 11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm Sigma Aldrich D3159
Developer Carestream Carestream Health Inc GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP Roche 11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) Promega H5032
Ficoll 400 Sigma Aldrich F8016
Fixer Carestream Carestream Health Inc GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa Sigma Aldrich L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa Sigma Aldrich L-9150 It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40) Sigma Aldrich PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) Sigma Aldrich 9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich 7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich 7558-79-4
Terminal transferase, recombinant Roche 3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl) Sigma-Aldrich 1185-53-1
SSPE 20X Sigma-Aldrich S2015-1L It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Probes Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer Thermo-Scientific ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm Sigma-Aldrich 1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl Gilson SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen 3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl Axygen T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl Axygen TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot BIORAD 1706545
Portable Hergom Suction Hergom 7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) Hoefer PH90-115V
UV Crosslinker Hoefer UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler Hybaid HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 Fuji

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